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淘豆网网友近日为您收集整理了关于水稻OsSET24基因RNA干涉转基因植株的获得及分析的文档，希望对您的工作和学习有所帮助。以下是文档介绍：水稻OsSET24基因RNA干涉转基因植株的获得及分析 水稻 OsSET24 基因 RNA 干涉转基因植株的获得及分析#郑少燕,黄文达,刘振兰**540(华南农业大学生命科学学院,亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,广州510642)摘要:OsSET24 属于水稻多梳蛋白家族(b group, PcG)基因的一个成员。本文采用半定量 RT-PCR 方法分析了水稻 OsSET24 基因在粳稻品种中花 11 幼嫩和成熟根、茎、叶和不同发育时期小穗中的表达,发现 OsSET24 在水稻发育中呈组成型表达,但在不同发育时期的小穗中表达量较高。我们构建了玉米 ubi 启动子驱动的 OsSET24 基因的 RNA 干涉载体,通过农杆菌介导法转化中花 11 愈伤组织,获得了多个 OsSET24 基因表达量下调的转基因株系。表型分析表明,RNA 干涉转基因植株表现多种发育异常,包括株高明显降低、穗长变短、小穗变小,以及花粉育性和结实率明显下降;同时小穗发育也出现多种异常,包括外稃和内稃闭合不完全、内稃或者外稃缺失、颖片变大和花药卷曲等。本文结果表明,OsSET24基因在(来源：淘豆网[/p-3290852.html])水稻的营养生长和生殖生长中均发挥重要作用。关键词:OsSET24; RNA 干涉;水稻;多梳蛋白中图分类号:Q94Analysis of transgenic rice plants carrying RNA interferenceconstructs of OsSET24ZHEN Shaoyan, HUANG Wenda, LIU Zhenlan(College of Life Sciences, State Key Laboratory for Conservation and Utilization of SubtropicalAgro-bioresources, South China Agricultural University, Guangzhou 510642)Abstract: OsSET24 encodes a SET domain-containing protein belonging to the b-Group (PcG)proteins. In this stu(来源：淘豆网[/p-3290852.html])dy, the expression pattern of OsSET24 was analyzed by semi-quantitative RT-PCR.And results showed that OsSET24 expressed in ans examined, but higher levels of expressionwere observed in spikelets at different developmental stages of japonica rice Zhonghua11. RNAinterference vector for OsSET24 driving by maize ubi promoter was constructed and transformed intoZhonghua11 calli. Several transgenic rice lines with decreased expression of OsSET24 were par(来源：淘豆网[/p-3290852.html])ed with wild-type plants, the transgenic rice plants showed decreased plant height and spikelength, and the size of the seeds also decreased greatly. Most of the transgenic lines showed reducedseed setting rates and pollen fertility rate. Pleiotropic defects in spikelet development were alsoobserved including unclosed palea and lemma, degenerated or malformed palea or lemma, enlargedglumes. These results indicated that OsSET24 should play important (来源：淘豆网[/p-3290852.html])roles in both vegetative andreproductive growth of rice.Key words: OsSET24; RNA b group protein0 引言多梳蛋白(b Group, PcG)是存在于动物和植物中的一类高度保守的染色质修饰因子,在动植物的生长发育中发挥重要作用[1-3]。PcG 家族基因最初发现于果蝇,它能抑制控制某些同源异型基因的表达[4]。动物中,PcG 蛋白通常装配成多聚梳复合体 1(plex 1, PRC1)和多聚梳复合体 2(b plex 2, PRC2)两种基金项目:教育部高等学校博士学科点专项科研基金(编号:21)资助作者简介:郑少燕(1988-),女,硕士研究生,研究方向:植物分子生物学与基因工程通信联系人:刘振兰(1973-),女,教授,主要研究方向:植物分子生物学与基因工程.zhenlan_liu@scau.-1-蛋白复合体,这些蛋白复合体在建立和维持表(来源：淘豆网[/p-3290852.html])观遗传沉默中发挥重要作用[3]。PcG 复合体主要通过组蛋白甲基化修饰抑制其靶基因的转录,这种转录抑制与动物干细胞的维持和分化、哺乳动物 X 染色体失活、细胞衰老、细胞命运决定和细胞癌变等密切相关[5-7]。植物 PcG 蛋白也参与了干细胞的维持与分化、细胞命运决定同时在种子发育、花发育和春化作用相关基因表达过程中起表观遗传调控作用[2, 8-10]。对 PRC 复合体的研究在果蝇中最为深入。果蝇 PRC2 复合体含有四种核心蛋白:SET组蛋白甲基转移酶 Zeste 基因增强子 E(Z)、含 WD40 结构域的多余性梳蛋白(extra e,ESC)、组蛋白结合子 p55 以及 Zeste12 抑制子[SU (Z)12][11]。研究发现 PRC2 复合体的蛋白组分和功能在动物和植物中非常保守[11-12]。果蝇 E(z)基因编码的蛋白含有一个具有组蛋白赖氨酸甲基转移酶活性的 SET 结构域,是转录因子 Zeste 的增强子[Enhancer of zeste, E(z)]。植物(来源：淘豆网[/p-3290852.html])中发现的第一个 PcG 基因是拟南芥的卷叶基因 CURLY LEAF(CLF),其突变体表现出卷叶和花器官的同源异型转化等多种表型变异[13]。CLF 是果蝇 E(z)基因的同源基因,水稻基因组编码两个 E(z)同源基因,即 OsSET1/OsiEZ1/ OsSET15 和 OsCLF/OsSET24[14-17]。Liang 等最先从水稻 cDNA 文库中分离得到了一个编码含 SET 结构域蛋白的基因OsSET1[14]。洋葱表皮瞬时表达显示,OsSET1 蛋白定位在细胞核。在拟南芥中过量表达OsSET1 导致拟南芥幼苗期植株发育出现异常[14]。随后,Thakur 等人在籼稻中也克隆到一个编码含 SET 结构域蛋白的基因 OsiEZ1。该基因与 OsSET1 为同一基因,在籼稻花中表达量最高,在受精后 1-2 天的种子中几乎检测不到表达,但受精后 3-5 天表达水平显著升高。该基因编码的蛋白能够互补酵母端粒沉默突变体的表型[15]。研究表明,OsCLF /OsSET24 在水稻中呈组成型表(来源：淘豆网[/p-3290852.html])达[16-17]。但到目前为止,还没有关于水稻 E(z)同源基因功能和作用机理的报道。65 1 材料与方法1.1 试验材料本研究所用水稻材料为粳稻(Oryza sativa L.)品种中花 11(ZH11)。ZH11 野生型对照和转基因植株均种植于华南农业大学农场温室。用于 RNA 干涉载体构建的植物双元表达载体 pRNAi-Ubi[18]由华南农业大学刘耀光研究员惠赠,农杆菌(Agrobacrerrium70 tumefaciens)菌株 EHA105、大肠杆菌(Escherichia coli)菌株 TOP10F'及 DH10B 均由本室保存。1.2 试验方法1.2.1 总 RNA 提取和 RT-PCR采用 TRIzol 试剂(Life Technologies)提取相关野生型 ZH11 和转基因水稻植株7580的总 RNA,然后用 RNase-free 的 DNaseI(Fermentas)去除总 RNA 中可能残留的 DNA,之后用 AMV(TaKaRa)将去除了 DNA 的 (来源：淘豆网[/p-3290852.html])RNA 反转录成 cDNA,以上反应体系和反应条件均按厂商提供的试剂盒说明书进行。以反转录得到的 cDNA 为模板,利用基因特异引物进行半定量 RT-PCR 扩增以检测 OsSET24(所用引物为 OSI-1F: 5'-ttctgggtgggatg -3'和OSI-1R: 5'- acagtatttct -3')的时空表达特性和获得构建 RNA 干涉载体的干涉片段(所用引物为 OSI-RNAi-F: 5'-aaaaGGATTCtgaagattgcataattcg-3'和 OSI-RNAi-R:5'-t-3',下划线碱基序列为添加在引物上的用于干涉片段装载-2-的 BamH I 和 Hind III 酶切位点)。半定量 RT-PCR 分析均以 OsActin1 为内参基因(扩增引物为 actP1: 5'-CGTCTGCGATAATGGAACTG-3'和 actP2:5'-TCTGGGTCATCTTCTCACG(来源：淘豆网[/p-3290852.html])A-3')。85 1.2.2 RNA 干涉载体的构建及鉴定干涉片段和质粒 pRNAi-Ubi 经 BamH I 和 Hind III 双酶切后用 T4 DNA 连接酶连接后(TaKaRa)转化大肠杆菌菌株 Top10F′,经测序(引物为 RNAi-F1:5'-ggatgatggc atatgcagcag-3')鉴定正确的重组质粒即为正向装载了干涉片段的中间载体 pRNAi-Ubi-1;随后以该中间载体的重组质粒为模板,用引物 RNAi-Mlu I(5'-tgACGCGTggtgttacttctgaagagg-3')9095和 RNAi-Pst I(5'-atggtcg-3' )进行 PCR 扩增得到在干涉片段两端添加了 Mlu I 和 Pst I 酶切位点(引物序列中标有下划线的位置为其识别位点)的反向装载干涉片段。反向干涉片段和中间载体 pRNAi-Ubi-1 经 Mlu I 和 Pst I 双酶切纯化回收后用 T4DNA 连接酶连接后(来源：淘豆网[/p-3290852.html])转化大肠杆菌 DH10B,重组克隆经 BamH I 单酶切验证和测序(测序引物为 RNAi-R2:5′-cgatctagtaacatagatgacac-3′)鉴定正确后即为用于水稻遗传转化的pRNAi-Ubi-2 重组质粒。1.2.3 转基因 T0 代阳性植株的鉴定和表型分析利用农杆菌介导法[18-19]将 OsSET24 的 RNA 干涉载体 pRNAi-Ubi-1-2 转化 ZH11 成熟胚经诱导和继代得到的胚型愈伤组织,侵染后的愈伤组织以潮霉素为筛选剂,经过共培养、筛选、分化和生根培养后获得 T0 代转基因植株。转基因植株的检测主要参考刘巧泉等[20]的方100105法,即在分蘖盛期,每株剪取一段 1.5 cm 长的叶段(两端均带伤口),立即浸入含有 50 mg/LHygromycin B + 1 mg/L 6-BA 的水溶液中,自然光周期下筛选 3-5 天,统计叶片坏死情况。将潮霉素浸泡筛选呈阳性的植株提取叶片 DNA,利用潮霉素基因特异扩增引物 HPT-F(5'--3')和 HPT-R(5'-gctttcagcttcgatgtagg-3')进行 PCR 鉴定,以确定其可靠性。转基因阳性 T0 代植株依照大田生产栽培条件种植,经自交先后获得 T1 和 T2 代种子。对中花 11 和不同转基因株系 T0 代的表型如株高、结实率和籽粒大小等进行了观察和统计分析。成熟株株高调查以植株地上部基部至最高穗顶端的长度为株高。在水稻黄熟期,随机选取野生型 ZH11 和三个转基因株系的植株个一株,每株取 3 个分蘖分别量取地上部分 4个伸长节间的长度,进行节间长度分析,计算相对长度,进行比较分析。各节间相对长度%=(各节间长度/四个茎节总长度)×100%。110 2 结果与分析2.1 OsEZ1 的表达模式分析本研究通过半定量 RT-PCR 方法分析了 OsSET24 的时空表达模式。分别提取野生型ZH11 生长 14 天幼苗的根、幼茎(除去幼根和幼叶的部分,实际为叶鞘)、幼叶;灌浆期植株的根、倒一茎节、剑叶以及从孢原细胞时期到成熟花粉期的不同发育时期的小穗总115 RNA,反转录得到 cDNA 后利用引物 OSI-1F 和 OSI-1R 进行半定量 RT-PCR。以 OsActin1为内参基因的扩增结果表明,OsSET24 在所检测的所有组织器官中均表达,但在四分体到二核花粉期的小穗以及成熟剑叶中表达量较高,表明该基因虽然是一个组成型表达的基因,但在不同发育时期和器官中表达量存在差异(图 1)。-3-120图 1 OsSET24 在粳稻中花 11 中的时空表达模式Fig.1 The expression pattern of OsSET24 in japonica rice Zhonghua11幼根、幼茎和幼叶来自生长 14 天的幼苗;成熟根、茎和叶为灌浆期植株的根、倒一茎节和剑叶;其余样品为不同发育时期的小穗。1252.2 OsEZ1 基因 RNA 干涉载体的构建本实验选择的 RNAi 载体为 pRNAi-Ubi,在构建中间载体 pRNAi-Ubi-1 时,以 ZH11 的cDNA 为模板经 RT-PCR 扩增得到约 500 bp 的干涉片段(图 2A),然后用内切酶 BamH I和 Hind Ⅲ将扩增出来干涉片段与 pRNAi-Ubi 相连,菌落 PCR 检测得到重组克隆(图 2B)。130135经测序验证序列正确的重组质粒 pRNAi-Ubi-1 用于反向干涉片段的组装。以中间载体pRNAi-Ubi-1 为模板,由通用引物 RNAi-Mlu I 和 RNAi-Pst I 进行 PCR 扩增得到反向干涉片段(图 2C),再由 Mlu I 和 Pst I 酶切反向干涉片段和中间载体,酶切产物回收进行连接,BamH I 单酶切对转化得到的克隆进行鉴定表明目标片段已成功连接到载体上(图 2 D)。重组质粒的测序结果表明,OsiEZ1 基因的 RNA 干涉载体 pRNAi-Ubi-1 已构建成功。经过鉴定的重组质粒通过电激法转化农杆菌菌株 EHA105,之后通过 BamH I 单酶切对农杆菌内的重组质粒的稳定性进行了鉴定,酶切鉴定结果与图 2D 相同,说明重组质粒在农杆菌中能稳定复制,可将其用于水稻的转化。140 图 2 OsSET24 基因 RNA 干涉载体的构建和鉴Fig. 2 Construction of the RNA interference vector of OsSET24A:正向干涉片段的 RT-PCR 扩增;B:正向干涉片段装载的重组克隆菌落 PCR 检测;C:反向干涉片段的 PCR 扩增;D:OsSET24 基因 RNA 干涉载体的 Bam HI 单酶切检测145 2.3 转基因 T0 代植株的分子鉴定和表型分析利用农杆菌介导法将 RNA 干涉载体转入了野生型 ZH11 的愈伤组织,经过共培养、抗性愈伤组织筛选、分化和生根后得到的再生苗经潮霉素筛选共获得了 42 个株系共 89 株 T0-4-代抗性植株,同一块抗性愈伤组织的转基因植株暂定为同一个株系。为了进一步确定潮霉素离体叶片筛选的可靠性,用 SDS 微量抽提法分别抽取转化苗基因组 DNA,以非转化的植株150 基因组 DNA 为对照,用 HPT-F、HPT-R 为引物,对不同转化植株进行潮霉素基因的 PCR扩增,部分电泳结果见图 3A。图 3A 所示的转化苗样品均能扩增出大小约 0.7kb 的目的片段,而作为对照的非转化水稻 DNA 样品则无法进行有效没有扩增,说明外源片段已整合进入植物基因组。155图 3 T0 代转基因植株的分子鉴定Fig. 3 Molecular characterization of T0 transgenic rice plantsA:T0 代转基因阳性植株的潮霉素基因(Hpt)的 PCR 检测,其中 ZH 为野生型中花 11,1-15 为不同的转化再生植株;B:定量 RT-PCR 检测 T0 代转基因植株内源 OsSET24 基因的表达,不同数字编号的泳道代表不同的转化植株,横杠前的数字代表株系,横杠后数字代表植株编号。然后我们利用半定量 RT-PCR 分析了 T0 代转基因植株孕穗期剑叶中内源 OsSET24 的表达(扩增片段不在干涉片段内,也不与干涉片段不重叠),部分电泳结果如图 3B 所示。在图 3 所示的 10 个株系共 14 株转基因植株中,与上样量对照基因 OsActin1 的表达量相比较,所检测的所有植株内源 OsSET24 的表达量与野生型 ZH11 相比均有不同程度的下调,表明已经达到了干涉内源 OsSET24 表达的效果。后续表型分析均选用内源 OsSET24 表达下调的转基因植株。2.4 转基因 T0 代植株的表型分析随后我们对 OsSET24 表达量下调的 T0 代和 T1 代 RNA 干涉转基因植株进行了表型观察。与野生型相比,绝大多数阳性转基因植株整株明显变小,包括株高和穗长均明显减少,部分株系(137-115)穗长只有野生型的一半,而每穗总粒数与野生型相比也有明显下降(表 1和图 1)。大部分株系抽穗期株高只有野生型植株的一半一下以下,从 24 cm 到 70 cm 不等,矮化程度高的株系往往伴随很低的结实率(从 2.3%到 16.5%不等,图 6A),而株高下降不多的株系(31-126)往往有较高的结实率,但穗长仍下降明显(表 1)。表 1 中花 11 和 OsSET24 基因 RNA 干涉植株的主要农艺性状Table 1 Phenotypic analysis of Zhonghua11 and T0 transgenic rice plants性状每穗总粒数结实率(%)ZH11100 ±15.6097.4 ±0. ±6.5116.5 ±0. ±14.112.3 ±0. ±3.6110.6 ±0. ±4.3682.3 ±0. ±16.825.3 ±0.05-5-穗长(cm)株高(cm)19.6 ±2.0583.4 ±4.6711.8 ±1. ±0.±0.±0.±1.2246.5注:表中数据均为平均值± 标准差(SD)。180正常水稻和矮化突变体根据节间伸长模式一般分为六种基本类型:N、dn、dm、d6、nl和 sh。其中 N 为正常品种,其他五种均为不同的矮化类型[21]。dn 是各节间均匀缩短,与 N型节间伸长模式相似;dm 倒二节特别短;d6 类型的特征是穗下节间占整个株高的 80%,而其他节间不伸长;nl 特征是有颈叶,倒一节间缩短而倒四节间较长,偶尔第六节间伸长;sh为倒一节间几乎不伸长,穗子包藏在剑叶叶鞘中。为了确定 T0 代矮化转基因植株的矮化模式,我们对野生型 ZH11 和三个株高低于 35 cm 的 T0 代 RNA 干涉株系(选取的株系内的不同植株表型基本一致)各 3 株成熟植株的株高、穗长和四个伸长节间的长度进行了测量和分析。如表 1 和图 1B 所示,与野生型 ZH11 相比,突变体的穗下各节间长度都有所缩短,且直径均变细,但突变体的节间长度分布模型与野生型 ZH11 基本相似,因此 OsSET24 基因的 RNA 干涉转基因植株表现的是 dn 型矮化。图 4 中花 11 和 OsSET24 基因 RNA 干涉植株的株高和伸长节间Fig. 4 Mophology of the mature plants and elongated internodes of Zhonghua11 and T0 transgenic rice plantsA:开花期中花 11 和转基因植株的外观,图中 ZH11 代表野生型植株,EZ1-i 代表转基因植株,标尺= 10 cm。B:黄熟期中花 11 和转基因植株的穗下四个伸长节间,图中 1-4 分表代表穗下倒一节间到倒四节间,每个数字下的两个节间左边为野生型 ZH11,右边为矮化转基因植株,标尺= 5 cm。表 2 中花 11 和 OsSET24 基因 RNA 干涉植株的伸长节间长度Table 1 The internodes length of Zhonghua11 and T0 transgenic rice plants株系倒一节间倒二节间倒三节间倒四节间实际长度(cm)相对长度(%)实际长度(cm)相对长度(%)实际长度(cm)相对长度(%)实际长度(cm)相对长度(%)ZH11Osi-1Osi-229.9 ±4.5111.8 ±2.1710.7 ±1.5055.1 ±6.2253.1 ±6.2649.4 ±3.6716.6 ±2.066.4 ±0.517.2 ±0.4030.7 ±3.8329.1 ±3.4433.6 ±3.726.4 ±1.06 11.8 ±2.362.9 ±0.46 13.3 ±2.782.5 ±0.52 11.6 ±1.491.2 ±0.15 2.4 ±0.531.0 ±0.20 4.5 ±1.071.1 ±0.12 5.4 ±0.93-6-Osi-3 13.9 ±0.65 59.7 ±3.94 6.5 ±0.79 28.0 ±2.63 2.2 ±0.47 9.3 ±1.78 0.7 ±0.10 3.0 ±0.47注:表中数据均为平均值± 标准差(SD)。2.5 转基因植株生殖发育的观察由于 PcG 蛋白家族记忆多影响植物的生殖发育,因此我们对多个株高明显降低的干涉转基因株系开花期的穗进行了观察,发现很多株系的小穗发育出现多种异常现象(图 5)。野生型水稻的小穗由中间的两性花和两侧的两朵退化小花组成,两性花由内外稃片、2 个浆片、6 个花药和一个雌蕊组成;而每朵退化小花只留下外稃位于两性花之下,常称作颖片。而 RNA 干涉植株同一个穗上的除了正常表型的小穗外,部分小穗表现出外稃和内稃闭合不完全,部分小穗一个或者两个颖片增大,也有部分小穗缺失了内稃;成熟花药观察发现有些小穗的花药卷曲;花粉育性观察表明,有的株系花粉可染率正常,但有的株系基本上没有成熟花粉;而转基因株系的小穗的与野生型相比明显变小(图 6)。以上结果表明,OsSET24基因的表达下调会影响植株的生殖生长。图 5 中花 11 和 OsSET24 基因 RNA 干涉植株的小穗表型Fig. 4 Mophology of the spikelets and seeds of Zhonghua11 and T0 transgenic rice plantsA:开花期转基因植株的部分穗形态,标尺= 5B:转基因植株的成熟种子,标尺= 5C-D:成熟小穗形态,图中 ZH11 代表野生型植株,EZ1-i 代表转基因植株,标尺= 2.5 mm。图中细箭头示颖片增大,粗箭头示内稃缺失220-7-图 6 中花 11 和 OsSET24 基因 RNA 干涉植株的穗和花粉育性Fig. 4 Mophology of the spikes and pollen fertility of Zhonghua11 and T0 transgenic rice plants245250A:中花 11 和转基因植株的成熟穗,标尺= 5B:转基因植株的成熟种子,标尺= 5C:成熟花药的花粉育性,标尺= 100 μm。图中 ZH11 代表野生型植株,EZ1-i 代表转基因植株。3 讨论我们的研究结果表明,OsSET24 基因的表达下调会影响水稻植株的营养生长和生殖生长,导致植株株高明显降低、种子变小以及小穗发育出现多种异常表型,这与其组成型的表达模式相吻合[16-17],同时也暗示该基因在水稻的生长发育中起关键的调控作用。研究表明,水稻 PcG 基因的突变通常导致多种表型变异,如植株矮化、胚乳发育和小穗发育异常等[22-26]。小穗发育异常主要包括退化的内稃、增大的颖片、雌蕊和雄蕊数目和形态的改变等。这些异常通常是由于 PcG 基因突变,导致其调控的靶基因,如同源异型基因的表达异常所致[22-26]。同时,植物 PcG 基因的突变通常导致导致胚乳发育出现异常。OsSET24 基因表达下调植株的小穗发育出现了退化的内稃和颖片增大的现象,但并未观察不同花器官的同源异型突变和胚乳发育异常,表明不同的 PcG 蛋白在功能上即有一定的保守性,同时每个基因又表现出一定的功能特异性。水稻 OsFIE2 基因在拟南芥中的异源表达会导致拟南芥种子变大[22],而该基因的下调表达会导致水稻种子变小[25],表明这一基因在种子发育中发挥重要作用。OsFIE2 和 OsSET24 基因编码的蛋白同属于 PRC2 复合体,它们如何协调互作控制种子大小及花的发育还有待于进一步的研究。作为同一个蛋白复合体中的成员,某一个基因的表达改变,往往可能导致复合体中其他成员的表达发生改变,从而会影响复合体的生化活性和靶基因的选择[27],暗示 OsSET24 基因可能通过一个精细的调控网络参与调控水稻发育。[参考文献] (References)[1] SCHWARTZ Y B, PIRROTTA V. b silencing mechanisms and the management ofgenomic programmes[J]. 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水稻OsSET24基因RNA干涉转基因植株的获得及分析 水稻 OsSET24 基因 RNA 干涉转基因植株的获得及分析#郑少燕,黄文达,刘振兰**540(华南农业大学生命科学学院,亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,广州510642)摘要:OsSET24 属于水稻多梳蛋白家族(b group, PcG)基因的一个成员。本文采用半定量 RT-PCR 方法...
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