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Oligo(dT)18引物溶液产品说明书(中文版)
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oligo DNA 相关问题_百度文库
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DNA摩尔数计算
oligo DNA 相关问题|
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Oligo合成的一种优化方法|O​l​i​g​o​合​成​的​一​种​优​化​方​法
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常见问题及参考意见
Q：Oligo DNA制品的形态?
&&&A：Oligo DNA制品呈现白色粉末或无色透明均为正常形态。我公司提供的Oligo DNA制品为白色粉末或絮状物，一方面客户能肉眼观察到白色制品，另一方面保证Oligo DNA能即刻溶解。
但由于Oligo DNA制品受空气中水份的影响，制品被潮解而吸附于离心管壁或管盖上，呈现无色透明状或难以观察到，遇到这种情况时请在使用前先离心收集Oligo DNA制品于管底，然后溶解Oligo DNA制品。
Q：如何稀释Oligo DNA制品?
&&&A：收到Oligo DNA后，首先请短暂离心，收集Oligo
DNA制品于管底，然后慢慢打开管盖，加适量的无菌超纯水或TE缓冲液，盖上管盖，充分上下振荡或用手指弹管底，使Oligo DNA充分溶解。相关的说明及数据请参照我公司的DNA合成报告单。下面举例说明：
例：您得到一管标为5 OD260的20mer Oligo DNA：
TGG GCG GCG GTT GGT GTT AC
A=1 C=3 G=10 T=6
MW=(1×312)+(3×288)+(10×328)+(6×303)-61=6213
关于分子量，您也可以采用平均分子量的近似算法：
MW=20×324.5=6490
质量数=5×33=165μg
摩尔数=165/μmol=25nmol
若加入250μl超纯水溶解，
则浓度为：25nmol/250μl=100μM=100pmol/μl
Q：怎样制备100mM的储备液?
A：体积（μl）=DNA合成报告单上的nmol数目×10
Q：Oligo DNA制品如何保存?
A：（1）Oligo DNA干燥制品很稳定，常温下可保
存数月，但最好置于-20℃保存。
（2）溶解后的DNA溶液可于4℃短期保存，长期保存请置于-20℃。在溶解和使用DNA溶
液时，请避免核酸酶污染，减少DNA溶液
的反复冻融。
（3）荧光标记Oligo DNA对光敏感，在日光下
荧光强度会降低。为了保持荧光标记Oligo
DNA 的荧光效率，请于-20℃避光保存。
Cy3与Cy5在溶液pH&9的条件下会发生分
解，所以稀释Cy3与Cy5标记的Oligo DNA
时请注意溶液的pH值。
Q：Oligo DNA制品在常温下放置了一周还能正常
A：Oligo DNA的干燥制品是非常稳定的，即便在
溶液中也很稳定。一般情况下，只要没有核酸
酶、细菌等的污染，Oligo DNA制品于常温下
放置一周仍然能够正常工作，但长期保存请最
好置于-20℃。
Q：Oligo DNA 制品可以用琼脂糖凝胶电泳检测
A：由于化学合成的寡核苷酸所具有的特性，不能
使用Agarose Gel及EB染色方法进行质量和浓
度检测，必要时请使用变性PAGE电泳检测。主
要原因如下：
（1）Oligos是单链DNA，容易形成立体结构。跑
琼脂糖凝胶电泳时，容易出现多条带。
（2）Oligos为单链，而EB染色是嵌入到DNA
双链的碱基之间。因此，单链DNA形成的
立体结构越复杂，EB染色就越容易，DNA
条带就越亮。如果单链DNA不形成立体结
构，EB就无法染色。
Q：长度相同、碱基组成不同的Oligo DNA进行变性PAGE电泳时，电泳带应该在同一位置吗？
A：对于短链DNA来说，会有差异，但长链DNA
差别很小，主要原因如下：
（1）A、G、T、C组成不同，电泳速度不同。
（2）DNA立体结构不同，电泳速度不同。
Q：含有较长的连续鸟嘌呤的寡核苷酸可以合成吗？
A：我公司成功的合成过含有连续15个鸟嘌呤以上
的寡核苷酸。高嘌呤含量的寡核苷酸，特别是含
有较长的连续鸟嘌呤的寡核苷酸，有发生聚集
的倾向而形成guanine tetraplex，纯化时需要较
强的变性条件，而变性剂往往会危害到寡核苷
酸的具体应用。通过Inosine替换其中的一些鸟
嘌呤，可一定程度降低guanine tetraplex的形成。
Q：如何制备双链DNA?
A：（1）用退火缓冲液（10mM Tris pH8.0, 50mM
NaCl, 1mM EDTA）溶解单链DNA，浓度
为1~5OD/100μl。
（2）将两条互补单链等摩尔数混合。
（3）94℃温浴2~5分钟，然后缓缓冷却到室温（25℃以下）。
（4）4℃保存备用。
Q：普通合成的Oligo DNA 5'末端带磷酸基团吗？
A：不带磷酸基团。Oligo DNA的5'末端和3'末端
均为-OH基。如果合成Oligo DNA时需要带磷
酸基团，请特别注明，同时我公司需收取磷酸
化修饰费用。
Q：常用简并Oligo DNA（混合碱基）的代码：
A：M=（A/C），W=（A/T），H=（A/T/C），V=（G/
A/C），D=（G/A/T），Y=（C/T），K=（G/T），
S=（G/C），B=（G/T/C），N=（A/G/C/T），R=
Q：简并性Oligo DNA对PCR扩增的影响?
A：通常一条Oligo DNA中简并的碱基不要超过4
处，如果简并的碱基数过多，则会造成反应体
系中有效Oligo DNA的量相对减少，此时应适
当增加Oligo DNA的使用量。但Oligo DNA量
过大，容易引起非特异扩增，应加以注意。
Q：合成的Oligo DNA多次PCR无目的产物。
A：如果PCR后无目的产物，可以从以下几方面寻
（1）Oligo DNA设计是否合理。
（2）Oligo DNA和模板是否配对或同源性有多
（3）PCR反应试剂是否存在问题：模板DNA、DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、Oligo DNA等。
（4）PCR仪是否正常工作。
（5）退火温度及其它反应条体是否优化。
（6）模板是否存在复杂结构：GC含量高、重复
影响PCR失败的因素很多，可从多方面分
析考虑，若仍然扩增不出带，可要求我公司重
新合成Oligo DNA，以排除合成因素的影响。
Q：进行反义DNA（antisense DNA）实验时，对DNA
链是采取点硫代还是全程硫代修饰？
A：进行硫代磷酸酯寡核苷酸合成时，寡核苷酸间
非桥键的等价氧之一被硫所取代，形成了一个
手性硫代磷酸二酯，一种体内核酸酶代谢的拮
抗剂。特定的片段使特定基因表达中的mRNA
转录无效，这种现象被称为“反义效应”。
为了取得最好的保护效果，许多学者将整
条链进行硫代修饰，但这样会使碱基的配对效
率降低。因此，通常将片段的两端进行硫代修
饰，这样也可取得良好的保护效果，同时又可
避免中央片段配对效率的降低。但具体的实验
方案须根据您的实验目的及要求决定。
Q：PCR产物经克隆后测序发现Oligo DNA处碱基
有误，为什么？
（1）PCR过程的错配：DNA聚合酶忠实性低、
循环数太多、四种dNTP的浓度不同都可能
导致在PCR产物序列中Oligo DNA错误。
（2）克隆过程中引起的突变。
（3）测序导致的错误。
（4）合成仪管路的瞬时阻堵，结果引起单个碱
基或一部分碱基缺失。
（5）计算机程序失灵导致错误合成。
（6）碱基在偶联到DNA片段之前，碱基与碱基
之间发生了偶联，然后再附加到了DNA片
段上，导致多碱基现象。
（7）合成过程中出现脱嘌呤，对脱嘌呤后的碱
基，DNA聚合酶不能识别，可能导致PCR
后出现A或G缺失。
（8）脱保护不完全导致碱基缺失。
（9）Capping反应不完全，截断DNA（n-1）继
续参与后续合成，导致缺失碱基。
出现以上情况的概率极低，您可以通过多
挑几个克隆得到解决；您也可以通过点突变的
方式予以纠正。如果这两种方式您不愿意做，
我们公司可以提供免费合成一次。
Q：能保证合成的Oligo DNA 100%正确吗？
A：不能。Oligo DNA的合成是化学反应的过程，由
于化学反应的特性，Oligo DNA的纯度不可能
是100%，因此多测几个克隆，也许会挑到正确
Q：怎样保证合成Oligo DNA的高正确率？
A：（1）选用高纯度Oligo DNA。（2）选用小于35mer的Oligo DNA。
（3）进行克隆实验时需进行测序验证，尤其进
行蛋白表达实验时更须如此。
Q：PCR产物可以直接克隆吗？
A：PCR用Oligo DNA的5'端为-OH，因此扩增后
的PCR产物5'端也没有磷酸基团。当克隆于去
磷酸化的末端平滑载体时，无法克隆进去；而当
克隆于非去磷酸化的末端平滑载体时，背景会
极高。建议对PCR用Oligo DNA的5'端进行磷
酸化修饰或对PCR产物的5'端进行磷酸化处理。
Q：琼脂糖凝胶分析PCR产物时观察到非特异条带为什么？
建议解决方法
形成引物二聚体
设计在3'端没有互补序列的引物。
引物与模板非特异性退火&
1、以2℃间隔增加退火温度，减少退火时间。
2、在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。
3、采用Hot start法或Cool start法。
镁离子浓度太高&
对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
污染外源DNA&
在PCR过程中使用良好的实验步骤减少污染源。
因为二级结构导致引物结合位点无法接近&
对于GC%&50%模板，使用改善模板GC含量的优化剂。
引物设计不合理&
1、改变引物的位置，增强特异性。
2、增加引物长度，增强特异性。
模板DNA量过多
模板DNA量20%递减。}