禽流感DNA疫苗双表达质粒的构建及其表达产物在BALB/c小鼠中的组织分布--《中国农业科学院》2016年硕士论文
禽流感DNA疫苗双表达质粒的构建及其表达产物在BALB/c小鼠中的组织分布
【摘要】：禽流感(Avian influenza)是由A型禽流感病毒(AIV)引起的烈性传染病,不仅对养禽业造成严重的经济损失,还危害人类的健康。接种疫苗是降低AIV发病率和死亡率最有效措施之一。基因工程疫苗技术在过去的20年之内有较大的发展,应用基因工程技术开发的DNA疫苗成本低,免疫效果好,易于生产和保存,是防控AIV的一种新型有效的途径。表达H5亚型AIV A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GS/GD/1/96(H5N1)]HA基因的DNA疫苗pCAGGoptiHA5免疫效果良好,正在进行复核检验。本研究基于DNA疫苗质粒pCAGGSoptiHA5,研究构建DNA双价疫苗的可能性,并探索DNA疫苗的表达产物在动物体内的分布,为DNA疫苗的应用与开发提供有效的理论与数据支撑。本研究首先以增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因作为报告基因,利用双启动子启动、内部核糖体进入位点(IRES)介导以及蛋白Linker连接的3种方法插入到DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5中,构建出双启动子表达质粒pHA5-eGFP、IRES介导的表达质粒pHIE以及融合表达质粒pH6E3种双价表达质粒。利用脂质体介导将这3种质粒转染293T细胞,通过间接免疫荧光(Immunofluorescence assay,IFA)和western blot方法检测瞬时表达的HA蛋白和eGFP。结果显示,成功构建出了3种双价表达质粒,间接免疫荧光和western blot检测表明3种表达质粒均可正确表达HA蛋白和eGFP;pH5-eGFP和pHIE分别表达出两个独立的目的蛋白,而且互相不影响各自的表达和细胞定位;pH6E则表达出一个双价的融合蛋白,由于HA蛋白具有膜定位信号,所以融合蛋白主要在细胞膜上表达。结果表明,双启动子表达质粒和融合蛋白双价表达质粒适用于构建禽流感病毒(AIV)以及其他相关病原的双价DNA疫苗。为直观观察DNA质粒免疫后在组织中的分布,在以上研究基础上,我们重新构建了以荧光素酶(Luciferase)为报告基因的融合表达质粒pH6L。利用脂质体介导将质粒转染293T细胞,IFA和western blot鉴定质粒在细胞内的表达。将100μg重组质粒pH6L以及表达荧光素酶的质粒pLuc分别通过肌肉接种或电转导接种的方法免疫BALB/c小鼠,于免疫后的不同时间点取小鼠腹腔注射D-荧光素(D-Luciferin)底物,利用动物活体成像系统观察DNA质粒在小鼠体内的表达情况;同时取不同时间点的不同组织用福尔马林固定,石蜡切片后进行免疫组化分析(Immunohistochemistry,IHC),并且采集血清进行HI抗体测定。结果显示,成功构建了高效表达HA蛋白和Luciferase的重组质粒,活体成像结果发现,进行电转导处理的免疫组小鼠免疫后3 h于注射部位可见明显的发光,肌肉接种的小鼠于免疫后1周在注射部位可见发光,免疫的小鼠均于免疫后6周发光减弱直至8周时消失;IHC发现,小鼠脾脏中有DNA疫苗表达产物分布;HI试验发现,电转导接种的小鼠于免疫后1周即可检测到HI抗体,肌肉接种的小鼠于免疫后3周也可检测到HI抗体。本研究结果表明,利用双启动子和融合蛋白双价表达质粒构建双价DNA疫苗是可行的,并可在动物体内高效表达,免疫后进行电转导处理可以缩短免疫反应周期,可以大幅度提高免疫效率。本研究构建的双价表达质粒有望可以成为构建双价流感DNA疫苗的基础质粒,为开发高效的抗AIV DNA疫苗提供重要的理论基础,但双价禽流感DNA疫苗的免疫保护水平需要进一步的研究。
【学位授予单位】：中国农业科学院【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2016【分类号】：S855.3
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400-819-9993华北地区：华东地区：华中地区：
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pECMV-3×FLAG-Nrf2-m小鼠基因哺乳表达质粒
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CMV promoter
pUC ori，F1 ori，SV40 ori
bGH poly(A) signal
氨苄青霉素Amp
新霉素Neo/G418
大肠杆菌Stbl3
37℃，有氧，LB
哺乳细胞293T
& & & & & pECMV-3&FLAG-Nrf2-m是一个哺乳细胞过表达质粒，CMV启动子驱动3&FLAG标签和Nrf2小鼠源基因融合表达。本质粒由武汉淼灵生物科技有限公司设计构建并共享至淼灵质粒平台。
LOCUS & & & Exported & & & & & & & &7247 bp ds-DNA & & circular SYN 30-OCT-2017
DEFINITION &synthetic circular DNA
SOURCE & & &synthetic DNA construct
& ORGANISM &synthetic DNA construct
REFERENCE & 1 &(bases 1 to 7247)
& & & & & & http://www.miaolingbio.com
FEATURES & & & & & & Location/Qualifiers
& & &source & & & & &1..7247
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& & & & & & & & & & &promoter&
& & &promoter & & & &863..881
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& & & & & & & & & & &/label=3xFLAG
& & & & & & & & & & &/translation=&DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK&
& & &CDS & & & & & &
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& & & & & & & & & & &YELEKQKKLEKERQEQLQKEQEKAFFAQFQLDEETGEFLPIQPAQHIQTDTSGSASYSQ
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& & & & & & & & & & &ELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRIDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYS
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