禽流感HI实验方法_百度文库
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禽流感HI实验方法
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你可能喜欢禽流感抗原检测卡
&>&&>&&>&>禽流感抗原检测卡
产品名称：禽流感抗原检测卡
产品规格：20条/盒
快灵试纸基于胶体金免疫层析技术。检测时，样品中的抗原与胶体金包被的抗体结合形成抗原抗体复合物，并沿着试纸流向NC膜的另一端。当该复合物流到膜上的T区时，固定在膜上的特异性抗体捕获该复合物并逐渐凝集成一条可见的T线，未结合的胶体金抗体流过T区被C区的二抗捕获并形成可见的C线。C线出现则表明免疫层析发生，即试纸有效；T线出现则表明样品中含有病毒。
l&使用范围
快速筛查禽类分泌物中的流感病毒(AIV)。
l&交叉反应
与乙型病毒无交叉反应。
l&保存和稳定性
试纸卡于室温(&30℃)阴凉干燥处保存，不可冷冻，避免阳光直晒，自生产日期起18个月内有效。
l&测试步骤
1．用棉签蘸取眼、鼻或泄殖腔分泌物。
2．将棉签浸入样品稀释液，充分搅拌混匀后，静置少许时间，用一次性滴管取上清液。（样品若不能立即测试，应冷藏保存，超过24小时，应冷冻保存。）
3. 将未开封的试纸卡和检测样品恢复至室温。
4. 将试纸卡水平放置，用滴管向试卡孔缓慢逐滴加入3滴不含气泡的检测液。
5. 5分钟判断结果，10分钟后的结果仅作参考。
l&结果判断
阳性：C线显示红色色带，T线也显示红色色带，无论颜色深浅均判为阳性。
阴性：C线显示红色色带，T线不显示红色色带，判为阴性。
无效：C线不显示红色色带，无论T线是否显示红色色带，该试纸均判为无效。
l&注意事项
1．如果购买时发现过期，破损，污染，无效的产品，请在购买处进行更换。
2．所有试纸启封后1小时内使用。
3．本品为一次性产品，请勿重复使用。
4．请勿使用非本品随附的稀释液。
5．请勿使用自来水、纯化水及蒸馏水作为阴性对照。
6．如滴加检测液后30秒内，在测试窗口无液体移行，则再补加1滴检测液。
7．检测样品可能具有潜在感染性，样品和使用过的试剂应作为微生物危险品处理。
8．本试纸为兽医体外快速诊断工具，仅提供定性检测结果，应综合临床症状或其它常规检测方法进行确诊。
l&包装规格
10条/盒、20条/盒
【检测流程图】
【结果显示图】
1、现在的动物疫病感染方式越来越复杂，而是呈现多种疫病混合感染，疫病的感染症状也不典型，所以单靠临床经验判断没有太大的说服力。
2、感染初期或潜伏期，病毒含量较少，所以测不出来，建议过几天再测
2）快灵试纸和其他家试纸检测出的结果不符合？
1、&病毒上面有不同的抗原决定簇，在研发过程中，选用的特异性抗体都是对应不同的抗原决定簇，所以不能保证所有试纸厂家都是选用同一特异性抗体，也就有可能出现多个厂家的试纸结果不符合，好的试纸一定是选择了最具有代表性的特异性抗体。
2、&病毒在流行过程中，其抗原决定簇可能也会发生变异，不同地区流行的毒株可能存在病毒抗原漂移。因此同一品牌试纸未必能将某类病毒的各个变异型全部检出。
3、&各种试纸的灵敏度不一样，也会导致在病毒浓度较低时检测结果出现偏差。
4、&患病宠物处于患病初期时，体液内病毒浓度偏低，取样方式或时间的差异，均会导致试纸卡反应结果的差异。
3）抗原检测阳性的实际意义是什么？
答：能直接确诊动物病原的存在。临床治疗中也可对抗原进行间歇检测来观察使用药物对病原的影响。当然，刚注射疫苗不久的动物用试纸进行检测，结果也可能是阳性，但做为疫苗的抗原与具有攻击力的野毒在动物体内的浓度一般有较大差距，因此在T线反应颜色强度上也存在差异。如果是灭活疫苗，则在动物体内很快就被中和了，试纸也就检测不出了。
4）T线出现慢
答：若犬猫发病处于潜伏期，排泄的病毒量可能较少，相应采集溶液中的病毒浓度偏低。在反应开始的3-5分钟，T线可能呈现较淡，到10分钟反应结束后，线条会呈现的相对清晰。
5）&回流&现象
答：试纸反应完判定阴性结果，再放置一段时间后，T线处呈现出较模糊线条。因为当试纸样品液往吸水纸端的流速会逐步减慢，当溶液被吸水纸全部吸纳后，会出现缓慢的溶液回流。胶体金颗粒因此会出现物理性的非特异吸附或滞留，出现模糊的线，形成假阳性现象。这是胶体金回流现象造成，该结果无效。
6）T线消失
答：主要是样品中病毒浓度过高，样品稀释再测，效果就好了。病毒浓度过高时，胶体金抗体只能结合部分病毒形成红色复合物。当复合物流经T线时，其中的病毒被固定在T线的抗体结合捕获，逐渐形成红色线条。溶液中未被结合的游离病毒则与复合物中的病毒竞争T线的抗体结合位点，从而挤走红色复合物。因此红色线会逐渐变浅，甚至消失。
7）C线消失
答：可能患病动物经过鼠单抗的治疗，或食入老鼠时，因肠粘膜出血而吸收了鼠球蛋白，体内产生了针对鼠IgG的二抗。样品溶液中含有的该抗鼠二抗将干扰试纸卡的正常反应，从而出现C线消失的现象。
8）C/T线颜色差异大
答：试纸C线颜色深浅与病毒含量无关，只是T线免疫反应的一个参照。当C线出现时，无论颜色深浅，仅表示该试纸上抗体没有失活，反应有效。当C线不出现时，表示试纸受到了破坏，该反应无效。
&&&&&& 各品牌试纸胶体金技术不同，相同样品滴加后，不同试纸T线颜色也有适当差异。但T线颜色深未必表示检测灵敏度更好，因为不同试纸的T线颜色递减梯度曲线也不相同。
快灵其它畜禽疫病检测卡:血清中禽流感抗体含量的检测方法_百度拇指医生
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?血清中禽流感抗体含量的检测方法
现在做一实验，测定免疫后小鸡体内禽流感抗体含量，请问采集血液后如何测定血清中禽流感抗体含量，需要具体步骤和操作方法！邮箱
禽流感是由A型流感病毒引起的一种高度接触性传染性疾病。给世界养禽业造成了巨大的经济损失。禽流感病毒可分为不同的亚型，世界各地的禽流感主要由高致病性的H5和H7两种亚型引起，而人对其中的H1和H3亚型易感。快速诊断禽流感病毒具有重大意义。目前禽流感的实验室检测是比较快速、准确的方法。随着血清学实验技术和生物工程技术的飞速发展，禽流感诊断技术的研究也不断取得新进展。琼脂扩散试验、血凝和血凝抑制试验等常规方法的使用虽有一定的优势，但免疫荧光法和ELASA也日益显示出其快捷准确的特点：分子生物学的发展为核酸序列分析法的建立创造了条件,也使PCR，RT－PCR及核酸探针等检测技术成为可能。这篇文章就是对有关该病的诊断方法加以总结，并提出了认为比较可行的改进方法，旨在方便对禽流感做出及时而有效的诊断并采取相应措施。1. 病毒的分离鉴定无菌采集病料经处理后接种9－11日龄鸡胚，收取尿囊液测定血凝活性。若为阴性则应继续盲传2－3代。对具有血凝活性的尿囊液需先用新城疫(ND)抗血清做血凝抑制(HI)试验!以排除ND感染。然后用免疫扩散等方法来检测特异核心抗原，核糖蛋白(NP)或基质蛋白(MP)，再用血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验鉴定A型流感病毒亚型。分离鉴定的同时进行致病力试验，确定毒力强弱。但是流感病毒“O”相毒株不凝集鸡红细胞，故近来在流感病毒鉴定中常用豚鼠或人红细胞来代替。然而，该两种细胞无细胞核，沉积慢，一般在红细胞凝集及凝集抑制测定中需60分钟才能观察结果，同时在“U”型孔板中，很难沉积成像眼泪样的点即当中常有小空[1]。病毒的分离鉴定对禽流感的诊断比较确实,但操作程序繁琐、费用多、耗时费力。2. 血清学诊断技术2.1 琼脂扩散(AGP)试验进行病毒抗原型特异性鉴定即用已知阳性血清和末知抗原进行AGP试验。受检样品是具有血凝素活性的鸡胚尿囊液。AGP是用来检测A型流感病毒群特异性血清抗体，即抗核糖蛋白(RNP)和基质蛋白(MP)抗体，因而适用于鉴定流感病毒 。1979年Beard首次将AGP用于禽流感抗体检测[2]。此法虽简单易行，但是敏感性较差，易出现假阳性。AGP最常用的是免疫双扩散，赵增连、陈海燕等分别开展了禽流感病毒快速定型双扩散法的研究，不仅提高了其敏感度，且快速省时，在此方法基础上建立的AGP诊断技术及其诊断试剂盒，在全国范围内得到推广应用，并取得良好的效果。2.2 血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)一般情况下，新分离毒株要先鉴定出特异性NP或.MP抗原型(用AGP)确定禽流感病毒，再做HA亚型的鉴定[3]。现已有人采用改进HA试验方法，称为HA加敏法。该法测抗体效价比常规性高2－4倍，若抗原用乙醚裂解其敏感性比常规法高4－6倍，但观察时以30min内为好，否则易出现假阳性。另外，还应注意在HI试验时，应先除去特异性凝集反应。许多禽类血清都含有非特异性因子，能和红细胞表面受体竞争性地作用于病毒表面的血凝素而发生非特异性凝集反应。通常用受体破坏酶(RED)即霍乱菌培养液处理法或高碘酸钠法制备血清[4]。
HA、HI 特异性好，是亚型鉴定的常用方法，但其操作过程繁琐费时，并且由于用已知HA亚型的抗血清不能检出新的HA亚型的禽流感病毒，所以用该方法鉴定不如琼脂扩散实验简便和快捷。2.3 神经氨酸酶抑制试验(NIT)根据A 型流感病毒的表面抗原特性,特别是血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)特性，不仅可通过HI试验对病毒进行坚定，而且可通过NI试验进行鉴定。1983 R.A.Van.Densen介绍了NI试验的一种改进法－平板微量NI试验，此法虽不能提供常量法的定量，但却是A型流感病毒的病毒分类和抗体检测的快捷方法， 试验证明微量NI试验能对分离物做出准确鉴定而常量NI试验检测亚型混合物似更敏感[5]。目前国家兽医实验所已将微量NI试验列为流感病毒分离物定型及筛选畜禽血清9型NA抗体的常规方法，诊断中也已广泛采用此法特别是美国在80年代火鸡发生流感病毒期间，每次流行所得的血清样本用微量NI试验所作出的A型流感病毒亚型鉴定结果已为病毒分离、疫苗接种和流行病学资料所证实。这种方法已被证明是快速的且成本较低和有可重复性。这种技术的可靠性将导致NI试验的广泛应用。2.4 中和试验(NT)病毒中和实验技术是反映机体抵抗特定病毒感染能力的最可靠方法。流感病毒中和实验技术有以下优点：（1）由于中和抗体作用于流感病毒表面血凝素蛋白（HA），使流感病毒失去感染能力，因此，流感病毒中和实验主要用于检测血清中的特异性抗血凝素蛋白抗体。（2）流感病毒中和实验既能检测病毒株的功能性变化，又能反映机体的抗病毒水平。（3）该方法主要使用感染性病毒，不需要进行病毒或病毒蛋白的纯化，因此，可以被迅速用于检测新病毒或人群免疫状态[6]。以中和试验(NT)来鉴定或滴定流感病毒时常用鸡胚或组织培养细胞，操作方法与其他病毒(如NDV)的中和试验相同。病毒中和实验技术是一个相当复杂的过程，参与中和反应的因素有病毒、抗血清和宿主细胞。这些因素的变化都会影响中和实验的结果。因此，对中和实验的整个过程进行严格的质量控制。每次测定必须设立阳性和阴性血清对照，阳性和阴性细胞对照，以及对病毒使用剂量进行滴定。NT试验是最敏感而特异的血清学方法，只有抗体与病毒颗粒上的表面抗原相对应，特别是与吸咐到宿主细胞上的病毒表面抗原相对应，才能在实验中取得满意的显示效果。 因此，某一个血清型的中和试验抗体只与同组内地其他病原表现出有限的交叉反应。病毒中和试验操作繁琐耗时费料，临床上几乎不用。但作为经典方法在病毒鉴定中起着重要作用，许多新的检测方都要与之为标准进行比较[7]。2.5免疫荧光技术(IFT)免疫荧光技术就是荧光抗体技术(FAT)。 IFT早在1961年就开始用于人类流感的快速诊断。1984年滨西法尼亚州爆发禽流感时，Skeeles将IFT首次用于AIV的检测。IFT最早用于病毒的鉴定和定位病毒感染细胞中特异性抗原。主要是核内荧光:用MP抗原的荧光抗体主要出现胞质荧光，核内也有部分荧光[8]。用于禽流感病毒的诊断常用直接荧光抗体法即在组织触片上直接染色，以荧光显微镜检查荧光 。一种AIV的荧光抗体可用来检测不同亚型的其他病毒。IFT用于诊断具有快速、简便、敏感性好的特点，而且费用较低，其敏感度同病毒的分离鉴定相当，有时高于用鸡胚进行的病毒分离。但是需要注意的是如何避免和降低标本中出现的假阳性(非特异性荧光)问题。对一株杂交瘤细胞分泌的流感病毒的单克隆抗体进行检测时，发现间接固相免疫荧光技术的敏感性比HI 高40－150倍。间接免疫荧光技术也可以用来检测核蛋白(NP)基质蛋的(MP)抗原与抗体的反应，其敏感性很高。但对抗原制备要求较高，需用非离子型去污剂对纯化的病毒粒子进行裂解[9]。2.6 酶联免疫吸附法(ELISA)ELISA的基本原理是：酶结合物与相应抗体或抗原特异性结合，再遇酶底物时，在酶的强烈催化下使原来无色的底物产生化学反应，即形成有色的产物，便可用肉眼或分光光度计定量检测其含量。该方法具有特异性、敏感性、快速性和简易性等优点。在流感病毒微量中和实验中，酶结合物（HRP标记的羊抗鼠IgG抗体）与存在于MDCK细胞膜上的病毒核蛋白抗原-核蛋白单克隆抗体复合物结合，HRP酶催化OPD，使无色底物形成橙黄色化合物，再由ELISA检测仪测定吸光度值，从而获得中和抗体滴度[11]。1974年Jenning等首先用ELISA对注射流感病毒所产生的抗体消长规律进行了检测。Lanbre认为ELISA的敏感性远高于HI补给结合反应 。Meulemans(1987)对ELISA、AGP、HI检测AIV抗体进行了比较研究。发现AGP和ELISA一样均能检测型特异性抗原(抗体)，但敏感性远低于ELISA，HI适用于亚型的检测，其敏感性不如ELISA。1993 年Shodihall用混合纤维素脂膜或硝酸纤维素膜代替微量反应板，建立了快速诊断的DAS－ELISA大大缩短了诊断时间，并可保留ELISA的特异性、敏感性，其结果又不需要特殊仪器分析、可用肉眼判定。随着分子生物技术的发展，中国农业科学院哈尔滨兽研所的李海燕等用表达禽流感病毒核蛋白的杆状病毒感染S9昆虫细胞，以其表达产物制备抗原，建立了以杆状病毒系统表达的AIV核蛋白为抗原的禽流感间接(重组核蛋白)ELISA诊断技术(rNP－ELISA)确定了其最适工作条件，并对3138份鸡血清进行了检测。实验证明rNP－ELISA与全病毒间接ELISA(AIV－ELISA)，AGP及HI的符合率分别为99.9%、97.8%、98.8%，并能100%检出AGP阳性及疑似HI阳性的血清样品。 这证明了rNP－ELISA是检测A型禽流感病毒血清特异性抗体的一种特异、敏感、微量、快捷、经济的血清学诊断技术[11]。ELISA方法的敏感性和特异性与抗原的纯度直接相关 。1984年Abraham等报道了抗原快速提纯法，所需时间比常规法缩短10倍，并且研究结果表明应用提纯抗原几乎全部排除了假阳性反应。目前美国Kiregard Reery和Labortories有试剂盒出售。ELISA成为AI流行病学普查及早期快速诊的最有效和最实用的方法。3 分子生物学技术近年来，随着现代生物技术的发展，分子生物技术已被大量应用于禽流感的快速诊断。3.1聚合酶链反应(PCR)及反转录---聚合酶链反应(RT—PCR)PCR是近来发展成熟起来的一种体外基因扩增技术，能在数小时内使DNA呈指数增加。已成功地用于多种病毒的基因检测和分子流行病学调查等其检测原理为：寻找传染性因子的特异DNA序列。对待测样品进行PCR扩增， 如果检测出了相应的扩增带，则判为阳性反应；反之，无扩增带则为阴性反应。鉴于引起致病的禽流感病毒多是H5和H9血清亚型，在PCR技术的基础上，崔尚金等(1998)建立了一种直接检测禽粪样和鸡胚尿囊液中AIV—H9亚型RNA的RT－PCR反应，并将此法与AGP和电镜技术作了比较，结果表明引物的特异性决定了产物的特异性，并且该方法灵敏度高，检测过程仅需8h左右，并且大大缩短了感染后的检出时间。应用毛细管PCR(15min30个循环)代替常规PCR(2.5个小时30个循环)以进一步缩短检测时间的研究也已展开并进入更深入的领域，以期用于不同样品(组织、组织液、分泌液、粪便等)的检测，区分高致病力毒株和低致病力毒株与非致病力毒株，从而深入探讨该方法在AIV的临床早期诊断，流行病学调查及发病机制中的应用价值，为我国制定AIV的综合防制措施做出贡献[12]。3.2 核酸探针技术/核酸分子杂交技术这项技术是目前生物化学和分子生物学研究应用最广泛的技术之一，是定性和定量检测特异DNA或RNA的有力工具。核酸探针技术的原理，在进行杂交时，用一种预先分离纯化的已知DNA或RNA序列片段去检测末知的核酸样品，对作检测用的已知DNA或RNA序列片段加以标记的片段就称为核酸探针。作为核酸探针的DNA或RNA是各种病原微生物基因的一部分。 在变性分开的待检DNA或RNA单链中加入与其有互补作用的核酸探针。探针在一定条件下就能与原来变性分开的DNA或RNA单链上的互补区段形成氢键，从而结合成杂交双链，通过洗涤，除去未杂交上的标记物，然后进行放射自显影，即可确定原待检样品有无与探针互补的DNA或RNA序列。Bashiruddin等(1991)报道了扩增HA基因来分析致病毒株与非致病毒株的差异，证实了致病毒株与非致病毒株氨基酸的差异，显示了本方法的应用前景[13]。3.3荧光PCR法
利用生物学手段，用荧光PCR方法快速检测禽流感病毒的方法已在北京通过专家鉴定，这一研究成果不仅在国内属于首次，而且在国际上也属于先进水平。它与国际标准方法鸡胚病毒分离相比，不仅无需做鸡胚病毒分离培养，而且时间也由原来最短的21d缩短为4h。4 电镜技术由于流感病毒为正粘病毒，属于形态特征性强的病毒,因而可用电镜技术来诊断。为提高禽流感的检出率，除样品制备技术外，取病料的部位和时间也是获得准确检验结果的关键。病料的采集部位及取材时间应根据禽流感病毒在动物体内分布特征及其感染特性而定[15]。5 流感实验室检测中应注意的若干问题（高致病性流感病毒）（1）禁止在同一实验室，更不应在同一接种柜中，同时处理接种未知临床标本、已知阳性标本（2）禁止在同一实验室，同一时间处理，接种采自不同动物的标本；动物标本（如禽、猪等）必须与人的标本分别保存。（3）接种后剩余原始标本，尤其分离出病毒的标本需暂时冻存，有条件的应置-70℃或以下保存，以便需要时可进行复查，待分离物经国家流感中心鉴定完后方可处理掉。分离阴性的标本应随时弃之。（4）严禁实验室交叉污染：在病毒分离时严禁设阳性对照及操作在人群中已消失的流感病毒。（5）向国家流感中心送毒株时，量至少需5 ml，同时需自己保存一些，以便寄送过程发生意外时可继续补送。（6）流感病毒在-20℃～-40℃ 时不稳定，故不宜在此温度下长期保存。（7）鸡胚中分离出的流感病毒，应尽量别在MDCK细胞上传代。因当今国内所用的MDCK细胞属肿瘤细胞系，一旦病毒通过它传代就无法用于疫苗制备。（8）寄送毒株时一定需附上送检表。寄送毒株需及时，尤其鉴定不出的，异常的毒株应尽快向国家流感中心寄送。寄送时用快速直送国家流感中心[16]。总结使用常规方法检测禽流感及其抗体仍是目前世界上普遍接受的方法。这些方法包括病毒的分离、琼脂扩散实验鉴定病毒和测定特异性的血清抗体，血细胞凝集及其抑制试验鉴定病毒或血清抗体亚型。 采用鸡胚中和试验来鉴定病毒或血清抗体亚型也是一种可以接受的方法，但相对血凝抑制试验较为麻烦。随着科学技术的发展，检测该病毒和血清的方法出现了免疫光法和ELISA法，这些方都有快捷的特点，特别是日益完善并趋向成熟的ELISA检测方法,因其简捷、敏感、特异性强等优点而越来越得到广泛的重视和应用。随着分子生物学的发展，核酸序列分析法越来越可能成为一种更准确可行的方法,特别是它能从分子生物学的发展，核酸序列分析法越来越可能成为一种更准确可行的方法，特别是它能从分子水平揭示HPAIV甚至潜在HPAIV毒株。这种方法虽然在一般实验室还不能应用,但RT－PCR技术为从基因水平检测禽流感病毒RNA提供了灵敏、特异和快捷准确的方法。正在进行的应用毛细管PCR代替常规PCR，以进一步缩短检测时间的研究和根据禽流感NP的高度保守性而建立的rNP－ELISA检测法，不仅具有与AGP、HI同样的特异性，而且具有更高的灵敏性，可在微克水平上进行检测!都是很有前途的方法。将rNP－ELISA检测技术及其成套的成品试剂组装成诊断试剂盒，也取得了很好的实验效果。在以上各种检测方法及科学技术发展的基础上，将PCR技术与ELISA技术结合起来，建立一种新的实验室检测AIV的方法，将有较大的研究价值其实。其实验原理（以此类方法中最简单的双引物双标记法为例）如下：PCR的一对引物中!其中一种引物用生物素标记，另一种引物用地高辛标记，酶标微孔板上用生物素的亲和素包被(生物素的亲和素与生物素特异的结合)。PCR扩增后纯化片段加入微孔板中。此时，微孔板上包被的生物素亲和素将与引物上的生物素结合而捕捉了PCR片段，再在微孔板中加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，该抗体将与另一引物上的地高辛结合，从而形成生物素亲和素－生物素－PCR片段地－高辛－抗地高辛－酶的复合物。加入酶的相应底物进行显色，便可判断PCR扩增的有无。由于该方法是PCR技术和ELISA技术的结合，所以它是一种两级放大系统,即PCR放大和ELISA放大。故而它的灵敏度更高，同时这种方法避免了PCR产物分析时的电极及染色过程，所以更为快捷、简便、灵敏。
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标题: 血凝抑制试验(抗原,红细胞,血凝,反应板,血凝抑制试验,效价,病毒,稀释倍数)
摘要: 1.适用范围本标准规定了禽流感的血凝试验、血凝抑制试验。本标准适用于禽流感抗体的检测(主要适用于血清样品)。2 血凝试验2.1 材料与试剂2.1.1 器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、注射器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器及96孔V形血凝反应板。2.2.2 pH7.2磷酸盐缓冲液(PB……
1.适用范围
本标准规定了禽流感的血凝试验、血凝抑制试验。
本标准适用于禽流感抗体的检测(主要适用于血清样品)。
2 血凝试验
2.1 材料与
2.1.1 器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、注射器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器及96孔V形血凝反应板。
2.2.2 pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，配制方法参见附录A。
2.2.3 1%鸡红细胞悬液，配制方法参见附录B。
2.2.4 阿氏液，配制方法参见附录C。
2.2.5 标准禽流感病毒抗原，购入的标准禽流感病毒应检测其血凝效价并进行无菌检验，以检查与所标HA效价是否相符。若不符，应重复检测并到相关实验室验证。
2.2 操作程序
A. 取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1~12孔每孔加25 μL PBS，共滴8排，后四排的第1列孔再补加25 μL PBS。
B. 吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第1列孔中，吹打3~5次充分混匀。
C. 从第1列孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2列孔中，混匀后吸取25μL加入到第3列孔中，依次进行系列倍比稀释至第11列孔，最后从第11列孔各吸取25 μL弃之，设第12列孔为红细胞对照。
D. 自右向左依次向各孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。
E. 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min，室温(20-25℃)静置45 min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃静置60 min，红细胞对照孔成明显的纽扣状沉到孔底时即可判定结果。
2.3 结果判定
A. 在红细胞对照孔出现正确结果的情况下，将反应板作45°倾斜，观察红细胞是否完全凝集。以完全凝集的病毒最大稀释度为该抗原的血凝滴度。完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1个血凝单位(HAU)。
B. 最终结果取2倍、3倍倍比稀释抗原的血凝滴度的几何平均值。
3 血凝抑制试验
3.1 材料与
3.1.1 器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、煮沸消毒器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器及96孔V形血凝反应板。
3.1.2 pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法参见附录A。
3.1.3 1%鸡红细胞悬液配制方法参见附录B。
3.1.4 阿氏液，配制方法参见附录C。
3.1.5 4单位抗原，制备方法参见附录D。
3.1.6 HA效价高于10log2时可继续增加稀释的孔数。
3.2 操作程序
A. 根据血凝试验结果配制4单位抗原。以能引起100%血凝的病毒最高稀释倍数代表1个血凝单位，4单位抗原的的配制方法如下：假设抗原的血凝滴度为1:256(28)，则4单位抗原的稀释倍数应是1:64(256除以4)，稀释时，将1 mL抗原加入到63 mL PBS中即为4单位抗原。但是该4单位抗原必须经过验证(如附录D 4单位抗原的标定)后才可确定其稀释倍数，用于血凝抑制效价的测定。
B. 取96孔V形微量反应板，用移液器在第1~11孔各加入25 μL PBS，第12孔加入50 μL PBS。
C. 在第1孔加入25 μL被检血清，充分混匀后移出25 μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第10孔，第10孔弃去25 μL，设第11孔为病毒对照，第12孔为红细胞对照。
D. 在第1~11孔各加入25 μL 4单位抗原，轻叩反应板，使反应物混合均匀，室温20-25℃下静置30 min。
E. 自右向左依次向各孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。
F. 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min，室温(20-25℃)静置40 min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃静置60 min，红细胞对照孔成明显的纽扣状沉到孔底时即可判定结果。
3.3 结果判定
A. 在红细胞对照出现完全沉淀、病毒对照出现完全凝集的情况下，将反应板作45°倾斜，从反应板背侧观察。以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。
B. 当被检血清对其HI效价大于等于4log2，判为禽流感抗体阳性。
pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)配制
氯化钠(NaCl)
氯化钾(KCl)
磷酸氢二钠(Na2HPO4)
磷酸二氢钾(KH2PO4)
加蒸馏水至
将上述成分依次溶解，用盐酸(HCl)调pH至7.2，分装，121℃、15 min高压灭菌，一经使用，于4℃保存不超过3周。
1%鸡红细胞悬液配制
采集至少3只2~6月龄SPF公鸡或无禽流感和禽流感抗体的非免疫鸡的抗凝血液与等量柠檬酸钠溶液混合，放入中，加入3~4倍体积的PBS混匀，以1500 r/min离心5~10 min，去掉血浆和白细胞层，反复洗涤三次，最后吸取压积红细胞用PBS配制成体积分数为1%的悬液，于4℃保存备用。
阿氏液的配制
葡萄糖(C6H12O6．H2O)
柠檬酸三钠(Na3C6H5O7.2H2O)
柠檬酸(C6H8O7.H2O)
氯化钠(NaCl)
加水至100 ml，溶解，过滤，分装，121℃、30 min高压灭菌，4℃保存备用。
4单位抗原的制备
根据血凝试验测定的血凝效价，判定4个血凝单位的稀释倍数，并作复归试验。例如：病毒2倍倍比稀释时的HA效价为9log2，3倍时的HA效价为8log2，其4个血凝单位为6log2~7log2，则将病毒在96~128倍稀释。则可以假定90×，100×，110×，120×，130×为4HAU，分别再作2×、3×、4×、5×、6×稀释，每个4个孔，并作红细胞和病毒对照，依此做一次血凝实验，从而确定4单位抗原。判定时4×的半数100%凝集则为4单位抗原，1个100%凝集说明稀释倍数偏大，3个100%凝集稀释倍数偏小。
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