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【求助】定点突变DpnI处理后转化感受态细胞失败原因
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这个帖子发布于5年零320天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
用的stratagene的试剂盒，样品和pWhitescript阳性对照DPNI酶处理后电泳都有明显条带。然后转化XL10-Gold感受态细胞，阳性对照涂布100ul培养液有20个左右克隆长出，有蓝斑。样品全部菌体离心重悬涂布后没有一个克隆长出。应该可以肯定是感受态转化效率的问题吧？但是试剂盒刚买来，第一次用。我用自制的DH5a感受态重新转化一次还是没有克隆长出。难道这种实验后带有缺刻的质粒要求很高的转化效率麽？现在我应该怎么做能最快做出结果呢？谢谢指导了
不知道邀请谁？试试他们
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A question for you: is there any blue colony when you use plasmid pWhitescript not subjected to PCR reaction?To verify the transformation, you may use some of the PCR reactions for transformation without Dpn I digestion. Usually you should have some colonies if transformation is fine. Your template plasmid is in poor quality if you have no any colony while the positive control pWhitescript does. Try to use midprep or maxiprep template plasmid DNA in the QuikChange reactions.
Sometimes you may need to perform phenol extraction and ethanol precipitation of the Dpn I-digested and mutated plasmid DNA before doing transformation.Because the mutated DNA from QuikChange reactions contains staggered nicks, it is necessary using MaxiEfficiency competent cells.
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多谢！可是后来我用试剂盒提供的感受态细胞10-20ul划平板（tet抗性），居然只长出几十个克隆，没有成片的菌苔，这是不是说明细胞不好呢？我只冻融过一次，细胞的存活率似乎太低了些。所以我觉得没必要再尝试用试剂盒的感受态细胞做转化了。自己做感受态细胞的话，用哪种方法可以达到实验要求的转化效率呢？INOUE法实验室条件有限，培养温度最低只能做到28度，作出来的细胞是不是能满足要求？cacl2－Mgcl2法分子克隆上说能达到5*106-2*107的转化效率，是不是可以呢？另外，DpnI酶处理后的DNA用PCR产物纯化试剂盒纯化可以麽？试剂盒说明书转化的时候没要求纯化，不纯化能做出来麽？
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Make your own competent cells (treat the cell with 60 mM CaCl2/10 mM Tris-HCl, pH 7.5) in cold room or cool everything on ice over 6 hours before starting.Make sure that the PCR reaction is fine by using non-mutation primers.To improve transformation, try to clean Dpn I digested DNA by phenol extraction and ethanol precipitation in the presence of glycogen.
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谢谢mpark，我在参考分子克隆的Cacl2-Mgcl2法和Inoue法制备感受态转化试试看结果。如果还是不行的话，我就听你的提纯一下我的DpnI处理DNA，顺便问一下in the presence of glycogen指的是甚么？还有您说的那种感受态制备方法比Inoue方法效率怎么样？Inoue方法有点麻烦，如果相差不多还是你这种方法比较方便。
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Add glycogen (1-2 ul of 10 mg/ml) to the Dpn I digested DNA solution for increasing efficiency of ethanol precipitation.CaCl2 treatment is the standard method to make bacterial cells chemically competent for transformation. The efficiency of plasmid DNA transformation is around 1x10e6-1x10e7/ug DNA.The point is that it will increase the possibility of getting the mutation clones when you start your quik-change experiments with high quality of midprep or maxiprep DNA.
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不好意思，弱弱的问一下midprep和maxiprep DNA指的是甚么？中抽和大抽的质粒麽？这么说质粒小抽试剂盒得到的DNA质量不够高麽？
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您好，最近我也在用这个试剂盒做点突变实验，转化后啥都没长，做了两次都那样，不知道你后来找出原因没？
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。。。。。试验杂就这么难。多动脑筋。定点突变很简单咧
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老板让我把反应体系减半了，转化直接用LB培养基，没调PH值，突变质粒是6.7Kb，就是长不出东西来，你有什么建议吗？非常感谢！
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我做了一个礼拜的定点突变，我是要往目的片段中加入三个连续的碱基，PCR后进行电泳发现有条带，而且大小也是正确的，但是DPN1处理后，进行转化，就是不长菌，试了很多次了，就是不知道什么原因，不知道有没有人可以帮我解答一下，太伤心了
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@sunshineboylxy， 会不会是你的基因突变之后对细胞有毒性，你试试先用葡萄糖或者相应的启动子抑制剂抑制一下你的基因表达。还有就是你说的大小正确，是否做过酶切验证，直接跑不准的。以及，经过dPNI处理之后，你是否跑过胶看看你的PCR还在不在。会不会这一步出了问题。
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我在DPN1处理后跑胶，发现条带还是在的。我这个基因是在构建的时候缺失了三个碱基，变成了它的一个转录剪接体，我现在想把三个碱基加上，因此我认为应该不会是毒性的因素。酶切验证我没有做过，这个我可以尝试一下，谢谢了
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关于丁香园2015江西省重点中学协作体联考理综试题及答案
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江西省重点中学协作体2015届高三第一次联考理综试题可能用到的相对原子质量：H:1& O:16& C:12& N:14& Na:23& Cl:35.5
一．选择题：本题共13题，每小题6分。在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目的要求的。1．下列有关细胞的叙述正确的是A．溶酶体能合成多种水解酶并降解所吞噬的物质B．细胞分化的主要标志首先是细胞内开始合成新的特异性的蛋白质C．细胞衰老表现为酶活性降低，细胞核体积减小D．核糖核酸可在细胞间传递信息2．下列有关生物学实验的叙述中，正确的是&& A．探究生长素类似物促进插条生根的最适浓度实验中，插条不能带有芽&& B．通常以标志重捕法调查土壤中小动物类群的丰富度&& C．观察线粒体，用新鲜 的藓类叶片代替口腔上皮细胞，效果较佳 && D．洋葱幼根经低温诱导后制成装片，可用于观察细胞染色体数目的变异3.下图是细胞中糖类合成与分解过程示意图，下列叙述正确的是&A．过程①和②中均能产生[H]，且二者还原的物质不相同B．过程①产生的能量全部都储存在ATP中C．过程②产生的（CH2O）中的氧来自H2O、CO2D．过程①只能在线粒体中进行，过程②只能在叶绿体中进行4．下列有关生物多样性和进化的叙述中，不正确的是A. 新物种的形成通常要经过突变和基因重组、自然选择及隔离三个基本环节B. 生物的多样性包括基因、物种和生态系统的多样性C. 共同进化总是通过物种间的生存斗争实现的&& D. 自然选择能定向改变种群的基因频率，决定了生物进化的方向5．下列甲图表示不同浓度生长素对顶芽和根部生长的生理作用，乙图为用一定浓度梯度的生长素类似物溶液处理扦插枝条后生根的情况（其中浓度为O的是对照组），丙图表示不同浓度的生长素对某植物乙烯生成和成熟叶片脱落的影响。下列说法正确的是
A．图甲中曲线①代表的是顶芽B．图乙所示实验的对照组 表明扦捕枝条没有植物激素的作用时也能生根C. 图丙结果表明在生产上可喷施高浓度生长素类似物增加脱落率D.水平放置的植物，根的近地侧生长素浓度范围可用图甲中的cd表示6．矮牵牛花瓣中存在合成红色和蓝色色素的生化途径（如下图所示，Ａ、Ｂ、Ｅ为控制相应生化途径的基因）。矮牵牛在红色和蓝色色素均存在时表现为紫色，二者均不存在时表现为白色。若一亲本组合杂交得F1，F1自交产生F2的表现型及比例为紫色：红色：蓝色：白色=9:3:3:1，则下列说法不正确的是:（&& ）A.亲本基因型为AABBEE×aaBBee或AABBee×aaBBEEB.本实验无法判断A、B基因遗传是否符合自由组合定律C. F2中蓝色矮牵牛花自交，其后代中纯合子的概率为2/3D.F2中紫色个体与白色个体杂交，不会出现 白色个体7．下列说法不正确的是（& ）A．光化学烟雾指的是排入大气的氮氧化物和碳氢化 合物发生光反应而形成的污染物 B．室内空气污染主要源于装饰材料及粘合剂散发的甲醛等有毒气体C．某酸雨样品在空气中露置后pH值由4.5变为4.3其原因可能是吸收了空气中的CO2D．绿色食品是指天然无污染食品，白色食品是指经发酵而得的食品，蓝色食品是指来自海洋的食品8．依托孕烯是一种激素类药物，结构如图所示。下列有关依 托孕烯的说法正确的是（&& ）&A．依托孕烯的分子式为C21H28O2 B．依托孕烯能与FeCl3溶液发生显色反应&C．l mol依托孕烯最多能与5 mol氢气发生加成反应&D．依托孕烯能发生氧化、还原、消去、水解等反应9．如图所示的 甲、乙、丙三种物质，含有相同的某种元素，箭头表示物质间的转化一步就能实现，则甲可能是（& ）① C&& ② H2O2&& ③ Na&&& ④Fe&& ⑤HNO3A．① ③ ④&&& B．① ② ⑤&& C．① ② ③ ⑤&& D．① ② ③ ④ ⑤10．下列离子方程式不正确的是（& ）& A．NaHSO4溶液中加入过量Ba(OH)2溶液：H＋＋SO42－＋Ba2＋＋OH－＝BaSO4↓＋H2O& B．苯酚钠溶液中通入少量二氧化碳：2C6H5O－+ CO2 + H2O& → 2C6H5OH + CO &C．2.24L（标况下）Cl2通入100mL 1mol/L FeI2溶液中：Cl 2 + 2I－=== 2Cl－+ I2&D．乙醛溶液与足量的银氨溶液共热CH3CHO+2[Ag(NH3)2]++2OH－&&& CH3COO―+NH +2Ag↓+3NH3+H2O11．25℃时，某溶液中可能含有以下几种 离子：Na+、H+、Fe3+、HCO3－ 、OH－、I－，已知溶液中由水电离出的c(H+)=10－13mol•L－1，向该溶液中通入一定量的Cl2后，溶液由无色变为黄色，下列有关该溶液的说法中正确的是（&&&&&& ）&A．该溶液的pH值一定等于1&B．阴离子肯定有I－，不能确定有无HCO3－&C．阳离子肯定没有Fe3+，一定有Na+&D．该溶液含有的溶质成分可能为HI或HI和NaI或NaI和NaOH12．下述实验不能达到预期目的的是（&&&&&& ）编号&实验内容&实验目的A &将SO2通入酸性KMnO4溶液中&证明SO2具有还原性B&将Cl2通入NaBr溶液中，再滴入CCl4溶液&比较氯与溴的非金属性强弱C&将铜与浓硝酸反应生成的气体收集后用冰水混合物冷却降温&研究温度对化学平衡的影响D&分别向2支试管中加入相同体积不同浓度的H2O2溶液，再向其中1支加入 少量MnO2&研究催化剂对H2O2分解速率的影响
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