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CCK-8实验步骤及原理
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CCK-8实验步骤及原理
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【求助】CCK8的步骤与MTT有哪些不同啊？
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这个帖子发布于6年零224天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请教下CCK8的具体步骤！！多谢！！
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简单比较一下MTT与CCK-8MTT：与活细胞线粒体内酶起反应，生成紫色结晶物质，紫色结晶物质不溶于水显色时需要加入DMSO或者10%（m/v）SDS裂解细胞，DMSO加入后震摇即可读数，10%SDS需要过夜后方可读数。另外药典上也有加入酸化异丙醇读数的，类似DMSO操作。可以比较准确的反应细胞数。CCK-8原理类似MTT，但操作比MTT简单，且生成的结晶物质可溶于水，可以直接读数。根据说明书上介绍，加入CCK-8后的细胞液仍可以继续培养细胞，对细胞毒性较小，这也是与MTT区别较大的地方。至于具体步骤，如果做过MTT就没有问题。加入显色液--》孵育--》读数CCK8 的资料在网上有许多，请多查找一下
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十分感谢！！！
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正好要做 谢谢
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lianwi 简单比较一下MTT与CCK-8MTT：与活细胞线粒体内酶起反应，生成紫色结晶物质，紫色结晶物质不溶于水显色时需要加入DMSO或者10%（m/v）SDS裂解细胞，DMSO加入后震摇即可读数，10%SDS需要过夜后方可读数。另外药典上也有加入酸化异丙醇读数的，类似DMSO操作。可以比较准确的反应细胞数。CCK-8原理类似MTT，但操作比MTT简单，且生成的结晶物质可溶于水，可以直接读数。根据说明书上介绍，加入CCK-8后的细胞液仍可以继续培养细胞，对细胞毒性较小，这也是与MTT区别较大的地方。至于具体步骤，如果做过MTT就没有问题。加入显色液--》孵育--》读数CCK8 的资料在网上有许多，请多查找一下请问CCK8需要DMSO吗？
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heiheidoudou 请问CCK8需要DMSO吗？CCK-8法生成的甲臜是水溶性的，所以不需要DMSO
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yj1984ren CCK-8法生成的甲臜是水溶性的，所以不需要DMSO灰常感谢
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非常感谢 学习了
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请问加完cck8并检测过od值后，细胞进行换液，第二天可以继续加入cck8检测吧？
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MTT、XTT、MTS、CKK-8
MTT 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲H 原 理 （Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此 功能。DMSO 能溶解细胞中的甲H，用酶联免疫 检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间 接反映活细胞数量。一定细胞数内，MTT 结晶形 成的量与细胞数成正比。 应 用 生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药 物筛选、细胞毒性
试验以及肿瘤放射敏感性测 定等XTTMTSCKK-8/WST-8作为线粒体脱氢酶的作用底物， 被活细胞 还原成水溶性的橙黄色甲H产物。当 XTT 与电子偶合剂（例如 PMS）联合应用时， 其所产生的水溶性的甲H产物的吸光度 与活细胞的数量成正比。新合成的四唑氮衍生物，和 MTT 属于同类物质。 它在电子载体 1-Methoxy PMS 的作用下被细胞 它们都能被活细胞中线粒体脱氢酶降解而产生 棕黄色水溶性的甲H， 能直接通过光谱吸收测定 A 值，进而推测细胞的增殖情况。当与电子耦合 剂 PMS(phenazine methosulfate 联用时，能增 强 MTS 和 XTT 的还原反应，提高反应的灵敏性。 线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的 黄色甲H产物（Formazan） 。生成的甲H物的 数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测 仪在 450nm 波长处测定其光吸收值，可间接反 映活细胞数量。 生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药生物活性测定等细胞增殖与毒性试验物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药 敏试验等将 MTS 和 PMS 溶液混合加入直接检测，无需洗 优 点 1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测 灵敏度高、经济 快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低 细胞密度；4、重复性优于 MTT。 涤或收集，省去溶解步骤。无需液闪混合液，也 无需处理放射性废物。 检测板可在读数后继续放 回到培养箱中进一步显色( 与 MTT 不同)。 安全： 不需要使用挥发性的有机溶剂来溶解甲产物 ( 与 MTT 不同)。 由于 MTT 经还原所产生的甲H产物不溶于水， 需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加， 也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解 缺 点 甲H的有机溶剂对实验者也有损害。后来改进 了方法，用 2%SDS-HCL 溶结晶，不需要去培养 基， 但是必须 37 度过夜， 耗时比较长。 另外 MTT 反应，这一步，至少需要 3 小时，如果要做某 个药物的急性作用，用这个方法就不太好了。 ①XTT：用 60℃预热培养液配制成 6.6 mmol/L，过滤除菌，现配现用。② 吩嗪 二甲酯硫酸盐（PMS）：用 PBS 配制成 Sigma MTT 粉末 1g 800 元。 方 法 每孔加入 50ul 2mg/ml MTT 溶液，培养 4h，吸 掉培养基，加入 150ul DMSO，水平混匀，酶标 仪 490-570nm 检测 220mmol/L ， 4 ℃ 避 光 保 存 20 天 。 ③ XTT/PMS：XTT 与 PMS 按 1：1 混合（临用 时混合）。 ①刺激增殖反应同前；②于终止培养前 2h，每孔加入 XTT/PMS 20μ l，混匀后再 培养 2h； ③在酶标仪上 450nm 处测定光吸 光度，参考波长为 655nm； 每孔加 20μ l MTS/PMS 混合液，培养 3～4 小时 显色。检测前摇晃培养板 10 秒钟，混匀颜色。 在酶联检测仪上， 波长 570nm 或 490nm， 570nm （ 或 和 690nm）处检测 genmed MTS 细胞繁殖定量检测试剂盒 650(元) 500 次。将 MTS 和 PMS 溶液储存于-20℃，避光 保存。 XTT 水溶液不稳定，需要低温保存或现配 现用。 试剂比较贵1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射 性同位素和有机溶剂；2、检测快速；3、灵敏 度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复 性优于 MTT；5、对细胞毒性小；6、为 1 瓶溶 液，毋需预制，即开即用。1、与 MTT 相比，CCK-8 和 XTT 的价格比较贵。 2、 CCK-8 试剂的颜色为淡红色， 与含酚红的培 养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多 加。C0038 Cell Counting Kit-8(CCK-8 试剂盒) 500 次 568.00 元。 1.向每孔加入 10 ml 的 CCK- 8 溶液 (注意不 要在孔中生成气泡，它们会影响 O.D 值的读 数)。3. 将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。 4. 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。 如 5. 果暂时不测定 O.D 值，打算以后测定的话，可 以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温 条件下。在 24 小时内吸光度不会发生变化。MTT法，CCK-8计数盒子，BrdU，EdU细胞增殖检测方法_干细胞搜网
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MTT法，CCK-8计数盒子，BrdU，EdU细胞增殖检测方法
由干细胞搜丨干细胞搜网编辑：
用于检测细胞增殖的方法很多，干细胞搜网实验室人员介绍下常用的四种细胞增殖检测方法：MTT法，CCK-8计数盒，BrdU，EdU
&&&&&&& 又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formaza...
用于检测细胞增殖的方法很多，干细胞搜网实验室人员介绍下常用的四种细胞增殖检测方法：MTT法，CCK-8计数盒，BrdU，EdU
&&&&&&& 又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
　　缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
普通MTT法实验步骤：
1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔个细
胞接种到96孔板，每孔体积200ul.
2: 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.继续孵育4 h，
终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。
每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。
4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为
横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
药物MTT法实验步骤
贴壁细胞：
1: 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000-
10000 孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2: 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，
细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午
加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况
3: 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，
可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5: 终止培养，小心吸去孔内培养液。
6: 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免
疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7: 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介
质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
悬浮细胞：
1: 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1&106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培
养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度
，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5&104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔
用无菌水填充）。每板设对照（加100ml 1640）
2: 置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用
WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）
4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使
结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、
MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
注意事项：
(1) 选择适当得细胞接种浓度。
(2) 避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔
内残余培养液。
(3) 设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，
最后比色以空白调零。
(4) MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。
(5) 用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适
根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于
DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定
(6) 一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意
不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。
CCK-8细胞计数盒
Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。
CCK-8的原理跟MTT其实是相同的，不同之处在于CCK-8法生成的formazan是水溶性的，不需要再吸出培养液加入有机溶剂溶解这个步骤，因此可以减少一定的误差。其他优点就是重复性优于MTT；对细胞毒性小；为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。但是CCK-8比MTT的价格要贵不少。
Brdu，即5-Bromo-2'-Deoxyuridine,中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。
但由于抗体分子量大，难于掺入并被有效检测，因此BrdU检测需采用DNA酶或HCl或加热使DNA变性；这些处理方法会破坏抗原识别位点，此外许多细胞周期分析的染料都需要dsDNA，这种处理方法也使得同一样本无法同时进行细胞周期分析。对于植物细胞等有细胞壁的分析，采用抗体检测还需要消化细胞壁，细胞壁消化酶常含有一些杂质，会导致检测的可靠性降低，同时BrdU检测则需要进行长时间的孵育--几个小时甚至过夜。
细胞增殖周期包括G1、S、G2、M 4个时期，其中S期是DNA合成期，细胞内DNA进行半保留复制，各种构成DNA的原料掺入到DNA中。
BrdU作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物（其化学结构特点是胸腺嘧啶的碱基嘧啶环上与5位C原子连接的甲基被溴代替），像胸腺嘧啶核苷一样可掺入到细胞合成的DNA中。当细胞处于DNA合成期而同时又有BrdU存在时, 就会有BrdU掺入新合成的DNA中，只要细胞不消亡，这种BrdU就在胞核的DNA中长期存留。掺入到DNA的BrdU可通过抗BrdU单克隆抗体在组织切片或细胞爬片上显示。
该方法能对细胞周期进行迅速而稳定的测量, 而且标记BrdU的细胞只要不受到紫外线照射，对细胞本身没有功能损害。
该技术可应用到跟踪检测移植细胞的存活、分化和功能状态。
EdU（5-Ethynyl-2&- deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apollo?荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性，适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。
与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU染料只有BrdU抗体的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等），可有效避免样品损伤，而且无需抗原抗体反应，能在细胞和组织水平更准确地反映DNA复制活性。
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干细胞自我更新及分化过程受生长因子、转录因子及信号转导的调控。这些分子机制，如Wnt、Hedgehog信号通路，可以被天然的或合成的小分子调节。例如，化合物可以以通路的某个特异性蛋白为目标，调整化合物的浓度可以精细调控细胞的反应。如果多个小分子共同作用于一个通路，研究者就可以增强干细胞的增殖并操控细胞的命运。并且，无滋养层细胞，添加优化生物活性小分子的干细胞培养方法，提供更一致、减小实验误差的途径...
细胞特异性标记的检测对确定干细胞初始状态及分化状态是非常重要的。采用免疫细胞化学（ICC）或流式细胞术检测可以减小实验变异，增加结果一致性，并可避免数周时间和试剂的浪费。
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