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植物基因转化常用方法
来源:生物谷
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一 植物遗传转化的方法　　植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。二农杆菌介导的基因转化方法（一）农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制　　几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA结合，形成复合物，转化植物根部细胞。T－DNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。　　1. Ti质粒的结构　　在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。　　Ti质粒大约在160～240kB之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb左右。除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。
&&&&& 图11-21 Ti质粒的结构&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 图11-22& 表达载体pBIn19的结构
　　T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。　　　tms由两个基因组成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH）　　　tmr由一个基因组成iptz：　　　tmt由若干基因构成，合成稀有氨基酸衍生物，称为opines。它有三个成员：　　　octopine＝精氨酸与丙酮酸的缩合物　　　Napaline＝精氨酸与－酮戊二酸的缩合物　　　Agropine＝谷氨酸与二环糖的缩合物　　　据此可将Ti质粒分为三大类，感染的植物诱导合成这些有机碱，但不能利用它们，其分解酶基因在Ti质粒上，分解产物为氨基酸和糖类，供根癌农杆菌使用作为氮源及碳源。　　2.T-DNA的整合机制：　　T-DNA的详细整合机制尚不清楚，但有几个环节是明确的： 　　T-DNA切除由Vir区编码的特异性内切酶完成，分别在LB和RB的第三个碱基和第四个碱基之间产生缺口，并形成单链T-DNA。 　　T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不对称的，RB顺序与整合有关，而LB无关。 T-DNA的整合可以是单拷贝的，也可以是多拷贝的，成串联形式排列，但整合位点的特异性尚未确定。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 图11-23 T-DNA的整合机制
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（二）Ti质粒转化植物细胞的战略　　１ . Ti质粒的改造　　有以下理由使天然的Ti质粒不能作为表达载体使用：　　a. 生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长素和分裂素阻止了细胞再生长为整株植物，因此，必须除去生长素和分裂素基因。　　b. 有机碱的合成与T-DNA的转化无关，而且可能会影响植物细胞生长，因为有机碱合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必须去除有机碱合成基因（tmt） 　　c. Ti质粒约为200kb，重组操作非常苦难，也很难找到单一的酶切位点。 d. Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，为了使重组质粒DNA的大量扩增，须添加入大肠杆菌复制子。 加入植物细胞的筛选标记，如neor基因，使用植物细胞启动子及末端polyA化信号，加入多聚人工接头以利于外源基因的克隆。 植物中一般不存在质粒，为利用农杆菌的Ti质粒，发展了共整合系统和双元载体系统，避免了在大的Ti质粒上进行分子重组操作的困难。　　2. 植物细胞转化的共整合系统　　T-DNA克隆在大肠杆菌质粒上，含有E.coli的选择标记和植物选择标记Kmr。首先在E.coli中筛选重组分子，然后将重组质粒转化到农杆菌中，质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti质粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA重组分子整合到植物细胞染色体DNA上，Kmr筛选转化细胞。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 图11-24 共整合载体　　 3 . 植物细胞转化的双元系统　　目前T-DNA转化植物细胞的标准方法是双元系统，即穿梭质粒。插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。与共整合系统所不同的是，含外源基因的质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti质粒上的Vir基因，随后将穿梭质粒的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 图11-25 双元载体系统
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 图11-26 农杆菌转化植物细胞
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（三）改良植物性状的策略　　基因克隆技术提供了一种新的改良植物的方法，它可以直接的改变植物的基因型。有两种策略可以应用。　　1） 基因附加：通过添加1个或多个基因改变植物的性状。　　2） 基因扣除：利用基因工程技术使一个或多个植物已经存在的基因失活。　　灭活植物基因是通过反义技术来实现的。将外源基因反向的连接到载体中，当基因转录成mRNA后，与正常的mRNA是反向互补的。我们称这种反向互补为反义RNA，缩写为asRNA。　　反义RNA阻止原有基因表达的机理尚不明了，但可以肯定，正义和反义RNA之间的杂交与这一事件有关，可能双链的RNA很快被核酸酶降解 ，或者反义RNA阻止了核糖体与正义RNA的结合。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 图 11-27 反义技术的原理
1 基因附加的方法
我们以抗虫基因为例来说明。
1.1&&& 理想的杀虫剂
在农业生产中危害最严重的是昆虫。为了减少损失，一般使用杀虫剂。大部分杀虫剂没有选择性，杀灭害虫的同时也消灭了天敌，同时对生物圈中的其他生物产生影响，包括人，污染了环境。有一些生物生长在植物体内，可以避免农药的伤害。
理想的杀虫剂具有的特性:
它必须对害虫有害，但毒性应该有选择性，对其他生物无害。
杀虫剂能够必降解，作物收获后不存在残留，并且对环境无污染。
可以保护整个植株，不单单是地上部，免受害虫危害。
到目前为止，我们还未发现这样的理想杀虫剂，最相近的是来自于苏云金杆菌的δ-内毒素。
a)&&&&&& 苏云金杆菌的δ-内毒素
苏云金杆菌在孢子形成的过程中，细胞内形成杀虫晶体蛋白―称为δ-内毒素，其活性很强，有时要比有机磷毒性高80000倍，而且选择性很强，不同品系的细菌和成不同的毒蛋白。
在细菌中积累的δ-内毒素是无活性的前体，昆虫食用后，前毒素被蛋白酶消化后产生有毒性的蛋白，结合到昆虫肠道内，破坏表皮细胞，使昆虫不能进食，从而饥饿而死。不同昆虫中，晶体结构不同产生了特异性。
鳞翅目幼虫
鳞翅目和双翅目幼虫
苏云金杆菌并不是最近才发现的，早在1904年即开始使用，可以作为无公害的杀虫剂，但他很容易降解，所以要不断的补充，增加了农民的成本。因此研究者试图生产不需要连续补充的δ-内毒素，一种方法是利用蛋白质工程，修饰其蛋白结构使其更加稳定，另一种方法是通过基因工程是植物能够合成自己的毒素。
b) 将δ-内毒素克隆到玉米中
传统杀虫剂在玉米上效果较差，主要害虫是玉米螟，生物技术学家试图获得能合成δ-内毒素的玉米。
北卡莱罗纳Ciba-Geigy实验室使用Cry1A(b)内毒素，这是一个1155个氨基酸的蛋白，29-607位的片段具有毒性。Ciba-Geigy研究小组并没有使用完整的基因，只使用了前648个密码子，人工合成了这一片段，这样可以对原始基因进行修饰，使用玉米偏爱的密码子。原始基因中GC含量是38%, 而人工基因的GC含量为65%。
将人工基因连接到盒式载体上，后接一个来自于CaMV的多腺苷酸化信号，利用微粒轰击法将其引入玉米的胚中。胚胎长成植株后，利用PCR法鉴定。利用人工基因特异的片段作为PCR引物。
下一步工作就是利用免疫技术鉴定转基因植株是否合成了δ-内毒素，结果显示人工基因确实具有活性。不同植株中产生的δ-内毒素数量不同，从250-1750ng/mg总蛋白，这种差异是由位置效应引起的。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 图11-28& 位置效应
转基因植株是否对玉米螟有抗性呢？在田间条差了6个周，应用两条标准来衡量：害虫对植株总的危害，以及虫道的长度。转基因植株表现了较好的抗虫效果，对照虫道长度40.7cm, 转基因植株虫道只有6.3cm。
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1.2&其它的基因附加工程
在水稻、棉花、马铃薯、番茄和其它作物上也进行了δ-内毒素工程，获得昆虫抗性也不仅仅是指有着一种方法。蛋白酶抑制剂也是较好的选择，它可以一只昆虫肠道内的蛋白酶活性，阻止或减缓害虫生长，许多植物能产生蛋白酶抑制剂，如豇豆和common bean, 他们的基因已经被成功的转移到其他植物中，但一般蛋白的表达量比较低。这种抑制剂对甲虫的效果非常明显，所以对需要长期贮存的种子作物是一种很好的选择。
2、基因扣除
基因扣除这一词语不是很恰当，因为并不去除基因，只是让基因失活。有许多方法可以使基因失活，最成功的是反义技术。我们将以延长货架期的工程番茄为例进行说明。
2.1&&& 反义技术的原理
在一个反义实验中，克隆的基因是反向的连接到载体中，这意味着当克隆的基因转录成mRNA后，与正常的mRNA是反向互补的。我们称这种反向互补为反义RNA，有时缩写为asRNA。
一个反义RNA阻止原有基因合成表达产物，我们尚不清楚其潜在的机理是什么，但可以肯定，正义和反义RNA之间的杂交与这一事件有关，可能双链的RNA很快被核酸酶降解 ，或者反义RNA阻止了核糖体与正义RNA的结合。
2.2&&& 利用反义RNA延迟番茄果实的成熟
美国的Calgene公司和英国的ICI种子公司利用反义技术改造番茄，延长其货架期。
a)多聚半乳糖醛酸酶在番茄果实成熟过程中的作用
番茄从开花到收获需要大约8周的时间，第6周开始，果实的颜色和风味开始变化，此时成熟过程的基因开始启动，包括多聚半乳糖醛酸酶，使果实开始软化。运输过程中，造成伤害，降低了商品品质。
b)克隆多聚半乳糖醛酸酶基因
在1980s中期，ICI种子公司的生物技术部与Nottinghan大学合作进行了实验。从正常多聚半乳糖醛酸酶基因的5’端获得了一个730bp的限制性片断，包含了一半的编码序列，将植物的多腺苷酸化信号连接到片段的头部，CaMV启动子连接到尾部，插入Ti质粒pBIN19中。引入植物后，转录后形成了反义RNA。降低了多聚半乳糖醛酸酶基因的表达。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 图11-29 延迟成熟番茄的构建过程
pBIN19分子重组到根癌农杆菌中，用来侵染番茄茎断，转移到含kan的培养基中，再生形成了完整的植株。
实验的结果通过4个途径分析：
1、Southern杂交检测反义基因
2、Northern杂交检测反义基因的转录，利用只能与反义RNA杂交的单链探针。
3&&&&&&&& 反义基因对正义多聚半乳糖醛酸酶基因表达量的影响，通过与正义RNA的Northern杂交检测，使用与正义mRNA特异的探针。史研究显示，转基因植株的多聚半乳糖醛酸酶mRNA的表达量明显低于对照。
4&&&&&&&& 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，多聚半乳糖醛酸酶的表达量明显降低。
转基因果实虽然也在逐渐的成熟，但可以存放很长的时间。这意味着反义RNA虽然不能完全将多聚半乳糖醛酸酶基因失活，但可以有效的降低基因的表达量，延缓成熟过程。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 图11-30 转基因番茄PG酶活性的变化
三 病毒介导的遗传转化　　植物病毒广泛存在，而且不受单子叶或双子叶的限制。因此病毒作为植物基因工程的载体日益受到人们的重视。在已知300种特征清楚的植物病毒中，单链RNA病毒约占91%，双链DNA病毒、单链DNA病毒各占3%。RNA不适合于作为克隆载体，因为RNA的操作非常困难。在植物上已知有两种DNA病毒，花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus, CaMV）和双联体病毒（geminivirus），但都不是基因克隆的理想载体。　　花椰菜花叶病毒载体已用来克隆了一个基因进入芜箐甘蓝，有两个因素限制了其应用：　　1） 花椰菜花叶病毒基因组的大小，即使是切除了非必须序列，花椰菜花叶病毒载体的承载插入片段的能力还是有限的，只能插入很小的片段。　　2） 花椰菜花叶病毒的寄主范围非常窄，主要是芸苔属植物如芜菁、甘蓝和花椰菜等。　　二价病毒可能比较有潜力，侵染重要的作物，如玉米和小麦，然而在侵染过程中，二价病毒重新排列并删除部分序列，搅乱插入的DNA序列。这种病毒可引起破坏性的侵染，需要严格的防护，防止载体从寄主中逃逸侵染自然中的植物。所以花椰菜花叶病毒和二价病毒作为克隆载体还需要进一步的改造。
四 基因枪转化法　　农杆菌侵染双子叶植物获得转基因植株是非常成功的，自然界中的农杆菌只侵染双子叶植物，对单子叶植物不敏感。虽然通过添加乙酰丁香酮类物质可使农杆菌侵染单子叶植物，但单子叶植物的再生比较困难，因而农杆菌转化单子叶植物仍然是比较困难的。1984年，科学家发现，超螺旋结构的细菌质粒，虽然不能在植物细胞中复制，但可以重组整合到植物染色体内。受这一现象的启发产生基因直接转移技术。重组机制并不清楚。因为细菌质粒与植物DNA之间没有同源性。事实上整合是随机的发生在植物染色体的任何位点。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 图11-31 植物基因直接转移的原理
　　基因枪（particle gun）又称微弹轰击法（microprojectile bombardment, particle bombardment, biolistic)。最早是由Cornell大学研制的火药基因枪。1990年，美国杜邦公司推出了商品基因枪PDS-1000系统。基因枪的组成部分有：点火装置、发射装置、挡板、样品室、真空系统组成。基因枪转化的基本步骤如下：　　　 DNA微弹的制备　　　 DNA-微弹载体的制备　　　 靶外植体准备　　　 DNA微弹轰击　　　 轰击后外植体的培养　　基因枪转化率差异很大，一般在10-3~10-2之间。McCabe在大豆上高达2%，而有的报道仅有10-4。相对于农杆菌介导的转化率要低得多，而且基因枪转化成本高；嵌合体比率大　　遗传稳定性差。即使这样，该方法在单子叶植物上也有广泛应用，有如下优点：　　a) 无宿主限制，无论是单子叶植物和双子叶植物都可以应用。　　b) 受体类型广泛，原生质体、叶圆片、悬浮培养细胞、茎、根、以及种子的胚、分省组织、愈伤组织、花粉细胞、子房等几乎所有具有分生潜力的组织或细胞都可以用基因枪进行轰击。　　c) 可控度高，商品化的基因枪都可以根据实验需要调控微弹的速度和射入浓度，命中特定层次的细胞。　　d) 操作简便迅速。　　正因为基因枪这些优点，使基因枪成功的应用于：植物基因转化，特别是单子叶植物的转化；外源基因导入植物细胞器；种质转化（茎尖分生组织、配子体、胚胎细胞）。　　e) 植物基因表达调控研究。
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由来转基因植物的研究主要在于改进植物的品质，改变生长周期或花期等提高其经济价值或观赏价值；作为某些蛋白质和次生代谢产物的生物反应器，进行大规模生产；研究基因在植物个体发育中，以及正常生理代谢过程中的功能!转基因植物优点以植物作为生物技术的实验材料有其特定的优点，那就是植物细胞大部分都有全能性(totipotency），可以用单个细胞分化发育出整个植株。这样，经过基因工程改造的单个植物细胞有可能再生成一棵完整的转基因植株。这些『转化受体植物基因工程用作外源基因的转化受体有许多种，包括胚性愈伤组织(cai—lus）、分生细胞、幼胚、成熟胚、受精胚珠、种子和原生质体等。从这些受体细胞都可获得再生的转基植株。转化方法①农杆菌介导法农杆菌的Ti质粒可以作为载体。Ti质粒上有两个区域，一个是T-DNA区，这是能够转移并整合进植物受体的区段；另一个是Vir区，它编码实现质粒转移所需的蛋白质。将待转化的外源基因先克隆在大肠杆菌质粒上，然后将此质粒转入不会引起冠瘿瘤的农杆菌（这种菌的Ti质粒已除去了T-DNA），使外源基因通过同源重组整合在Ti质粒上；然后用带有外源基因的这种农杆菌去转化植物细胞，将外源基因转入植物细胞的基因组。②直接转入法这是将裸露的DNA直接导入植物细胞，然后将这些细胞在体外培养再生出植株。裸露的DNA的转化效率较低，因而要辅之以高效率的组织培养系统。植物细胞有一层很厚的细胞壁，因此需先去除植物细胞壁，使之成为原生质体，然后用来直接转入外源DNA。当然，也可用机械的方法将DNA直接注入植物细胞而毋须去除细胞壁，这类方法有用显微操纵仪把DNA直接注入植物细胞，也可在金属微粒上蘸涂了外源DNA，把它当作子弹，用“基因枪”轰击植物组织而进入植物细胞。③原生质体融合将不同物种的原生质体进行融合，可实现两种基因组的结合。也可将一种细胞的细胞器，如线粒体或叶绿体与另一种细胞融合，此时，是一种细胞的细胞核处于两种细胞来源的细胞质中，这就形成了胞质杂种（cybrid）。④花粉管通道法在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞中，并进一步整合到受体细胞的基因中，随受精卵的发育而成为转基因新个体。该方法是由中国学者在20世纪80年代提出的。中国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是采用花粉管通道法培育出来的。
转基因植物 -
随着人类认识的发展，转基因植物的种种潜在危害也逐渐被认识。具有高产、抗性强的转基因植物品种不断地被推广，势必导致品种的单一化和贫化。转基因植物的目的基因发生逃逸，亦即通过异花授粉与野生近缘种杂交，可能产生新的杂草。转基因植物由于抗性强，能适应各种恶劣环境，其中有些作物，它们的不少性状与它们的杂草化的祖先是共同的，因此，某些遗传的改变可能使作物本身成为杂草。如高度抗盐的转基因水稻品种就可能侵入到港湾中大量繁殖起来成为杂草。转基因植物是自然界本身并不存在的植物，因此对于一个生态系统来说，转基因植物的进入就相当于外来种的侵入。面对转基因植物的可能危害，国际上提出生物安全问题。我国也制定了有关法规，按照潜在危险程度，将基因工程分为四个等级，采取不同的管理措施。
转基因植物 -
意义植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。随着现代生物技术的迅速发展，植物转基因技术方兴未艾。自从1983年首次获得转基因植物后，至今已有35科120多种植物转基因获得成功。1986年首批转基因植物被批准进入田间试验，至今国际上已有30个国家批准数千例转基因植物进入田间试验，涉及的植物种类有40多种。农作物生物技术育种的研究已经不再处于实验室阶段，而是进入了实际应用，走到了商业化阶段。转基因植物在全球的种植面积增长迅速，种植转基因植物的国家从1992年的1个增长到1996年的6个，1998年9个，1999年进一步扩大到12个国家。全球转基因植物的种植面积1996年仅为170万公顷，1997年为1100万公顷，1998年增长到2780万公顷，1999年又比1998年增长44%，达到3990万公顷。美国转基因植物的商业化速度进展很快，其推广应用走在其它国家的前列。1994年美国Calgene公司研制的转基因延熟番茄首次进入商业化生产，到1998年底就有30多例转基因植物被批准进行商业化生产。1999年全球转基因植物种植面积中，美国就占72%，达2870万公顷；其次是阿根廷670万公顷；占17%；加拿大400万公顷，占10%；中国名列第4位，1999年种植面积达30万公顷，占1%，其他国家的种植面积都小于1%。种植的转基因植物种类主要有：大豆（占54%），玉米（占28%），棉花（占9%），Canola油菜（占9%），马铃薯、西葫芦和木瓜的比例都小于1%。按转基因植物的性状划分，抗除草剂占71%，如抗除草剂的大豆（54%）、Canola油菜（9%）、玉米（4%）和棉花（4%）：抗虫转基因植物占22%，主要是抗虫玉米（19%）和抗虫棉（3%）；抗虫兼抗除草剂占7%，主要是抗虫兼抗除草剂的玉米（5%）和棉花（2%）；抗病毒和其它性状转基因植物的比例小于1%。转基因植物的产业化，尤其是转基因农作物的产业化，由于提高产量、减少除草剂、杀虫剂等农药使用量和节约大量劳力，而带来巨大的经济效益和社会效益，全球转基因植物的销售额成倍增长，1995年仅7500万美元，1996年增加了3倍达2.35亿美元，1997年和1998年继续增长，到1999年达到21∽23亿美元。发展在国家“863”高新技术研究与发展计划及国家科技攻关计划的资助下，中国转基因植物的研究和开发取得了显着的进展，有些研究已经达到国际先进水平。据1996年国生物技术学会统计，中国投入研究和开发的转基因植物达47种，涉及各类基因103种有近20种转基因植物进入了田间试验或环境释放阶段。至1999年，农业部批准可进行商业化生产的国内研制的转基因植物有5种，它们分别是：抗虫棉花、改变花色的矮牵牛、延熟番茄、抗病毒的甜椒和番茄。研究工程在国家"863"计划的支持下，中国农业科学院生物技术研究所成功地人工合成和改造了植物抗虫害的Bt基因，获得了高抗棉铃虫的转基因棉花品种和品系。此外，中国农业科学院棉花所、南京农业大学和山西省农科院棉花所等单位还以转基因抗虫棉为亲本，育成了一批抗虫能力在80%以上，单产比主栽品种高15%以上的转基因抗虫杂交棉组合。拥有中国自主知识产权的抗虫棉花的育成和大面积推广应用，标志着中国转基因植物研究开始进入产业化发展阶段。为了有效控制水稻害虫的危害，中国农业科学院生物技术研究所和华中农业大学合作成功地获得了转Bt基因杂交水稻，对二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟的毒杀效果达到95%。浙江农业大学（现已并入浙江大学）也成功地将Bt基因导入水稻早稻品种。转Bt基因抗螟虫水稻已进入环境释放阶段。中国科学院遗传所研制成功的转CpTI基因抗虫水稻也分别获准在北京、福建和山西进入中间试验和环境释放。此外，中国农业大学研制的转基因抗玉米螟玉米、复旦大学遗传所研制的转基因抗褐习虱水稻、中国科学院微生物研究所和中国林业科学院林研所研制的抗虫转基因杨树也都进入环境释放阶段。抗病基因工程中国农业科学院生物技术研究所已成功地人工合成和改造了来自天蚕蛾的抗菌肽基因，并导入中国马铃薯主栽品种米拉，获得抗病性提高I∽Ⅲ级的抗青枯病的转基因株系，现已经农业部批准在四川省进行环境释放。抗菌肽基因已经供给国内10多家研究单位，进行抗水稻白叶枯病、马铃薯软腐病、花生和番茄的青枯病、大白菜软腐病、柑桔细菌性溃疡病、桑树和桉树青枯病、樱桃根肿病等抗细菌病基因工程研究。白叶枯病也是危害水稻生产的最为严重的病害之一。中国农业科学院生物技术研究所与国外合作研制成功的转Xa21基因抗白叶枯病水稻明恢63株系已分别在安徽省和海南省进行环境释放；华中农业大学和中国科学院遗传所研制的转Xa21基因抗白叶枯病水稻也分别进入中试阶段。真菌病也是严重影响农作物生产的一类病害。中国农业科学院生物技术研究所与中国科学院上海植物生理研究所等单位合作，成功地克隆和修饰了植物来源的几丁质酶基因和葡萄糖氧化酶基因，通过花粉管通道法分别将这两个基因导入棉花，获得了抗黄萎病和枯萎病和枯萎的转基因棉花，这些株系在病圃中表现良好，现已进入中试阶段。在抗病毒的基因工程方面，国内也取得了很好进展。北京大学克隆了烟草花叶病毒TMV、黄瓜花叶病毒CMV、马铃薯X病毒等中国株系以及水稻矮缩病毒的外壳蛋白基因，研制成功的抗黄瓜花叶病毒甜椒和番茄都已经分别在云南和福建进入中试或环境释放。中国农业科学院油料研究所研制的转基因抗条纹病毒花生、北京市农林科学院蔬菜研究中心育成的抗芜菁花叶病毒白菜和新疆农科院核技术生物技术所获得的抗黄瓜花叶病毒转基因甜瓜都已分别进入中试。此外，国内一些研究单位还获得了抗环斑病毒（PRSV）的番木瓜，抗黄矮病和黄花叶病毒的小麦等抗病毒病的基因工程植株。植物抗逆基因工程中国在抗盐基因工程上已取得了一些进展，先后克隆了脯氨酸合成酶（proA），山菠菜碱脱氢酶（BADH），磷酸甘露醇脱氢酶（mtl）及磷酸山梨醇脱氢酶（gutD）等与耐盐相关基因，通过遗传转化获得了耐1%NACL的苜蓿、耐0.8%NACL的草莓及耐2%NACL的烟草，这些转基因植物已进入田间试验阶段。中国科学院遗传所将BADH基因导入水稻，获得的转基因水稻有较高的耐盐性，并能在盐田中结实。植物品质改良的基因工程北京大学已将编码必需氨基酸的基因转入马铃薯，获得含高必需氨基酸的马铃薯品系，这些品系已在内蒙试种，正准备进入中试开发。中国农业大学成功地将高赖氨酸基因导入玉米，获得的转基因玉米中赖氨酸含量比对照提高10%。在控制植物发育的基因工程中，较为成熟的技术延迟成熟番茄的研究。华中农业大学和中国科学院植物所分别获得了这种转基因番，贮存时间可延长1∽2个月，有的可达80多天。1997年农业部基因工程安全委员会已批准这种耐储存番茄进行商业化生产。中国农业大学利用反义基因技术培育的耐储存番茄新品种已进行环境释放。北京大学成功地将与植物花青素代谢有关的查而酮合酶基因导入花卉植物矮牵牛，转基因矮牵牛的花色呈现自然界没有的变异，提高了花卉的观赏价值。转基因兰花和转基因非洲菊的研究工作正在进行中。植物叶绿体基因工程中国农业科学院生物技术研究所在国内较早开始进行植物叶绿体遗传转化研究。1996年建立了烟草叶绿体遗传转化体系，并成功地将Bt基因导入烟草叶绿体中，转基因植物杀虫效果显着]。他们还将固氮酶基因（nifH和nifM）、抗剂基因（bar基因）和绿色荧光蛋白（GFP）基因导入了烟草叶绿体。植物生物反应器利用转基因植物作为生物反应器生产药用蛋白的研究逐渐受到各国的重视，研究探索的热点之一是利用转基因植物生产口服疫苗。中国农业科学院生物技术研究所的科研人员将乙型肝炎病毒表面抗原基因导入马铃薯和蕃茄，饲喂小鼠试验检测到较高的保护性抗体，浓度足以对人类产生保护作用。该所还进行了利用植物叶绿体作为生物反应器生产药用蛋白的探索，已将丙肝病毒（HCV）抗原基因导入衣藻叶绿体。利用转基因植物生产口服疫苗可以大大降低疫苗的生产成本，在发展中国家更有良好的发展前景。植物方面2001年世界转基因植物商品化种植面积达到5260万公顷，其中中国的种植面积为150万公顷，是2000年的3倍，成为世界转基因作物种植面积增长最快的国家。其主要原因一方面是因为已开发的产品效果良好，受到农户的重视而加大了种植面积；另一方面是由于国家加大了研究力度，转基因植物的新技术和新产品不断产生。抗虫转基因植物2001年，转基因抗虫棉在已经取得重大成绩的基础上又有新的突破。中国农业科学院生物技术研究所的抗虫棉基因专利“编码杀虫蛋白质融合基因和表达载体及其应用”获得国家知识产权局和世界知识产权组织授予的中国专利金奖。同时，双价转基因抗虫棉SGK321也顺利通过河北省品种审定委员会审定，标志着中国在双基因抗虫棉研究领域处于国际领先地位。SGK321已经通过了农业转基因生物安全性评价，并获准在晋、冀、鲁、豫、皖进行商品化生产，在湖北进行环境释放。综合2000年和2001年两年区试结果，SGK321早熟性明显优于其他品种，霜前皮棉亩产75.4公斤，相当于对照抗虫杂交种的93.4%。该品种纤维品质好，长度为29.2毫米，比强度29.4厘米/特克斯，马克隆值4.8，抗虫性突出。到目前为止，中国已审定抗虫棉品种14个，其中单价棉11个，分别为：GK1（国抗1号）、GK12（国抗12号）、GK19（国抗19号）、GK22（国抗22号）、GK30(鲁棉研16号）、GK95-1（晋棉26号）和GK46(晋棉31号）、GKz10(鲁棉研15号）、GKz13（鲁RH-1）、GKz6（中棉所38）和GKz8（南抗3号）；双价棉3个，分别为：sGK321、sGK9708（中棉所41）、sGK5(新研96-48）。这些抗虫棉品种均高抗棉铃虫，具有较好的品质性状及丰产性。同时，还培育出一批具有较强竞争力的抗虫棉品种，其中杂交棉品种2个（鲁H9513和中抗杂5号），常规品种2个（ZGK9708和鲁S6145）。此外还有正在参加国家区试的有潜力的品种6个，杂交棉4个。2001年国产抗虫棉已经在河北、河南、山西、山东、湖南、湖北、江苏、安徽、新疆、辽宁等17个省市推广60万公顷，占据了国内抗虫棉43.3%的市场份额。加上孟山都公司的抗虫棉，2001年转基因抗虫棉的种植面积达到了全国棉花种植面积的31%，种植农户超过350万户。在抗虫转基因水稻方面，中科院遗传与发育生物学研究所研制的转SCK基因（修饰豇豆蛋白酶抑制剂基因）抗虫水稻在福建已连续进行了5年大田试验。经鉴定，其对二化螟田间防治效果达90－100%，稻纵卷叶螟抗性达81－100%，对大螟62.6－63.9%，稻苞虫83.9%。鉴于政策原因暂时还不能大面积推广种植，但已采取多地区多点进行大田试验。该转基因水稻的食品安全性检测已基本完成，结果表明与常规稻无明显差异。正进一步发展无选择标记、高效表达、多价抗虫基因等转基因水稻新品种。中国农业大学从Bt菌株克隆得到一种沉默的新杀虫基因cry1Ie1，该基因表达的毒蛋白对亚洲玉米螟显示了高杀虫活性，国际上已经确定了其在分类上的模式基因地位。该基因及该基因与cry1A基因的组合已申请国家发明专利。在此基础上进一步完成了cry1Ie1和cry1Ac基因的密码子改造和原核、真核表达载体的构建，改造基因的杀虫活性鉴定正在进行之中。抗病转基因植物中科院遗传与发育生物学研究所和国外单位合作定位和克隆成功的白叶枯病抗性基因Xa21通过独创的水稻Xa21基因农杆菌介导转化系统大量转化高产优质水稻品种明恢63、珍汕97B、盐恢559、太湖粳6、培矮64S、C418、8706和中花11等。抗性分析显示这些转基因系对19个不同的白叶枯病原菌株包括9个菲律宾小种，3个日本小种和7个中国病原型高度抗性，接种鉴定病斑面积小于10%。多数Xa21转基因系的抗性强于Xa21基因供体IRBB21，这表明在不同的遗传背影下Xa21仍保留了对白叶枯病的高度抗性和广谱抗性。目部分转基因株系已经进入中试阶段。中国农业大学利用已建立的小麦高频遗传转化体系，利用基因枪轰击法将小麦黄花叶病毒（WYMV）外壳蛋白基因、菌传相关72kDa蛋白基因和RNaseIII、2-5A System等目的基因分别导入小麦，获得多种抗病毒转基因株系。其中NY-8等50份材料已通过国家生物安全审定批准进入田间试验。从中筛选获得了多个保持了受体品系的优良综合农艺性状、抗病毒能力达到极显着水平的品系，并首次在禾谷类作物上确认了由转基因沉默所介导的抗病毒机制。中国水稻研究所等单位通过转基因技术将昆虫抗菌肽基因通过基因枪技术或通过pCBl载体导入水稻未成熟胚，获得抗细菌病转基因水稻植株，实验证明转基因水稻在温室条件下对白叶枯病菌和水稻细条病菌的抵抗能力增强，并表现其遗传稳定性。中国农科院生物技术研究所与中国科学院上海植物生理研究所等单位合作成功地克隆和修饰了植物来源的几丁质酶基因和葡萄糖氧化酶基因，获得了抗黄萎病和枯萎病的转基因棉花，现已进入中试阶段。转基因植物反应器中国科学院上海植物生理研究所开展了利用烟草花叶病毒（TMV）作为表达载体应用于植物生物反应器的研究；用该方法大规模表达口蹄疫病毒表面抗原多肽，制备高效，安全，廉价的重组口蹄疫疫苗。该研究利用自建的TMV本地株系基因组cDNA突变体库，在外源肽的表达上取得了较大突破。已获得能融合表达长达31肽的各种口蹄疫病毒表面抗原肽的重组TMV。重组病毒具有稳定的系统感染能力，每克烟草鲜叶中可得到1毫克以上高纯度的融合蛋白。并且找到了简单有效的从烟草中大规模纯化病毒蛋白工艺路线及重组疫苗的配制技术。转基因植物品质改良浙江省农科院在国际上首次从光合产物分配的角度，提出了利用反义PEP基因提高油菜种子含油量的技术路线，据此构建了反义PEP基因，利用农杆菌介导途径，将反义PEP基因导入油菜基因组，相继获得了多批反义PEP基因油菜植株。育成的"超油一号"含油量达47.4%，"超油二号"含油量高达52.82%，含油量均比传统品种提高25%以上，成为目前国际上含油量最高的甘蓝型油菜。打破了中国长江流域油菜含油量在37%~43%长期徘徊的局面，实现了中国油菜种子含油量的突破。扬州大学及中科院遗传与发育生物学研究所等分离并克隆了与水稻种子中淀粉合成相关的基因：淀粉分支酶Sbe1、淀粉分支酶Sbe3和可溶性淀粉合成酶SSS，以及水稻胚乳特异性表达基因启动子元件Gt1、GluB-1、RP5和RAG1。构建了可转化水稻的、含有义或反义淀粉合成酶和高赖氨酸含量蛋白（LRP）基因等的工程载体，通过转化获得了含不同品质基因的转基因水稻植株800余株。已经完成了部分转基因水稻植株的分子鉴定。
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