感受态细胞制备与保存方法的比较研究_百度文库
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感受态细胞制备与保存方法的比较研究
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DH5a菌感受态的配置及注意事项
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感受态是指一种容易接受外源DNA的状态。在转基因的过程中，一般会把待转化的处理成为感受态，以提高转化的效率。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。DH5a菌感受态的制备：1、从LB平板上挑取DH5a单菌落,接种于3LB液体培养基中 37℃下振荡培养12h左右直至对数生长后期培养基中。2、将菌悬液以1:100的比例接种于LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜，再将菌悬液以1:100的比例接种于100ml LB液体培养基中37℃，210rpm至OD ＝0.5左右(生长对数期），约2-3h。3、将菌液转移到两只预冷的50ml无菌离心管中，冰浴30min，4℃、5000rpm离心5min，弃上清；4、每只离心管中加入4ml冰冷的0.1M CaCl2，使菌体重悬，冰浴30min，4℃、5000rpm离心5min，弃上清；5、每只离心管中加入1ml冰冷的0.1M CaCl2，重悬后分装到无菌的1.5ml离心管中(每管100ul)；6、置-40℃冰箱长期保存；制备感受态的注意事项：1、所有器具必须清洁干净，避免污染。2、培养基装量建议不要高于培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml，厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。 3、接种前的pH值在6.8-7.2。等菌摇好后，可以测一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。4、经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用20mM MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。5、较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了Inoue的高效感受态制备方法。6、在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。7、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。8、冻存的感受态用一次拿一管，不要反复冻融。化冻之后立即使用，不要冰上放太久。9、操作时可以轻弹轻甩，尽量避免用移液器吹吸。（本文转自索莱宝：）
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关于丁香园在做制备感受态细胞DH5a时,将含有pET-GFP的基因转化给了DH5a,转化后的DH5a确实能够在含Kan的平板上生长但是在进一步做PCR验证时（扩增目的基因）,却又发现在相应大小750bp处没有条带,只有引物二聚体,这是为什么?应该可以排除PCR设定条件的问题,因为跟我同组的人都P出来了,就我没有目的条带.
你确定是Kan抗性吗?如果你的确实是kan的话,平板克隆假阳性的情况很常见.关键PCR设好阳性对照,如果阳性对照有目的条带,而挑的克隆没有,就能说明是假阳性克隆.另外,可以多挑几个克隆,我一般都会挑10-20个.
涂板的时候我做了2组阴性对照，一个板为含有Kan涂有空载DH5a，结果是没长出菌，另一个板为没涂Kan涂有空载DH5a，结果是长出了菌。所以应该不是Kan的问题我觉得。在做PCR时，只做了一组阴性对照，就是没有加DNA模板，结果是没有跑出目的条带。请问您说的假阳性是什么个情况？可以具体些吗？
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印象中，PET系列的质粒一般都转化BL21细胞吧？还要看你的pet质粒是那个系列的，有的是amp抗性，有的是kana抗性，不定都是kana 的抗性。
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DH5a制备化学感受态细胞注意事项
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本实验心得来自丁香园论坛，
谢谢。有没有可能是交叉污染啊，因为我这边的试管个培养皿都是重复利用的，以前培养过带抗性的菌株。请问你们是怎么处理使用过的器皿的。我是先高温高压灭菌，然后用清水清洗，再高温高压灭菌的。
请进入下面网站：高效感受态细胞的制作
建议楼主再去宝生物购买一支，挺便宜的。
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