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双水相萃取实验报告
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篇一：双水相萃取实验 一、双水相系统的相图绘制 1.实验目的 了解制作双水相系统的相图的方法，加深对相图的认识。 2.实验原理 相图是研究两水相萃取的基础，双水相形成条件和定量关系常用相图来表示。图1是典型的高聚物-高聚物-水双水相体系的直角坐标相图，两种聚合物A、B以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成、度的两相，上相组成用T点表示，下相组成用B点表示，由图1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线。结线上方是两相区，下方为单相区，若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。组成在系线上的点，分为两相后，其上下相组成分别为T和B，T、B量的多少服从相图的杠杆定律。即T和B相质量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比。又由于两相密度相差很小，故上下相体积之比也近似等于系线上MB与MT线段长度之比。
图1 A-B-水双水相体系相图 Figure 1 The phase diagram of the A-B-H2O aqueous two-phase system 3.实验器材和试剂 （1）器材：电子台秤，漩涡混合器，大试管，滴定管，密度计，温度计。 （2）试剂：聚乙二醇，硫酸铵，硫酸镁。 4.操作方法 （1）溶液的配制 配制40%的盐（硫酸铵或硫酸镁）溶液 配制40%的聚乙二醇溶液，液体聚乙二醇可用纯溶液。 （2）相图的制作精确称取一定质量（0.7000g左右）PEG溶液于大试管中，按表1所列第1列数据，加入0.5mL去离子水，用滴定管缓慢滴加已配好的40%的盐溶液，并不断在漩涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内液体出现浑浊为止。记录盐溶液的加量(g)。然后，按表格所列第2列数据加入水，溶液澄清，继续向试管中滴加盐溶液并不断混匀，直至再次达到浑浊，如此反复操作。计算每次达到浑浊时，PEG和盐在系统总量中的质量分数，将实验数据填入表中，以PEG的质量分数为纵坐标，某种盐的质量分数为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。 表1相图制作表 编 水 (NH4)2SO4溶液加量/g 3.2 2.2 6.9 6.8585 纯(NH4)2SO4累溶液累计总计量/g 0.895 1. 3.0 4.7 6.5 8.5 量/g 4.1 9.8 19.8 33.4596 (NH4)2SO4质量分 数/% 20.4 21.85 22.65 23.68 24.52 25.02 25.32 PEG
质量分数/% 4.79 3.02 2.26 1.65 1.08 0.8 0.62 号 /g 1 0.5 2 0.3 3 0.3 4 0.3 5 0.5 6 0.5 7 0.5 根据以上数据以(NH4)2SO4质量分数为横坐标，以PEG质量分数为纵坐标即可做出相图。
6 PEG4000与MgSO4双水相图 y = 0.0995x2 - 5.3887x + 73.334 2 5
PEG4000% 4321020 21 22 23MgSO4% 24 25 26 二、双水相系统比例的选择 根据相图，选择五个成相比例。 三、蛋白酶酶活标准曲线的绘制―― Folin酚法或紫外分光光度法紫外分光光度法测蛋白酶酶活
1．原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。 2．试剂和溶液 2.1
三氯乙酸c=0.4mol/L：称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 2.2
氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L 2.3
盐酸溶液c（HCl）＝1 mol/L及0.1 mol/L 1mol/L HCl:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。 0.1mol/L HCl：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。 2.4
缓冲溶液 a.磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4?12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 b.乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶 甲液
称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液
称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液
取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。 c.硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶 甲液
称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液
称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液
取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。 上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。 2.5
10g/L酪素溶液 称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 2.6 100ug/mL L-酪氨酸标准溶液 a．称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 b．吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 3.仪器和设备 3.1
恒温水浴40±0.2℃。 3.2
紫外分光光度计 4
分析步骤 4.1
求K值 按下表配制不同浓度的L－酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计于275nm测定其吸光度（A），以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）, 根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值;（其K值应在（130～135）范围内）。
4.2 测定 吸取适量稀释的酶液2.00mL、酪素2.00mL、三氯乙酸4.00 mL，其它操作条件同福林法测定中的反应、静止沉淀，直到过滤。滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm比色皿，测定其吸光度（A）。 a、先将酷素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min； b、按下列程序操作： 试管A（空白） 试管B（酶试样，需作三个平行试样） 加酶液2.00 mL加酶液2.00 mL 40±0.2℃，2min 40±0.2℃，2min 加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）
加酪素2.00mL(已预热)（摇匀） 40±0.2℃，10min（精确计时）40±0.2℃，10min（精确计时） 加酪素2.00mL(已预热)（摇匀）加三氯乙酸4.00mL（摇匀） 继续加热10min，过滤或离心继续加热10min，过滤或离心 于275nm波长，测上清液吸光值 于275nm波长，测上清液吸光值 c、1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为30±0.2℃外，其它操作同 4.2。标准曲线作同样处理。 5
计算 在40℃下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。 X＝A×K×8/2×1/10×n×E＝2/5×A×K×n×E 式中：X――样品的酶活力，(u/mL)； A――试样溶液的平均吸光度；篇二：双水相萃取实验设计 双水相萃取地豆蛋白实验设计方案 史庚林 一、引言 地豆又名金果，长寿果、长果、番豆、金果花生、无花果、地果、地豆、唐人豆、花生豆、落花生和长生果。花生滋养补益，有助于延年益寿，所以民间又称之为“长生果”，并且和黄豆一同被誉为“植物肉”、“素中之荤”。花生的营养价值比粮食高，可以与鸡蛋、牛奶、肉类等一些动物性食物媲美。它含有大量的蛋白质和脂肪，特别是不饱和脂肪酸的含量很高，很适宜制作各种营养食品。 双水相萃取系统通常是由水溶性的两种聚合物或一种水溶性聚合物与一种盐和水构成的三组分双相体系。近年来, 该萃取技术受到研究者的青睐, 尤其是它对蛋白质、酶、核酸等生物活性物质的分离纯化等方面受到广泛重视, 双水相萃取在提取生物活性物质方面有如下优点: 含水量高;分相时间短; 界面张力小; 不存在有机溶剂残留问题; 大量杂质能与所有固体物质一同除去; 易于工程放大和连续操作 ; 更重要的是双水相萃取避免了传统液- 液萃取中生物活性物质与有机溶剂的直接接触, 保护了其活性, 有研究表明聚合物对颗粒或生物分子的结构不但没有破坏作用, 反而有稳定作用。 本实验以PEG/ ( NH4)2SO4 双水相体系为考察对象, 比较了不同浓度的PEG 和( NH4 )2 SO4 组成的双水相体系对地豆蛋白的萃取效果, 并考察了影响萃取效果的各种因素。 二、实验仪器与试剂 1 仪器：离心机,电热恒温水浴锅，分光光度计,磁力搅拌器，电子天平，超声波仪 2 试剂：PEG( 分子量分别为600、、) , 硫酸铵，Nacl，NaH2PO4 ，K2HPO4，考马斯亮蓝（G-250） 三、 1 粗蛋白的提取 1.1 用前面超声波处理的方法提取蛋白质 1.2 用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量2
不同分子量PEG 的双水相萃取的相图作 用浊点法制作相图。称取2g50%PEG溶液，加1mL蒸馏水，计总质量。向体系中加40%（NH4)2SO4至浑浊，测质量，然后再加1mL蒸馏水，溶液马上澄清，重复前面步骤，测出多组数据，作出相图。 表1 相图的制表 编号 H2O加量/g 1 2 3 4 5 6 0.5 0.3 0.3 0.3 0.5 0.5 ( NH4)2SO4溶液的加量/g
纯( NH4)2SO4 溶液的累累积量/g
PEG质量分数/%
( NH4)2SO4质量分数/g
取分配系数好的PEG的相对分子质量 3 单因素实验 3.1 在PEG/ ( NH4 )2SO4 双水相系统中, PEG 浓度对地豆蛋白质分配系数的影响 表2 在PEG/ ( NH 4 ) 2 SO4 双水相系统中, PEG 浓度对K 的影响 PEG
溶液加量/g 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 5 （NH4 )2SO4溶液 加量/g 5 5 5 5 5 5 5 5 5 蛋白溶液加量 /g 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0 分配系数K 体积比R 萃取率Y 取最佳PEG的浓度 3.2 在PEG/ ( NH4 ) 2SO4 双水相系统中,( NH4 )2SO4 浓度地豆蛋白质分配系 数的影响 表3
在PEG/ ( NH 4 ) 2 SO4 双水相系统中, ( NH 4 )2SO4浓度对K 的影响 PEG
溶液加量/g 5 5 5 5 5 5 5 5 5 （NH4 )2SO4溶液 加量/g 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 5 蛋白溶液加量 /g 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0 分配系数K 体积比R 萃取率Y
取最佳( NH 4 )2SO4浓度 3.3
在PEG/ ( NH4 ) 2SO4 双水相系统中, pH 对地豆蛋白质分配系数的影响固定PEG的百分含量为
,( NH4 ) 2 SO4 的百分含量为
, 考察不同pH 对蛋白质分配系数的影响。 表4
蛋白质分配系数的影响 PH值 2 4 6 8 10 分配系数K
3.3 在PEG/ ( NH4 ) 2SO4 双水相系统中, NaCl质量分数对 地豆蛋白质分配系数的影响 固定PEG 的百分含量为,( NH4 ) 2 SO4 的百分含量为, pH为
, 考察不同质量分数NaCl 对果胶酶分配系数的影响。 表5
NaCl质量分数对地豆蛋白质分配系数的影响 NaCl溶液加量/g 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 PEG/ ( NH4 ) 2SO4 溶液加量/g 5 5 5 5 5 蛋白溶液加量/g 4.998 4.996 4.994 4.992 4.990 分配系数K 体积比R
3.4 在PEG/ ( NH4 ) 2 SO4 双水相系统中, 体系温度对 地豆蛋白质分配系数的影响 固定PEG 的百分含量为,( NH4 ) 2 SO4 的百分含量为, 考察不同温度对果胶酶分配系数的影响。 表5 温度对K 的影响 温度/℃ 2O 40 60 80 100 参考文献： 【1】刘叶青.生物分离工程实验[M].78-79 【2】邱树毅. 液-液双水相萃取分离α-淀粉酶研究[J].食品科学, ) : 12-14. 【3】杨 辉，张 娟，王 旭.PEG/(NH4)2SO4 双水相体系萃取果胶酶[J],食品科学,. 分配系数K
萃取率Y篇三：双水相萃取技术
高等分离工程课程论文
双水相萃取技术的发展与应用随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新生物技术研究工作的广泛展开，各种生化新产品不断涌现，对生化分离技术也提出了越来越高的要求。但由于大部分的生物产品原液是具有低浓度和生物活性的，对分离条件以及环境要求及其苛刻，使得传统的液液萃取已不能适应分离要求，因此一种新型的液液分离技术-双水相萃取技术应运而生，双水相萃取技术是利用组分在两水相间分配的差异而进行组分的分离提纯的技术。由于双水相萃取分离过程条件温和、可调节因素多、易于放大和操作，并可借助传统溶剂萃取的相关理论和经验，不存在有机溶剂残留问题，特别适用于生物物质的分离和提纯。目前，双水相萃取技术已被广泛地应用于医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域，被认为是生物工程中一种具有广阔应用前景的分离技术，在电化学生物传感器中生物活性分子的制备中至关重要。 1 双水相萃取的基本要点 1.1 双水相萃取的原理 双水相萃取是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。 对于某一物质，
只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件，就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化之目的。 将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这就是双水相体系。双水相体系的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不 能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异，混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离的倾向也就越大。 1.2 双水相的种类 双水相萃取中使用的双水相是由两种互不相溶的高分子溶液或者互不相溶的盐溶液和高分子溶液组成。最常见的就是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dextran)和PEG/无机盐(硫酸盐、磷酸盐等)体系,其次是聚合物/低分子量组分、离子液体体系和高分子电解质/高分子表面活性剂体系。此外,还有被称为智能聚合物的双水相体系,智能聚合物又称刺激-响应型聚合物(Stimulus-responsive polymers)或环境敏感聚合物(Environmentally-sensitive polymers)。智能聚合物是一种功能高分子材料,当外界环境(如温度、pH值、离子强度、外加试剂、光、电场或磁场等)发生微小变化时,聚合物分子的微观结构会发生快速、可逆的转变,使其从亲水性变为疏水性。智能聚合物的双水相体系有:温度敏感型双水相体系、酸度敏感型双水相体系、光响应型双水相体系、亲和功能双水相体系。 1.3 双水相萃取体系的特点 双水相萃取技术设备简单、在温和条件下进行简单操作就可获得较高的收率和纯度。与一些传统的分离方法相比,双水相萃取技术具有以下特点： （1) 整个体系的含水量高 (70% ～90% ) ， 萃取是在接近生物物质生理环境的条件下进行，故而不会引起生物活性物质失活或变性； （2) 单级分离提纯效率高。通过选择适当的双水相体系，一般可获得较大的分配系数，也可调节被分离组分在两相中的分配系数， 使目标产物有较高的收率； （3) 传质速率快，分相时间短 。 双水相体系中两相的含水量一般都在 80%左右， 界面张力远低于水-有机溶剂两相体系，故传质过程和平衡过程快速；（4) 操作条件温和，所需设备简单。整个操作过程在室温下进行，相分离过程非常温和，分相时间短。大量杂质能与所有固体物质一起去掉，大大简化分离操作过程； （5) 过程易于放大和进行连续化操作 。 双水相萃取易于放大， 各种参数可以按比例放大而产物收率并不降低，易于与后续提纯工序直接相连接，无需进行特殊处理，这对于工业生产来说尤其有利； （6) 不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发性物质，因而操作环境对人体无害； （7) 双水相萃取处理容量大，能耗低。主要成本消耗在聚合物的使用上， 而聚合物可以循环使用，因此生产成本较低； 1.4 双水相萃取的工艺流程 双水相萃取技术的工艺流程主要由三部分构成:目的产物的萃取;PEG的循环;无机盐的循环。 (1)目的产物的萃取原料匀浆液与 PEG和无机盐在萃取器中混合，然后进入分离器分相 。通过选择合适的双水相组成，一般使目标蛋白质分配到上相（PEG相），而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相（富盐相）。第二步萃取是将目标蛋白质转入富盐 相，方法是在上相中加入盐，形成新的双水相体系，从而将蛋白质与 PEG分离，以利于使用超滤或透析将 PEG 回收利用和目的产物进一步加工处理。 (2)PEG的循环：在大规模 ATPE 过程中，成相材料的回收和循环使用，不仅可以减少废水处理的费用，还可以节约化学试剂，降低成本。PEG的回收有两种方法：①加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收 PEG；②将 PEG 相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去 PEG，再洗出蛋白质。 (3)无机盐的循环：将含无机盐相冷却，结晶，然后用离心机分离收集。除此 之外还有电渗析法、膜分离法回收盐类或除去 PEG相的盐。 原则流程图如下： 图一：双水相萃取的工艺流程 2 双水相萃取技术的应用 2．1
在生物工程中的应用 双水相技术作为一种生化分离技术,由于其条件温和,易操作,可调节因素多,并可借助传统溶剂萃取的成功经验,而被认为是一种生物下游工程初步分离的单元操作。双水相萃取分离技术已应用于蛋白质、生物酶、菌体、细胞、细胞器和亲水性生物大分子以及氨基酸、抗生素等生物小分子物质的分离、纯化。 2. 2
在药物分析中的应用 中药中含有大量的有机化合物且成分十分复杂，提高中草药中有效成分提取及分离技术对我国中医中药进入国际市场有很大的促进作用。天然活性成分的分离提取和质量控制将是今后重点研究课题，这类具有独特功能和生物活性的化合物，是疾病预防与治疗的基础物质。ATPE 技术作为一种新型的萃取技术已经成功的应用于天然产物的分离纯化。 2. 3
双水相在金属离子分离中的应用 传统的金属离子溶剂萃取方法存在着溶剂污染环境、对人体有害、运行成本高、工艺复杂等缺点。近年来，利用双水相技术萃取分离金属离子达到了较高的水平。 2. 4
在其他方面的应用 双水相萃取除了以上的应用外,还用于萃取食用色素、分离环境污染物(如苯酚和对苯二酚)等。 3 双水相萃取技术进展及展望 3.1 新型双水相系统的开发
在生物物质分离过程中得到应用的双水相系统有2类:非离子型聚合物/非离子型聚合物/水系统和非离子型聚合物/无机盐/水系统。因为这2类系统所用的聚合物无毒性，己被许多国家的药典所收录，而且其多元醇、多元糖结构能使生物大分子稳定。但在实际应用中，这2类双水相系统各有优缺点，前者体系对生物活性物质变性作用低，界面吸附少，但是所用的聚合物(如葡聚糖)价格较高，而且体系猫度大，影响工业规模应用的进展;后者成本相对低，猫度小，但是由于高浓度的盐废水不能直接排人生物氧化池，使其可行性受到环保限制，且有些盐对敏感的生物物质会在这类体系中失活。因此，寻求新型双水相体系成为双水相萃取技术的主要发展方向之一，新型双水相体系的开发主要有2类:廉价的双水相系统及新型功能双水相系统。 3． 2 双水相萃取相关理论的发展 虽然双水相萃取系统在应用方面取得了很大进步，但目前这些工作几乎都是建立在实验数据的基础上，至今还没有一套比较完善的理论来解释生物分子在体系中的分配机理。考虑到生物物质在双水相系统中分配时是一个由聚合物、聚合物(或无机盐)、生物分子和水等构成的四元系统，系统中的组分千差万别，从晶体到非电解质、从无机小分子到有机高分子甚至生物大分子，这些都不可避免地造成理论计算的复杂性。滕弘霓在双水相成相规律及影响因素方面已做了一定的研究。因此，建立溶质在双水相系统中分配的机理模型一直是双水相系统相关研究的重点和难点。
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