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逆转录病毒载体是一种表达型质粒，结构如图所示。图上的“逆转录病毒序 ”可以整合到动物细胞的染色体上，不 断地表达其携带的目的基因，获得大量重 组逆转录病赛。（E、F、H分别为限制酶 E、F、H的酶切位点）。
(1) 逆转录的模板是_____,原料是_____。
(2) 在构建重组质粒时，目的基因插入该质粒，此过程需要的酶是限制酶____和____0
(3) 将重组质粒转人大肠杆菌前用某种离子处理大肠杆菌使之成为_______才能完成转化过程。为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加_______的培养基进行培养。
(4) 获取大量重组质粒后,可培育转基因小鼠，将重组质粒转入导人小鼠原核期受精卵的方法是_______。若目的基因进人细胞后插入在一条染色体DNA上，那么获得转基因纯合子小鼠的方法是______________。
（四种）脱氧核苷酸
(3)感受态细胞
(4)显微注射（法）
转基因小鼠间相互交配（或杂交）
试题分析：（1）逆转录是以RNA为模板合成DNA的过程，所需不要的模板为RNA，原料为四种脱氧核苷酸。（2）用到的限制酶不能破坏标记基因（抗生素A抗性基因），且应该整合到“逆转录病毒序列”上。（3）抗生...
考点分析：
考点1：基因工程、生物技术的安全性和伦理问题
考点2：基因工程
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回答下列有关酵母菌的问题：
(1) 在葡萄酒的自然发酵过程中，酵母菌的来源是_______发酵温度一般控制在_____。在缺氧、_______的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物受到抑制。为了提高果酒品质，可利用__法或_
法对菌种进行纯化，然后将纯净的酵母茵菌种直接加入果汁。
(2) 固定酵母细胞时要将干酵母放入_______中活化，并将溶化好的_______溶液冷却至室温，加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，再转移至注射器中。以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶
液滴加到 配置好的_______溶液中，观察凝胶珠的形成。
在一个农田生态系统中生长着大豆、杂草和田鼠。杂草中的菟丝子通过蔓状 茎扎入大豆茎中吸收营养，而后菟丝子的根退化、叶子黄化失去光合作用的能力。 回答下列问题：
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某植物的高茎（B)对矮茎（b)为显性，花粉粒长形（D)对圆形（d)为 显性，花粉粒非糯性（E)对花粉粒糯性（e)为显性，非糯性花粉遇碘液变蓝色， 糯性花粉遇碘液呈棕色。现有品种甲（BBDDee)、乙（bbDDEE)、丙（BBddEE) 和丁（bbddee),进行了如下两组实验：
(1)请据表回答问题：(1) 由组合一可知，基因B/b和基因D/d位于_______ (同一、不同）对同源染色体上。利用F1自交，_ (能、不能）验证基因的自由组合定律。
(2) 由组合二可知，基因E/e和基因____位于不同对同源染色体上。利用F1自交所每F2中，杂合子占& 。
(3) 利用花粉鉴定法（检测F1花粉性状）验证基因的自由组合定律，可选用的亲 本组合有_______。
下图表示下丘脑与垂体的两种功能联系 方式：一种是体液联系，构成下丘脑一腺垂体系 统，一种是神经联系，构成下丘脑一神经垂体系 统。（A、B表示垂体的两部分，C、D表示联系方 式），据图回答相关问题：
(1) 腺垂体和神经垂体分别对应图中_______
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下图T0-T1表示的是适宜条件下生长的小球藻叶绿体中某两种化合物（[H]、ADP、C3或C5)的
含量，T1-T3则表示改变其生长条件后两种化合物的含量变化。回答问题：
(1) T0-T1段，为各种生命活动供能最多的结构是_______
(2) 若T1时刻降低了培养液中NaHCO3的浓度，则物质A、B分别指的是_______，物质B浓度升高的原因是______降低了光照强度，则物质A、B分别指的是_______，物质B浓度升高的原因是_____________。
题型：综合题
难度：中等
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满分5 学习网 . All Rights Reserved.逆转录病毒载体是一种表达型质粒，结构如图所示。图上的“逆转录病毒序列 ”可以整合到动物细胞的染色体上，不断地表达其携带的目的基因，获得大量重组逆转录病毒。（E、F、H分别为限制酶 E、F、H的酶切位点）。（1）逆转录的模板是
。（2）在构建重组质粒时，目的基因插入该质粒，此过程需要的酶是限制酶
0（3）将重组质粒转人大肠杆菌前用某种离子处理大肠杆菌使之成为
才能完成转化过程。为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加
的培养基进行培养。（4）获取大量重组质粒后,可培育转基因小鼠，将重组质粒导入小鼠受精卵的方法是
。若目的基因进人细胞后插入在一条染色体DNA上，那么获得转基因纯合子小鼠的方法是
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逆转录病毒载体是一种表达型质粒，结构如图所示。图上的“逆转录病毒序列 ”可以整合到动物细胞的染色体上，不断地表达其携带的目的基因，获得大量重组逆转录病毒。（E、F、H分别为限制酶 E、F、H的酶切位点）。（1）逆转录的模板是
。（2）在构建重组质粒时，目的基因插入该质粒，此过程需要的酶是限制酶
0（3）将重组质粒转人大肠杆菌前用某种离子处理大肠杆菌使之成为
才能完成转化过程。为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加
的培养基进行培养。（4）获取大量重组质粒后,可培育转基因小鼠，将重组质粒导入小鼠受精卵的方法是
。若目的基因进人细胞后插入在一条染色体DNA上，那么获得转基因纯合子小鼠的方法是
逆转录病毒载体是一种表达型质粒，结构如图所示。图上的“逆转录病毒序列 ”可以整合到动物细胞的染色体上，不断地表达其携带的目的基因，获得大量重组逆转录病毒。（E、F、H分别为限制酶 E、F、H的酶切位点）。（1）逆转录的模板是
。（2）在构建重组质粒时，目的基因插入该质粒，此过程需要的酶是限制酶
0（3）将重组质粒转人大肠杆菌前用某种离子处理大肠杆菌使之成为
才能完成转化过程。为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加
的培养基进行培养。（4）获取大量重组质粒后,可培育转基因小鼠，将重组质粒导入小鼠受精卵的方法是
。若目的基因进人细胞后插入在一条染色体DNA上，那么获得转基因纯合子小鼠的方法是
科目:最佳答案见解析解析
据图分析，基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心，基因工程载体的条件是能在受体细胞中保存并大量复制、有一至多了限制性内切酶切点和有特殊的遗传标记基因，便于进行筛选。逆转录酶序列中有限制酶F的切割位点，目的基因与运载体结合，在粘性末端碱基互补配对，需要DNA连接酶作用于磷酸二酯键，形成重组DNA分子；该质粒上有具有的遗传标记基因是抗生素A抗性基因，可以用加有抗生素A的选择培养基进行筛选；目的基因进人细胞后插入在一条染色体DNA上，动物细胞可以让转基因雌雄小鼠间相互交配，逐代筛选。（1）逆转录是以RNA为模板合成DNA的过程，所需要的模板为RNA，原料为四种脱氧核苷酸。（2）基因工程需要工具酶是限制酶和DNA连接酶；用到的限制酶不能破坏标记基因（抗生素A抗性基因），且应该整合到“逆转录病毒序列”上（3）抗生素A抗性基因为标记基因，用来帮助筛选目的基因。（4）用显微注射技术将重组质粒溶液导人受精卵；如A为重组逆转录病毒，还可采取感染方法。目的基因进人细胞后插入在一条染色体DNA上，对应的同源染色体上无对应的等位基因；让转基因小鼠相互交配，就能获得转基因纯合子小鼠。
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你可能喜欢伪狂犬病毒表达载体的研究进展
导语：伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的多种以动物发热、奇痒及中枢神经障碍为主要症状的一种急性传染病。猪是PRV的主要宿主，成年猪一般为隐性感染，但终身带毒和排毒，可致妊娠母猪流产、死产或产木乃伊胎。该病最早于1813年在美国牛群中发现，由于临床表现与狂犬病类似，故称伪狂犬病。1902年Aujeszky证明该病病原为病毒，因而该病亦被称为奥耶斯基病。因其具有流行快，传播途径多，病死率高的特点，现在已成为对全球养猪业危害最大的传染病之一。每年给养猪业造成了巨大的经济损失，被世界动物卫生组织列为二类动物传染病。目前在生产养殖上常使用伪狂犬常规疫苗来预防本病发生，但常规疫苗在免疫时常出现毒力返强、散毒、免疫效率较低、过敏反应、用量较大等弊端。近年来，随着分子生物学技术的发展，关于伪狂犬病病毒的分子生物学研究取得了很大进展，若将外源基因插入到伪狂犬病病毒基因组中构建出重组病毒，不仅保持了原病毒良好的抗原性，且其毒力不返强，易与野毒区别。利用伪狂犬病病毒作为载体同目的基因一起在动物体内表达，既安全又可达到一针多防的效果，对多种动物疫病的防控具有重大意义。
PRV基因组的结构
猪伪狂犬病毒(PRV)属于疱疹病毒科&-病毒亚科的猪疱疹病毒I型。病毒基因组为线状双链DNA，长度约为150 kb，C+G含量约为74％，由长独特区(UL)和短独特区(US)，以及US两侧的重复序列(TRS)与内部重复序列(IRS)所组成。US和UL区段，含有至少70个基因，可编码70-100种蛋白质，成熟的病毒粒子只含有约50种蛋白质。其中在US区段的gD、gE、gG、gI、蛋白激酶基因、1lK和28K 8种蛋白基因已被鉴定；在UL区段有58种基因已经被鉴定，包括gB(gⅡ)、gC(gⅢ)、gH、gK、gL、gM、gN、碱性核酸酶(AN)、核糖核苷还原酶(RR)、DNA多聚酶(POL)、136 ku DNA结合蛋白质(DBP)、主要衣壳蛋白(MCP)和早期蛋白0(EP0)等基因。这些基因可编码结构蛋白、转录调节因子、毒力蛋白、酶类以及与病毒DNA复制、病毒释放有关的蛋白。在这些已经鉴定的伪狂犬病病毒基因中，病毒在细胞中增殖的非必需基因超过一半。另外，还有些已知的毒力基因，如gD、gE、TK等缺失突变之后能显著降低PRV的毒力，这部分DNA序列或基因可以通过缺失处理并被外源DNA置换，而仍使病毒正常生长，成为PRV作为外源基因表达系统的基础。
伪狂犬病毒载体的优势
2.1 &安全性好
PRV不感染人，现有的活疫苗株Banha-K61或&783&等已在世界范围内应用了几十年，安全有效，一些国家还通过其消灭和根除了伪狂犬病。因此以PRV疫苗株为载体，在其基因组非必需区上插入外源基因获得的重组病毒在安全性上值得肯定。
2.2 &外源基因容量大
目前在PRV长达143Kb的基因组中，大约有一半基因被认为是非必需的。其中有些基因与病毒毒力有关，如gI、gE、gM、TK、PK、gC和dUTPase等。这些基因的缺失或失活会不同程度地降低病毒的毒力，便于在多个非生长必需区内先后或同时插入和表达数种外源基因而不显著影响其生长繁殖，重组出具有各种应用途径的载体。
2.3 &生产工艺简单，原材料来源方便
PRV疫苗以接种无特定病原体（SPF）鸡胚成纤维细胞生产，目前包括我国在内的大部分疫苗生产国都已掌握了SPF鸡繁殖与生产技术，原材料来源有充足的保障。因而利用PRV为载体表达其他外源基因生产重组疫苗不需考虑病原生产工艺和材料来源方面的难题。
2.4 &生产成本低
由于PRV免疫原性好，5aTCID50的毒量就足以抵抗PRV强毒的攻击，而其病毒滴度往往高于105TCID，大大降低了生产成本，也减少了过多外源物质对机体的刺激。
2.5 &宿主范围广
牛、山羊、绵羊、猪、猫、狗等家畜和经济动物(如狐和貂)以及鹿等多种野生动物都可感染PRV，使对伪狂犬病毒载体的研究能适用于多种动物，研究价值高。
重组伪狂犬病毒的构建
3.1 &构建原理
重组伪狂犬病毒的构建大致分两部分进行：第一步是重组质粒的构建。所选质粒应含有启动子，并且要在其下游接表达的外源基因，有时要插入有启动子标记的基因如LacZ等以方便筛选，它们的两侧应是伪狂犬病毒特异的DNA同源序列；第二步是将重组质粒导入伪狂犬病毒感染的细胞中，使伪狂犬病毒DNA与重组质粒中的同源序列在细胞内发生同源重组，从而将外源基因装到伪狂犬病毒基因组的特定部位，构建出重组病毒。
3.2 &转移载体的构建
在构建重组伪狂犬病病毒的研究过程中，多种转移载体都可用来作为构建重组病毒的工具，业界目前已有乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、狂犬病毒、猪蓝耳病毒等相关基因克隆到通用载体上成功构建转移载体的报道。克隆转移载体没有优劣之分，而是以能否正确地达到构建的目的作为选择标准；但为了使构建及鉴定过程顺利进行，有时可能需要对某些载体进行特定的优化改造。
3.3 &伪狂犬基因缺失突变株的制备
在已有的研究报道中，多数学者采取了缺失gE、gI、TK基因中的一个或多个，也有部分研究对gG、gH进行了缺失突变。试验结果均表明，缺失这些病毒复制非必需的基因，不仅会使病毒毒力大大降低，还不会影响病毒的免疫原性和增殖程序，这使得用PRV基因缺失突变株研制活载体疫苗具有可行性。缺失其他基因是否会有同样的作用、基因缺失与插入是否会影响病毒的增殖及免疫原性等也值得进一步探讨。
3.4 &转染方法
一般采用磷酸钙法和脂质体法进行转染。磷酸钙法可广泛用于转染许多不同类型的细胞，不但适用于短暂表达，也可生成稳定的转化产物。但对转染过程要求较严格，整个转染过程中都应无菌操作，确保形成尽可能细小的沉淀物，在试验中使用的每种试剂都必须小心校准。由于磷酸钙法要求很严格，而脂质体法相对来说更简单，所以用脂质体法相对较普遍。
脂质体法具有操作简便，转化效率高的特点，可以用于瞬时转染，也可以用在永久表达系的建立，对细胞类型的运用面广，对转染的核酸类型和分子质量有很高的包容性，细胞毒性小，也可以用于体内的基因转染。因此脂质体转染法得到了越来越广泛的应用。但转染温度、时间、DNA与脂质体的比率等对转染均有影响，其中DNA与脂质体的比率是关键。
3.5 &筛选方法
目前基因重组研究中常用&-半乳糖苷酶基因(LacZ)和绿色荧光蛋白基因(GFP)作为报告基因对重组病毒进行筛选转化。运用插入报告基因的方法，将LacZ基因或者抗生素基因等与外源基因同时导入伪狂犬病毒基因组中，通过在培养液中加入Xgal、G418等试剂，筛选出重组病毒。
报告基因的应用使得重组子的筛选非常方便。GFP既对细胞没有损害，且直观易用，与其他标记物相比具有更高的灵敏度和分辨率。而LacZ常被用于转化菌株的筛选。此两种报告基因，均有方便直观的特点，目前在伪狂犬病病毒活载体疫苗的研究中常被用到。
3.6 & 外源基因的表达调控结构
目前，构建重组伪狂犬病毒所选用的主要是gG、gE启动子，其结构独特且活性较强，另外还有gD、CMV。一般说来，启动子序列距外源基因起始密码子越近时表达效果越好。
3.7 &构建重组病毒注意事项
复制非必需区TK、gG、gE基因是目前应用较多的同源序列。再者，选用的亲本病毒株最好是目前常规使用的疫苗株，从而才能够不引起宿主发病；再就是考虑其亲本株的宿主特异性，以对其他动物不构成威胁为前提。最后还要考虑到它所诱导的保护性免疫应答的类型，是全身性免疫应答还是局部的黏膜免疫应答，以便构建对应类型的重组载体，研制适用的重组疫苗。
国内外伪狂犬病毒表达载体的研究进展
自1984年首次报道可以将HSV-1作为表达外源基因的载体以来，疱疹病毒作为载体得到了深入研究和广泛应用。PRV的基因结构和功能与单纯疱疹病毒的很相似，这就为PRV在载体方面研究提供了模型。Keeler C L等最早用PRV作为载体表达了g-&-半乳糖苷融合蛋白。Thomsen D R等在PRV gG基因的启动子下游插入人组织血纤维蛋白溶酶原激活物(tPA)编码的cDNA，并用免疫沉淀分析法和细胞培养中酶活性检测出了表达的tPA。自此以PRV作为表达载体的研究就拉开了序幕。
郭万柱等首次构建了PRV Fa株TK基因缺失株,PRV Fa gI-/gp63-基因缺株,PRV Fa gI-/gp63-/LacZ基因缺失株,还构建了PRV TK-和PRV gp63-/LacZ转移载体，又将构建的gP631acZ转移载体质粒与PRV Fa DNA经磷酸钙转染，在MDBK细胞内同源重组获得PRV Fa gE-/gI-/TK-/LacZ三基因缺失疫苗株(PRV-SA215)，PRV-SA215是我国首次成功研制出的Fa-/gI-/TK-/LacZ三基因缺失疫苗株，标志我国在基因工程疫苗研制的领域上取得了重大突破。
方六荣等对含伪狂犬病毒(PRV)鄂A株gG全基因，PK、gD基因部分编码序列的质粒pUSK进行改造，消除了其中的EcoR1位点，将通过PCR扩增的增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)融合到gG启动子下游，构建了由gG启动子控制EGFP表达的PRV转移载体pgG-/EGFP+，该转移载体单独转染或同PRV基因组DNA共转染IBRS-2细胞，结果单独转染时EGFP不能表达；共转染时，6 h就可在荧光显微镜下观察到明显的荧光。
Liu Z等将LacZ基因表达试剂盒插入到PRV Ea株基因组的gE区，通过蓝斑筛选和纯化，得到了TK-/gE-/LacZ+PRV。利用LacZ基因处的EcoRI酶切位点来消化PRV Ea TK-/gE-/LacZ+ 基因组DNA，并与质粒pFBBS在PK-15细胞上进行共转染。经过蚀斑纯化得到了TK-/gE-／gD-PRV。通过小鼠试验表明，此TK-/gE-/gD-PRV的毒力明显减弱。
钱平等将来自质粒pFSV40的300 bp BamHI／PstI片段[其中含有SV40 poly(A)和部分多克隆位点]插入到质粒pUSK相应的酶切位点中，获得重组质粒pUSKSV40，该重组质粒中gG基因5&端编码区缺失了428bp。将来自质粒pcDNA3.l(+)的946bp Bgl II EcoRI片段(其中含CMV启动子及部分多克隆位点)插入到质粒pUSKSV40的BamHI EcoRI位点，构建了通用载体pPRVCMV-uni，其中含有CMV启动子、SV40 poly(A)以及NheI、Pmel、BamHI、BstXI、EcoRI、StuI、XbaI等7个单一克隆位点。将eGFP基因插入到该通用载体的BamHI和EcoRI之间，用所获得的转移载体与TK-/gG-/Lacz+ PRV基因组共转染PK-15细胞，经检测eGFP基因在重组伪狂犬病病毒中获得表达，从而证实了此通用载体构建的可行性。
黄伟坚等以伪狂犬病病毒SH株细胞培养物为模板，用PCR方法扩增蛋白激酶(PK)基因部分片段，克隆到pCDNA3中，序列测定显示所扩增的PK基因片段长907 bp，与PRV NIA-3株的核苷酸同源性为99.6%。把PK基因克隆到pUC19上，利用PK基因中间的SalI酶切位点，插入带有绿色荧光蛋白(EGFP)的基因表达盒，构成了含EGFP的转移载体，为PK基因的功能和构建PK缺失株的进一步研究提供了参考。
胡涛等参考GenBank收录的伪狂犬病病毒gD基因的序列设计了一对引物，对PRV Min-A株进行了PCR扩增，扩增产物克隆于pGEM-T Easy载体。对重组质粒PGTE-gD 进行限制性内切酶分析和基因测序，证实了克隆片段的可靠性。测序结果表明目的片段包含一个1abp的开放性阅读框(ORF)，编码400个氨基酸组成的多肽。将gD基因亚克隆至真核表达载体pcDVA3.1-的CMV启动子下游，构建了真核表达质粒pcDNA-gD，为下一步基因免疫奠定了基础。
Xu G等构建了表达乙型脑炎病毒NS1基因的重组PRV 株TK-/gG-/NS1+。经检测，重组病毒能表达具有生物活性的NS1蛋白,有望作为猪乙型脑炎和伪狂犬病双价基因工程疫苗。
吕素芳等根据伪狂犬病病毒SA株的gI和gE基因序列，设计两对引物，缺失掉gE基因5&端738bp，在克隆测序的基础上，采用酶切方法构建了含部分gE基因的转移载体pBgIE，同时将pBLYFP载体上含CMV启动子、多克隆位点、黄色荧光蛋白(YFP)基因和poly A尾巴的表达盒双酶切后插入到缺失位置，构建出转移载体，命名为pBgIE-YFP。 
徐志文等将包含有完整阅读框架的猪细小病毒VP 2基因(;bp)和猪圆环病毒2型ORF 2基因(750 bp)插入到真核表达载体pPI-2．EGFP中，构建出重组质粒pPI-2．EGFP．VP2． ORF2。采用脂质体介导法将重组质粒的DNA和PRV SA2l5株的DNA共转染Vero细胞，转染后20 h出现带荧光的空斑，挑斑纯化后繁殖，并收获病毒液后通过PCR和免疫荧光试验证实，成功构建了重组病毒，将其命名为PRV SA215(D1)株。
伪狂犬病毒虽然在过去的十几年时间里依靠缺失疫苗的应用得到有效的控制，但是近年来伪狂犬在各个地区时常有所发生。所以当前对伪狂犬病毒侵染机体突破疫苗产生免疫防护的机制的研究仍然需要深入。随着对伪狂犬病毒研究的逐步深入，其作为重组表达载体的类型也越来越丰富。因伪狂犬病毒具备外源基因容量大、安全性好、免疫期长、宿主范围广、低成本、人类对伪狂犬病病毒没有易感性等特点，可以用于制备二价或多价基因工程疫苗，这样的疫苗可诱导产生的免疫比较广泛，包括体液免疫和细胞免疫、甚至黏膜免疫，可以避免重组亚单位疫苗的很多缺点。由于伪狂犬载体可以同时插入多个外源基因，若能成功插入外源抗原基因且保持载体稳定，就有望达到一针防治多病的目的，进而作为未来疫苗研制与开发的热点和主要方向之一。此外，PRV表达载体还将会在基因表达，基因投递，基因治疗方面具有广泛的应用前景。不可否认，利用伪狂犬载体研制多价基因工程疫苗还需要解决一系列安全性方面的问题，且要与病原特性、发病机理、免疫保护机制及病毒感染的流行病学特点相兼顾，但相信经过进一步的研究，以伪狂犬病病毒为载体研制出的新型疫苗，将会为动物疫病的防控提供强有力的技术支撑。
本文选自《猪业科学》2016年第2期&&猪群保健&栏目中P102-104
(责任编辑：许春霞)
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【原创】表达载体的选择及构建方法
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这个帖子发布于2年零27天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
表达载体的构建方法及步骤
一、载体的选择及如何阅读质粒图谱
目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：
（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而
真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+
（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段
（4） P/E 启动子/增强子
（5）Terms 终止信号
（6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用
选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目
的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：
【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如&10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：
（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载
（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10个以上的拷贝，而严谨型质粒&10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；
（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。
如何阅读质粒图谱
第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）
第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使 G418（长那霉素衍生物）失活
（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些酶切位点以外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb 的外源 DNA 片段。一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
第六步：启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号
（1）启动子－促进 DNA 转录的 DNA 序列，这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码序列的上游，是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
（2）增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。
（3）核糖体结合位点/起始密码/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是 AUG（起始密码）和 SD 序列。
（4）转录终止序列（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA的保守序列，此位点 down－stream 有一段 GT 或 T 富丰区，这2部分共同构成 poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down－stream 有一段GT 或 T 富丰区，这2部分共同构成 poly（A）加尾信号。
质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条 DNA 链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上 .根据表达宿主不同，构建时所选择的载体也会不同。
二、目的基因的获得
一般来说，目的基因的获得有三种途径：
调取基因：根据目的基因的序列，设计引物从含有目的基因的cDNA中通过PCR的方法调取目的基因，链接到克隆载体挑取单克隆进行测序，以获得想要的基因片段，这种方法相对成本较低，但是调取到的基因往往含有突变，还有不同基因的表达丰度不同，转录本比较复杂，或是基因片段很长，这些情况都很难调取到目的基因。
全基因合成：根据目的基因的DNA序列，直接设计合成目的基因。此方法准确性高，相对成本会高一些，个人操作比较困难，需要专业的合成公司完成。优点是可以合成难调取及人工改造的任何基因序列，同时可以进行密码子优化，提高目的基因在宿主内的表达量。
三、克隆构建
目前，克隆构建的方法多种多样，除了应用广泛的酶切链接以外，现在还有很多不依赖酶切位点的克隆构建方式。下面具体说一下双酶切方法构建载体的步骤。
载体pCDNA3.1
大肠杆菌菌株DH5α
限制性内切酶
质粒DNA小,大量抽提试剂盒
凝胶回收试剂盒
DNA ladder
Fermentas （2）X基因慢病毒载体的构建X基因基因由Transheep全基因合成，构建于载体PUC57中。PUC57-X基因 EcoRI/BamHI酶切结果：
酶切完成后进行胶回收2. 载体用pCDNA3.1双酶切，酶切体系如下。20ul酶切体系
37度3小时4ul
pCDNA3.1载体（500 ng/ul）1ul
10×buffer 12 ul
H2O酶切完成后胶回收（见附录）
处理好的目的片段与载体连接反应体系：6ul
PCR 酶切回收片段（约50ng/ul）1ul
酶切好的载体（约50ng/ul）2ul
ligase buffer1ul
T4ligase10ul
H2O以上连接液在16℃过夜。
转化 (感受态细胞: DH5a),具体步骤见附录转化部分。抗性: A 37℃，培养过夜
转化后X基因分别平板挑菌, 37℃ 250转/分钟摇菌14小时，PCR鉴定后，将阳性菌液送上海权阳生物技术有限公司测序。X基因慢病毒载体单克隆菌落PCR鉴定（使用载体通用引物,PCR条带大小应比实际大200bp左右）：
不知道邀请谁？试试他们
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( ^_^ )不错嘛~学习了~感谢楼主分享~~赞一个！
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不错,挺详细的,谢谢楼主分享啦...
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我做了很多次都没有成功，可能方法不对，学习完再去做一次试试，谢谢美女楼主！
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权阳生物基因合成ORF区，免费亚克隆，算下来不要几个钱，所以的事情都省了
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貌似应该配图的楼主有配图的版本吗？
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非常好！很有用！
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怎么没有图？？载体构建图最重要？！
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原来真没有图……我还以为是我网络问题。对！我也是想看图。刚进门菜鸟一只，急需海量知识。
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谢谢!对我很有帮助
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比较详细，赞一个
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谢谢楼主分享
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您好，请问有没有载体pCDNA3.1转染大肠杆菌菌株DH5α的实验方案，实验没人教，只能自己摸索，还望赐教，谢谢
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