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现有一长度为3000碱基对（bp)的线性DNA分子，用限制性核酸内切酶酶切后，进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶H单
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现有一长度为3000碱基对(bp)的线性DNA分子，用限制性核酸内切酶酶切后，进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶H单独酶切，结果如图甲。用酶B单独酶切，结果如图乙。用酶H和酶B同时酶切，结果如图丙。该DNA分子的结构及其酶切图谱是[&&&&]A．B．C．D．
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12008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白”的三位科学家。将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个“融合基因”，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。下列关于该过程的叙述中，正确的是[&&&&]A．可以采用两种或两种以上的限制性内切酶分别同时切割运载体和含目的基因的DNAB．构建的基因表达载体可以让目的基因进入受体细胞而不被受体细胞内核酸酶降解C．导人受体细胞内的“融合基因”可视为一个独立的遗传单位D．利用该技术可以追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布2基因敲除是根据DNA重组原理发展起来的一门新兴技术。通常用设计好的DNA片段替代动物细胞内的基因片段，从而达到基因敲除的目的。运用基因敲除技术构建基因敲除动物模型是研究基因功能中较为普遍的一种方法，其基本原理如下图所示。请回答下列问题：(1)在将目的基因导人受体细胞前，需要构建一个基因表达载体。一个理想的基因表达载体，通常由启动子、终止子、目的基因和_______等四部分组成。在此过程中，所需使用的相关工具酶是________。(2)如果要获得一只含目的基因的小鼠，则选择的受体细胞通常为____，基因导人该细胞时，可以采用____等方法。(3)上述途径所获得的动物，其后代并非每一个个体都含目的基因，原因是____________。(4)假设通过基因敲除构建了一个非球形红细胞性贫血(Ⅱ型)模型动物，该动物因丙酮酸激酶缺陷或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)缺陷，使红细胞膜变化引起红细胞自溶现象，但若向该动物注射ATP后，自溶现象可明显降低。由此可表明，基因对生物性状的控制方式之一是：_______________。(5)某实验小组向正常小鼠胚胎细胞内导入某“X基因”后，发现靶基因能正常转录形成mRNA，但细胞内却不再合成相应蛋白质，其原因最可能是_____________。3养蚕人喜欢多养雄蚕，是因为雄蚕比雌蚕产丝量多，而消耗的桑叶又比雌蚕少。有人设想将海蜇的一种绿色荧光蛋白基因导入雌蚕体内，这样在幼虫刚从卵中孵化出时即可选出雄性幼虫来饲养，从而提高蚕丝产量。据此，请回答下列问题：(1)假定已经得到少量海蜇绿色荧光蛋白基因，并知道该基因两端的一部分核苷酸序列，则可以利用_____技术来扩增并获取该基因。该项技术中需要用到的酶是___________________。(2)将绿色荧光蛋白基因导入雌蚕体内的基本过程是：①．用同一种_______酶同时处理运载体和绿色荧光蛋白基因，构建基因表达载体；②．采用______技术将基因表达载体转入到从雌蚕体内获取的一个体细胞核中，再通过细胞核____获取含有绿色荧光蛋白基因且全能性好的重组细胞（相当于受精卵）；③．重组细胞经过培育获得能育的在紫外线下发出绿色荧光的雌蚕。为了在家蚕的后代中能较快的区分出雌雄虫，应将绿色荧光蛋白基因导人并整合到_______染色体上(蚕的性别决定类型为zw型，即雌蚕的性染色体为zw，雄蚕的性染色体为zz)。4下图表示叶片的光合作用强度与植物周围空气中的CO2浓度的关系，ce段是增大了光照强度后测得的曲线。请回答：(1)影响图中曲线ab段和bc段叶片光合作用强度的要环境因素分别是_______和_______。&(2)如在e点后再次增大光照强度，则曲线能否持续上升？_______，原因是_______。(3)为提高农作物的产量，除提高光合作用效率外，还需提高作物的抗寒抗逆性。研究发现在某些深海鱼中存在抗冻蛋白基因afp，对提高农作物的抗寒能力有较好的应用价值，通过基因工程可以将抗冻蛋白基凶afp导入植物细胞从而提高抗寒能力。该基因工程的核心步骤是________，利用_______技术可以获得大量目的基因。将目的基因导入植物细胞最常采用的方法是___________。
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当然不能吃，会传染病毒的。
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不是的,要是经过双氧水洗涤的话,洗完之后就无法再为DNA提供检测材料了
答: 如果孕妇喉咙痰多咳不出来该如何处理？前天外出吃了乳鸽，回来就开始喉咙不舒服痰很稠。
答: 任何人都会得。预防主要是不要吃脏东西，饭前便后要洗手。
答: 那就看你护理不护理了？你要是平时注意护理的话是不会再严重的，但是你要是不治的话也不好看啊？我脸上原来也有，后来就用祛红&搭档治好了！呵呵，要不你也试试这个吧！效...
答: 治疗：
1. 10％葡萄糖钙10毫升加维生素C0.5克静脉注射，每日一次。
2. 口服苯海拉明，扑尔敏，非那根，敏克静，塞庚啶，安他乐等。
3. 外用芦甘石洗剂...
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如何进行扩增酶切片段多态性[AFLP]技术
扩增酶切片段多态性（Amplified Restriction fragment polymorphism，AFLP）是由Zabeau等（1992）发明，并于1993年获得欧洲专利，该专利的专利权现在由荷兰Keygene公司拥有；被誉为新一代的分子标记技术。AFLP实质上是RFLP和RAPD的的结合和发展，它继承了RFLP的可靠性和RAPD的方便敏捷。AFLP只需要极少量的DNA材料，不需要Sourthern杂交，不需要预先知道DNA的顺序信息，实验结果可以提供大量稳定可靠的信息。同时，AFLP产物是典型的孟德尔方式遗传。AFLP的基本原理是对基因组DNA限制性酶切片段进行选择性扩增。首先用限制性酶产生基因组DNA酶切片段，然后使用双链接头与基因组DNA的酶切片段相连接形成扩增反应的模板。接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点。引物由三部分组成：①核心碱基序列，该序列与人工接头互补；②限制性内切酶识别序列；③引物3&端的选择碱基。选择碱基延伸到酶切片段区，这样只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增。扩增片段通过变性聚丙烯酰胺电泳分离检测。被扩增的DNA限制性酶切片段由二个限制性内切酶产生，一个为酶切位点较少的限制性酶（如EcoR I），另一个为多酶切位点的限制酶（如Mse I）。所以，AFLP反应的结果是主要扩增那些由上述两种酶共同酶切的片段。采用双酶切的原由是：①多位点酶切产生小的DNA片段，这些片段易被扩增且片段长短适宜在变性胶上分离；②切点数少的酶可减少扩增片段的数目。由于扩增片段是由多切点酶和切点数较少的酶酶切后产生酶切片段，这样就可选择扩增时所需的选择碱基数目限制在一定的范围内；③利用双酶切使对PCR产物的单链进行标记成为可能，从而防止胶上由于扩增片段双链迁移率不一致而造成的双带现象（doublets）；④双酶切可以对扩增片段的数目进行使活调节；⑤通过少数引物可产生许多不同的引物组合，从而产生大量的不同的AFLP指纹。AFLP技术包括三个主要内容：①模板的制备；②片段的扩增；③聚丙烯酰胺变性胶电泳分离检测。引物的设计对AFLP的成功与至关重要。引物的设计主要取决于人工接头的设计，接头为双链的寡核苷酸，其设计遵循随机引物的设计原则，应避免自身配对并具有合适的G、C含量。人工接头未进行磷酸化处理，所以只有一条单链被连接在酶切片段末端。Vos等发现扩增结果较好的引物都具有5&端以G碱基开始的特点，以有效地防止双链的形成，同时他们还发现引物3&端寡核苷酸的掺入受dNTP浓度的影响，无论5&端使何种碱基，dNTP浓度过低时双链结构容易产生。对于双酶切反应来说，引物的组合数共有（2n）2种（n为选择碱基的数目）。引物选择碱基的数目一般不超过三个，当引物具有一个或二个选择碱基时，引物的特异选择性较好，选择碱基增加到三个时，引物的选择特异性仍然不错，但随着引物选择碱基的增加，引物与模板的错配频率相应增加，扩增的特异性发生下降。在利用AFLP技术分析较为复杂的基因组时，扩增反应分为两个步骤，先用单选择碱基引物进行扩增，然后再利用多个选择碱基（如3个）的引物进行扩增，这样既可以提高指纹图谱的清晰度，亦可减少非特异性扩增的发生。2 试验条件【药品试剂】5&RL+-Buffer：50mM Tris&Hac（pH 7.5）50mM Mg (Ac)2250mM KAc25mM DTT250ng/ml BSAEcoR I（Pharmacia）Mse I（N. E. biolabs）Mse I接头EcoR I接头10mM atpT4 dna连接酶&
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限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法
但注意枪头不要尽量沾带上溶液,减少体系损失!限制性内切酶的热失活热失活是终止酶切反应的一种简便易行的方法。大多数最适反应温度是37℃的酶在65℃下温育20分钟即可失活。一些在65℃下不能失活的酶如将温度升高至80℃,温育20分钟也可失活。下表注明了每种酶的失活条件。在50&l的反应体系中,37℃条件下,以0.5&g小牛胸腺DNA作为底物,加入5-10&l内切酶及相应缓冲液,反应60分钟,然后升温至65℃或 80℃温育20分钟进行热失活。在上述混合液中加入0.5&g底物DNA(通常为&DNA),调节温度至最适反应温度,温育60分钟。若琼脂糖电泳显示底物部分或完全被消化,则表明该酶没有完全被热失活。内切酶星号活性在非理想的条件下,内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列,这一现象称星号活性。有人提出,这种"星号"活性可能是内切酶的一种普遍特性(1),如果提供给相应反应条件,所有内切酶都会出现非特异性切割。NEB已证实下列酶存在星号活性:Apo I(2)、Ase I(2)、BamH I(3)、BssH II(2)、EcoR I(4)、EcoR V(5)、Hind III(1)、Hinf I(6、7)、Pst I(8)、Pvu II(9)、Sal I(8)、Sca I(2)、Taq I(10)、Xmn I(2)。酶识别特异性的改变受酶本身的性质及可能引起星号活性的反应条件影响。常见的引起酶识别改变的条件有:单碱基替换、识别序列外侧碱基缩短以及单链切刻(10)。Polisky等(4)对EcoR I的早期研究表明,在低盐浓度、高pH值条件下,EcoR I可能切割N/AATTN序列;最近,Gardner等(11)的研究表明,只要识别中心的四碱基序列(AATT)不出现A/T替换,EcoR I可以切割其它任何单碱基替代序列。大多数星号活性是可以控制的,做酶切反应时一般不考虑这方面的因素。只要在正常条件下,使用随酶提供的NEBuffer,NEB的酶就不会出现星号活性。下面列出了导致或抑制星号活性的因素。导致星号活性的因素:1.&&较高的甘油浓度(&5% v/v);2.&&酶与底物DNA比例过高(不同的酶情况不同,通常为&100 U/&g);3.&&低盐浓度(&25 mM)4.&&高pH值(&pH 8.0)5.&&存在有机溶剂(如DMSO、乙醇(9)、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane(12)等)6.&&用其他二价离子替代镁离子(如Mn
等)以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoR I比 Pst I对甘油浓度更敏感,而后者则对高pH值更敏感一些(2)。抑制星号活性的方法:1.&&尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。2.&&尽量避免有机溶剂(如制备DNA时引入的乙醇)的污染。3.&&将离子浓度提高到100-150 mM(若酶活性不受离子强度影响)。限制性内切酶保护碱基(不太懂):限制性内切酶识别特定的DNA序列,除此之外,酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基,这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的,被称为保护碱基。保护碱基常见于PCR引物设计时,为保护5` 端外加的内切酶识别位点,使酶切完全而添加。其次,在分子克隆时,选择载体的酶切位点也会碰到,相临的2个酶切位点往往不能同时使用,因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。保护碱基的具体设计可以可以看图:我有点不明白,上图是检测内切酶在切割不同寡核苷酸时的效率数据,怎么能作为保护碱基的设计用呢?我设计引物是随机设计保护碱基也切得很好呀?望楼主及战友们赐教的确,上图是检测内切酶在切割不同寡核苷酸时的效率数据,数据不仅考虑到末端碱基数量的影响,同时还考虑到了末端碱基组成对酶切效率的影响,唯一存在推敲的是,这些数据是使用&寡核苷酸&进行实验的数据。也就是说,保护性碱基的设计,除了要考虑&碱基个数&外,&碱基组成&也是要考虑的。当然,我们大多数战友,包括我自己,考虑最多的是&碱基个数&,对&碱基组成&的考虑通常是采用随机,或兼顾引物Tm及GC%上。因此,只考虑&碱基个数&是比较省事的选择,且似乎还没有出现问题,至少我的实验还没有出现因为&碱基组成&不当而影响酶切的事情。下表是引自TAKARA的,我个人觉得应该适合NEB、MBI、PROMEGA等其它的酶,它给出的结果仅考虑了&碱基个数&,对我们可能有帮助。我做了一次酶切,虽然有目的条带(载体和目的基因,目的基因不是很明显,相反在其下方的条带更明显),也就是说有杂带,请问这结果的肯能原因.我的菌株是从其他老师那里得来的,提取出来的质粒好象比理想的要大(理想4000左右,跑出来的比5000大).双酶切质粒载体很明显(pUC2700左右),就是目的基因1400位置比较模糊(还是有),900左右位置却更明显,而且下方还有杂带. 按道理不应该酶把目的基因切断. 请问可能的原因有哪些啊,怎么改进啊.谢谢了.1. &理想4000左右,跑出来的比5000大& && 质粒是否经过单酶切处理?如果只是简单的将质粒进行电泳,数据是不具有参考意义的。2. &目的基因1400位置比较模糊(还是有),900左右位置却更明显,而且下方还有杂带. 按道理不应该酶把目的基因切断.& && 仔细分析一下酶切位点,确认除了外源片断两端外没有其它的内部切点。最好附图,这样可以更好的讨论问题。需要去掉质粒上eGFP后的中止子,用于融合表达,方法是:在eGFP片断的上下游分别设计引物做pcr后连接,上游加BamH1的酶切位点,下游加Bgl2的酶切位点(同质粒上的酶切位点,不能改).pcr没有问题,连接也有菌落长的很好,但是挑了40多个克隆,都是自连的,(我没有用碱性磷酸酶磷酸化质粒).BamH1和Bgl2的粘性末端是一样的,但是pcr都没有,所以考虑是自连.其他因素排除后,我觉得可能是引物合成出错导致pcr产物不能酶切,就又在另一个公司合成了引物,但是重新做的连接,挑了10个菌做pcr还是阴性.我现在怀疑是不是引物设计的问题了,我在酶切位点前面加的保护性碱基会不会影响酶切的效率.请高手帮忙看一下我的引物,谢谢上游: ATT GGATCC GGA TCT GCG ATC GCT CC下游: ATA AGATCT ACT ACT GCT TCC GTA CAG CTC GTC CAT GC(由于融合表达,加了几个弱性aa)限制性内切酶酶切注意事项在进行限制性酶切反应过程中,影响限制性酶切反应效果的因素较多,要设计酶切反应,一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。根据各种不同的条件,酶切反应的设计一般应注意以下问题:1. 大多数限制酶贮存在50%甘油溶液中,以避免在-20℃条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于12%时,某些限制酶的识别特异性降低,从而产生星活性,更高浓度的甘油会抑制酶活性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10,避免限制酶活性受到甘油的影响。2. 浓缩的限制酶可在使用前用1&限制酶缓冲液稀释,但切勿用水稀释以免酶失活,用水稀释的酶不能长期保存。3. 反应体系中Mg2 是限制酶仅有的共同因子,当用其它二价阳离子代替Mg2 或加入能螯合Mg2 的EGTA或EDTA时,酶活性会被抑制,或改变酶的特异性,导致星型反应。4. 多种因素可引发星型反应:①非最适的pH;②Co2 、Mn2 、2n2 取代Mg2 ;③酶浓度大于25u/④盐浓度降低;⑤高浓度甘油的存在(&12%);⑥有机溶剂的存在。5. 反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大,小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散,并降低酶活性。建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。6. 酶切反应所加入的酶量应适中,根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定,对不同的限制酶,各厂家均有一最大的消化量指标可参考。7. 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时,如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好,则两种酶可同时切割,如果这些酶所要求的缓冲液有所不同,则可采用以下两种替代方法:①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA,然后加入适量NaCl及第二种酶,继续反应;②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。8. 用同一种酶切割不同的DNA时,所需酶量不同,可根据DNA底物上酶切位点的多少与&DNA存在位点的数目比较后,决定用酶量。对于超螺旋DNA,基因组DNA、琼脂糖包埋的DNA,使用的酶单位活性应适当加大。9. 反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA,可维持酶的稳定性。10.酶切底物DNA应具备一定的纯度,其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、 yi mi,大于10mM的EDTA,去污剂SDS以及过量的盐离子浓度,否则会不同程度地影响限制酶的活性。11.DNA碱基上的甲基化修饰也是影响酶切的一个重要因素,所以转化实验所选择的受体菌株应考虑到使用的菌株中的酶修饰系统。12.要保证酶作用时的最佳反应条件(ph, 温度)和底物用量,酶反应才能有效地进行。13.反应取酶时应使用无菌吸头,以免污染酶液,同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。14.高于37℃或需长时间保温时,可加入矿物油覆盖在反应液上以减少水分蒸发。15.反应混合物混匀时,应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。16.反应前的低速离心是必要的,这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。17.用已硅化的离心管进行酶切反应,可获得更佳的酶切效果,否则DNA可能粘附于管壁而影响酶切效果。18.终止酶反应可根据需要采用不同的方法:①酶切后不需进行下一步反应,可加入含EDTA的终止液终止反应;②若需进一步反应(如连接,切割等),可将反应管置65℃保温20-30分钟,以灭活酶终止反应。③可用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀获得较纯DNA进行下一步酶学操作。19. 不同厂家的试剂不可混用,需要时请查明相关条件及数据。二、限制性酶解中常见的问题及解决措施:限制性酶切割DNA底物的操作过程中,会出现一些问题,产生的原因主要为酶解体系中各要素处于非最佳状态,包括DNA的纯度和特性,反应缓冲液、反应体积、反应时间及温度等。问题原因解决办法DNA完全没有被内切酶切割1) 内切酶失活。用标准底物检测酶活性2) DNA不纯,含有SDS,酚,EDTA等内切酶抑制因子。将DNA过柱纯化,乙醇沉淀DNA3) 条件不适(试剂、温度)。检查反应系统是否最佳?4) DNA酶切位点上的碱基被甲基化。换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解,重新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌株5) DNA酶切位点上没有甲基化(如Dpn I)。换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA(如San3A I代替Dpn I),重新将质粒转至dcm
dam 菌株中扩增6) DNA位点上存在其它修饰。将DNA底物与&DNA混匀进行切割验证7) DNA不存在该酶识别顺序。换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证DNA切割不完全1) 内切酶活性下降。用5-10倍量过量消化2) 内切酶稀释不正确。用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶3) DNA不纯,反应条件不佳。同上4) 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰。同上5) 部分DNA溶液粘在管壁上。反应前离心数秒6) 内切酶溶液粘度大,取样不准。将内切酶稀释,增大取样体积7) 酶切后DNA粘末端退火。电泳前将样品置65℃保温5-10分钟,取出后置冰浴骤冷8) 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性。使用标准反应缓冲液及温度,避免强烈振荡9) 过度稀释使酶活性降低。适当稀释酶液,反应液稀释的酶不能贮藏10)反应条件不适。使用最佳反应体系11)识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序。加大酶量5-10倍DNA PIAN段数目多于理伦值1) 内切酶星状活性检查反应条件:甘油浓度大于12%,盐度过低,Mn2 的存在及酶:DNA值过大均可导致星状活性,降低酶的用量2) 其它内切酶污染用&DNA作底物检查酶切结果3) 底物中含其它DNA杂质电泳检查DNA,换用其它酶切,纯化DNA pian段酶切后没有观察到DNA pian段的存在1) DNA定量错误(如RNA含量较高)用RNA酶A(无DNA酶)100ug/ml消化DNA样,酚抽提后沉淀溶解,定量2) 在酶切反应液中形成非特异的沉淀在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次内切酶保存期内快速失活1) 保存温度不合适内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中,应在-20℃低温保存2) 以稀释形式保存稀释酶液不宜长期存放,应一次使用3) 贮藏缓冲液不适当使用厂家推荐的贮藏缓冲液4) 低蛋白浓度内切酶与500ug/ml的BSA一起保存电泳后DNA PIAN段的带型弥散,不均一1) DNA上结合有蛋白质电泳前上样液65℃加热5min,并加入0.1%的SDS,酚/lv fang抽提纯化2) 内切酶中含有DNA外切酶减少酶用量或消化时间,换用新包装的酶酶切后的DNA pian段连接效率低1) 含磷酸盐的浓度高透析,乙醇沉淀去除磷酸盐2) 内切酶失活不全或含有ATP酶延长灭活时间或用酚抽提,乙醇沉淀回收DNA3) 平末端连接加大T4 DNA Ligase用量4) 外切酶污染减少酶用量,缩短保温时间,酚抽提回收DNA5) 连接缓冲液不合适重新配制
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胃癌晚期的症状是什么?在很多人的印象当中处于胃癌晚期的患者基本上就属于无法治疗的阶段,这是很多人存在的误区,如果对于胃癌晚期进行及时治疗的话,对于缓解患者的病情是非常有效果的,下面就让我们了解一下相关的情况。
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