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PCR扩增结果不稳定是何原因呢？？？
同一个样品的同一次提取的模板，用同样的引物，同样的PCR master mix，同一台PCR仪，一开始能扩增出条带，突然就不能扩增出条带了，然后啥都没变，过一段时间丫的又能扩增出目标条带了！这是要闹哪样呢？？？求大神指点迷津
PCR不出现扩增条带的原因与对策：
　　楼主的情况是不出现扩增条带，问题与解决如下：　　& & PCR反应的关键环节有:1模板核酸的制备，2缓冲溶液，3.酶的质量，4. 引物的质量与特异性，5.Mg2+ 浓度，6.反应体积的改变,7.物理原因，8.靶序列变异。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究,最后写出了调整顺序。　
　1.模板：(1)模板中含有杂蛋白质，(2)模板中含有Taq酶抑制剂，(3)模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，(4)在提取制备模板时丢失过多。(5)模板核酸变性不彻底。（6）反应体系是不是过大使得模板浓度过于稀释。（7）吸入了酚或者SDS。（8）反复冻融或者长期在冰箱的冷藏箱里，导致降解。
2. 酶失活或者专一性不够。
& &&&增加DNA聚合酶的专一性。
（1）改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。& &
（2）酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油，若此操作引起酶的浓度过高，可以适当加双蒸馏水稀释。
（3）为了加强Taq DNA聚合酶的专一性。 的专一性，可在反应体系中加入：1-1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以增加Taq DNA聚合酶的稳定性。
　　或者需更换不同种类的新酶。可以将新旧两种酶同时分别在不同的PCR体系中使用，以此分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。
　　需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。注意模板里是否含有酶的抑制剂，模板里是否含有酚。酶制剂里多含有甘油，酶的浓度大了甘油也会多，可能会抑制PCR反应。增加DNA聚合酶的专一性。
缓冲溶液：最好都是新配置的，类别浓度要正确别加错了，这步可能是太基本很不被注意。
　4.引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：(1)选定一个好的引物合成单位。(2)引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，需要调整引物的浓度，在反应时加入浓度基本相同的引物。(3)引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。(4)引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。（5）在引物的Tm范围内，选择较高的复性问题可以大大减少引物与模板的非特异性的结合，提高PCR反应的特异性。（6）引物3’末端用GC可以增加PCR的专一性扩增。　
　　　5.Mg2+ 浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。Mg2+ 浓度一般可能与的dNTP浓度存在同方向偶联效应。　　
6.反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20μL、30μL、50μL或100μL，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20μL 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
　　　　7.物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。没有重新设计引物，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。　　
　　8.靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
　　一般的调整顺序：若PCR反应后无任何产物，则使用全新配置的缓冲溶液，可先调整Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，调整时从低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。同时全部重新配所有的缓冲溶液。 然后调整引物浓度，在调整引物与模板的结合温度。再往后，检测和重新提取DNA模板（包括用质谱或者电泳检测DNA是否变短，清除酚和SDS，检测模板浓度，必要时要对DNA模板测序）、换成其他类型的DNA聚合酶和使用梯度降低dNTP。
　　调整的顺序不是完全固定的。一般是最先调整Mg2+ 浓度，最后重新设计引物，其他顺序可变。一般除非Mg2+ 初始浓度即很高，否则加高Mg2+ 浓度的同时一般可以大致相同比例地同时地调节dNTP的浓度。如果不是很确定dNTP的浓度是否合适时，可以先独立调节Mg2+浓度，而后是需要再调节dNTP的浓度。dNTP的浓度的决定不只有Mg2+浓度一种因素。在对应调节Mg2+浓度而调节dNTP的浓度后，还可以根据其他因素适当微调dNTP的浓度。
　　可以使用使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。
　　最后这些都做了仍未奏效，那么就要重新设计引物了。
PCR反应的灵敏性非常高，操作要求比较精确，实际的纯度要求也很高，可能楼主在以上步骤或涉及到的试剂不同批次的PCR操作时不一样，导致了有时PCR不出来。 以前有个师妹就遇到这样的情况，不知道楼主是不是用基因组作为模板pcr的，如果是的话，可以考虑做个模板量的梯度，可能会有所帮助:hand: 我也遇到过，你把模板冻融混匀后，进行4个10倍梯度稀释，再做一下这些梯度的模板的PCR，看结果怎样 : Originally posted by pengpeng7196 at
以前有个师妹就遇到这样的情况，不知道楼主是不是用基因组作为模板pcr的，如果是的话，可以考虑做个模板量的梯度，可能会有所帮助:hand: 好的，谢谢
var cpro_id = 'u1216994';
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求助：PCR扩增片段测序结果引物中间多出150bp的片段
用Taq酶从基因组中扩增基因片段转化后送测序，测序公司返回的测序结果显示在PCR上游引物中间多出了150个碱基的片段，测序公司的解释是引物特异性不好造成额外片段的引入。但是我用这对引物已经完成了cDNA里面扩增目的基因，并且构建了几个表达载体，每次PCR产物电泳都是单一的目标条带。求高手指点可能的原因，谢谢！！
引物中间多出了150个碱基的片段？灵异事件，占楼围观.... 嗯.........
我觉得并不是什么灵异事件哦，拿我某师妹最近遇到的情况：
她做克隆，CDS转入载体转化后挑了阳性菌送测，送测时多了个心眼，就送了电泳正确的两个阳性菌，最后测序结果出来，一个是正确的，另一个就是乱七八糟的东西，除了头尾引物扩增后的数百bp是正确的，中间有一堆都不知道是啥玩意.....亏的她还有聊的去BLAST了一下，发现跟人类啥啥啥基因还有挺高的匹配的（她自己语），所以最后我们假设了一番后取笑她：PCR的时候最好不要乱打喷嚏...........
所以，多送几个阳性去测，如果都是这番状况那就另当别论了，祝实验顺利:) 谢谢！送测的两个阳性克隆，测序结果是一个多了片段，一个少了一截。无语地继续送测中！ 我也遇到过，应该是测序公司的问题，重测就好了。 我觉得是引物特异性的问题，你用这对引物已经完成了cDNA里面扩增目的基因，并且构建了几个表达载体，每次PCR产物电泳都是单一的目标条带。只能说明对于cDNA模板来说特异性很强。但是基因组要比cDNA多出很多序列，这就不能保证你这一对引物扩增时的特异性了。
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pcr结果出不来，每次都是只有100bp以下的条带，没有其他的条带
我该从哪里找问题，其他地方没有任何条带.0附近;280都在2，且目的基因的这个条带比较粗亮：10xbuffer 5ul
2，是不是已经过期？还有用的各种试剂-20度如果过了半年了，还是目的基因，都是只在100bpmarker下有一个条带。94度 30秒
72度40秒 共40个循环。昨天换了新鲜组织刚扩了一个目的基因一个gapdh.5的dNTPs 4ul
10umol&#47，两个都是只有一条100bp下的条带，扩的gapdh应该在200bp左右，260&#47，RNA纯度分析每次结果都很好的。pcr体系是50l的引物个1ul
不管是扩gapdh
提问者采纳
如果扩增不出来，PCR程序还可以适当的调整，要么你就换一个基因试一试，100bp一下的那个条带，看看反转录后的产物是否有模糊成片的电泳条带，Mg2+用的是1，如果不行。首先确定反转录没有问题，说明你的引物合成的有问题呀，比如我做20ul体系的时候.2-1，扩增的非保守性越多，但是你现在gapdh多不出来，退火温度合不合适，一般的鉴定办法是扩增marker基因，不要一上来就用特别保守的酶，另一个就是反转录出问题了，或者你直接用随机引物试一试。遇到这样的问题应该一步一步的排除，那就看看是不是引物问题，Mg2+浓度越大，可以将buffer换成G buffer试一试首先试剂应该没有问题，基本上可以认为是引物二聚体，是否有些高，要么就是引物稀释时间有些长了。再看.4ul，做一个温度梯度试验可以解决这一问题，重新稀释，那么一个是你的引物有问题。另外。也不知道你做的是什么生物，比如actin，现在连作为marker的基因都扩不好，要么是引物没有设计好，可以试一试tuckdown的方法在PCR反应体系使用普通的rTaq（Takara）。再然后就可能是PCR条件的问题。如果没有问题
提问者评价
谢谢你的耐心解答thank you
so much！刚开始做太多的问题了，我可以加你qq么我的邮箱
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