乳酸菌菌种的分离筛选方法菌种,筛选,方法,分离筛选,菌种的,分离,乳酸菌,乳酸菌分离..
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乳酸菌菌种的分离筛选方法
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3秒自动关闭窗口微生物细胞催化合成γ-氨基丁酸（GABA）的研究--《哈尔滨商业大学》2013年硕士论文
微生物细胞催化合成γ-氨基丁酸（GABA）的研究
【摘要】：γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质,具有多种重要的生理功能,广泛应用于医药与食品领域。微生物发酵法合成GABA是利用微生物细胞内谷氨酸脱羧酶(GAD)的作用将谷氨酸钠转化为GABA。从自然界中筛选到一株具有产GABA能力的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株,对其进行初步鉴定；提取GAD基因进行扩增,得到产物与载体连接,转入大肠杆菌后对阳性转化子PCR扩增产物进行序列测定及生物信息学分析；优化发酵工艺,得到最佳培养基组成及培养条件后,进行细胞的固定化研究。
利用BCP培养基从酸菜汁中分离出两株乳酸菌株,经多次纯化得到纯菌株,编号分别为LpL328、ST328,初筛后发现LpL328具有较好的产GABA的能力,通过形态学观察和生理生化实验初步鉴定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。将LpL328菌株接入发酵培养基中培养,采用两种方式处理菌体,一是收集菌体制成丙酮干粉,利用透性细胞与底物谷氨酸钠反应生成GABA,二是不对菌体进行任何处理,直接与底物谷氨酸钠反应,通过比色法测定出LpL328转化GABA的产量分别为2.16g/L与2.20g/L。另外,LpL328在TYG培养基中有良好的产GABA能力但在MRS培养基中没有,而PLP作为一种辅酶是产GABA反应中不可缺少的。
提取植物乳杆菌LpL328的GAD基因,设计引物并进行PCR扩增,得到扩增产物回收后将PCR回收片段与质粒分别进行酶切并连接,得到的连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中,涂布平板筛选出阳性转化子,对阳性转化子基因PCR产物进行凝胶电泳并对克隆到的目的片段进行序列分析,对翻译得到的蛋白质序列进行生物学信息分析,结果为：得到的基因核苷酸序列与NCBI中公布的Ipgad基因序列(GenBank Accession No. CP)同源性高达99.79%; LpL328GAD蛋白质分子量为53574.9,理论等电点为5.58；蛋白质为亲水性；此蛋白并不存在信号肽,说明不可能是分泌蛋白或是一些细胞质基质中合成的运输到细胞器中起作用的蛋白质；有2个N-糖基化位点；结构域分析表明此蛋白具有脱羧酶活性,motif搜索结果说明蛋白中有4个位置与指定的序列模式相匹配。
通过单因素试验对筛选出的菌株进行培养基组成成分的优化,确定发酵培养基的最佳组成为葡萄糖10g/L、酵母粉10g/L、丁二酸钠5g/L、谷氨酸钠8g/L。在最佳培养基组成的基础上优化培养条件,首先进行单因素试验,选出合适的水平进行正交试验,确定最佳培养条件为培养时间36h、初始pH6.0、接种量2%。培养基组成及条件优化后得到GABA的催化产量为2.91g/L,较优化前提高了35%。
在最佳发酵培养基组成及条件下培养菌株,之后收集菌体,采用海藻酸钠-氯化钙包埋法对菌体细胞进行固定化,对固定化细胞转化GABA的能力进行研究。首先进行菌体浓度、底物浓度、温度、pH的单因素试验,选择三个较好水平进行正交试验,得到最佳条件为菌体浓度6%、底物浓度20g/L、温度37℃、pH为4.7,GABA最高催化产量为0.96g/L。通过对固定化细胞进行多批次的连续实验得出,在7次转化后,仍能保持68.3%的活性,积累量可达到7.065g/L。
【关键词】：
【学位授予单位】：哈尔滨商业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：TQ922.9【目录】：
摘要5-7Abstract7-121 绪论12-21 1.1 γ-氨基丁酸概述12-13
1.1.1 γ-氨基丁酸的结构与性质12
1.1.2 代谢过程12-13 1.2 γ-氨基丁酸的生理功能13-15
1.2.1 调节血压13
1.2.2 改善睡眠13
1.2.3 控制哮喘13-14
1.2.4 改善肝肾功能14
1.2.5 促进生殖14
1.2.6 治疗癫痫14-15
1.2.7 其他功能15 1.3 γ-氨基丁酸的合成方法15-16
1.3.1 植物富集法15-16
1.3.2 化学合成法16
1.3.3 微生物发酵法16 1.4 谷氨酸脱羧酶的研究进展16-18
1.4.1 谷氨酸脱羧酶的分布与结构17
1.4.2 谷氨酸脱羧酶的活性调节17
1.4.3 谷氨酸脱羧酶的生理功能与应用17-18 1.5 固定化细胞技术的研究进展18-19
1.5.1 固定化技术概述18
1.5.2 固定化细胞的方法18-19
1.5.3 固定化技术的生物反应器19 1.6 本研究的目的与意义19 1.7 本研究的内容19-212 产γ-氨基丁酸乳酸菌菌株的分离鉴定21-31 2.1 实验材料与仪器21-22
2.1.1 菌种来源21
2.1.2 主要试剂21
2.1.3 培养基21-22
2.1.4 仪器与设备22 2.2 实验方法22-23
2.2.1 菌种的分离纯化22
2.2.2 菌种产GABA能力的初步鉴定22
2.2.3 菌种的形态学及生理生化鉴定22
2.2.4 菌种的培养及菌体透性细胞的制备22-23
2.2.5 细胞反应液中GABA的测定23 2.3 结果与分析23-30
2.3.1 菌种的分离纯化23
2.3.2 菌种产GABA能力的初步鉴定23-24
2.3.3 菌种的形态学及生理生化鉴定24-25
2.3.4 细胞反应液中GABA的测定25-27
2.3.5 不同细胞处理方式对GABA催化产量的影响27-28
2.3.6 不同培养基对菌株生长及GABA催化产量的影响28-29
2.3.7 辅酶对GABA催化产量的影响29-30 2.4 本章小结30-313 植物乳杆菌LpL328谷氨酸脱羧酶基因的克隆及生物信息学分析31-43 3.1 实验材料与仪器31-32
3.1.1 菌种和质粒31
3.1.2 工具酶和试剂盒31
3.1.3 主要试剂31
3.1.4 培养基31
3.1.5 仪器与设备31-32 3.2 实验方法32-35
3.2.1 植物乳杆菌基因组DNA的提取32
3.2.2 成熟蛋白编码区的PCR扩增32-33
3.2.3 质粒DNA和目的基因的双酶切33-34
3.2.4 大肠杆菌BL21感受态的制备及连接产物的转化34-35 3.3 结果与分析35-42
3.3.1 阳性转化子的凝胶电泳结果35
3.3.2 植物乳杆菌LpL328GAD基因克隆结果分析35-37
3.3.3 植物乳杆菌LpL328GAD蛋白质生物信息学分析37-42 3.4 本章小结42-434 植物乳杆菌LpL328发酵工艺的优化43-52 4.1 实验材料与仪器43-44
4.1.1 菌种43
4.1.2 主要试剂43
4.1.3 培养基43-44
4.1.4 仪器与设备44 4.2 实验方法44
4.2.1 菌株培养44
4.2.2 分析方法44 4.3 结果与分析44-51
4.3.1 培养基组成成分的优化44-47
4.3.2 培养条件的优化47-51 4.4 本章小结51-525 植物乳杆菌LpL328固定化细胞性质的研究52-59 5.1 实验材料与仪器52-53
5.1.1 菌种52
5.1.2 主要试剂52
5.1.3 培养基52-53
5.1.4 仪器与设备53 5.2 实验方法53-54
5.2.1 菌株培养53
5.2.2 游离细胞的制备53
5.2.3 固定化细胞的制备53
5.2.4 细胞反应液中GABA含量的测定53-54 5.3 结果与分析54-58
5.3.1 细胞浓度对GABA催化产量的影响54
5.3.2 底物浓度对GABA催化产量的影响54-55
5.3.3 pH对GABA催化产量的影响55-56
5.3.4 温度对GABA催化产量的影响56
5.3.5 正交试验结果分析56-57
5.3.6 固定化细胞转化GABA的稳定性实验57-58 5.4 本章小结58-59结论59-60参考文献60-63攻读学位期间发表的学术论文63-64致谢64
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问题提出时间： 07:36:21
超市买的优酸乳如何测得到含乳酸菌？
超市买的优酸乳如何测得到含乳酸菌？
行业分类：生物、医药
回答时间： 07:45:01
都要求无菌操作
菌种的分离 取lmL卤汁以10倍递增稀释方法（一份酸奶，九份无菌水，再取一份第一只管中溶液，加九份无菌水，依次类推），将其稀释至1/10～10的-10次幂（我打不上去），然后从不同浓度稀
释液中分别取lmL倾注在平皿中，再倒入培养基相混合，待培养基凝固后倒置于30~C恒温下
培养48h。挑取长势良好的单个茵落划线分纯，直至纯化(茵落单个大小一致，革兰氏染色镜
检，茵体一致)。结果分离得到3株不同菌株，分别编号为菌株1、菌株2、菌株3。再分别转移
到试管斜面上进行保存。
分离用培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1 000 mL，琼脂20g，pH7．0—7．2
；保存用斜面培养基：酵母膏1％ ，碳酸钙2％ ，葡萄糖1％ ，琼脂2％ ，pH 7．0。
将分离出的菌株1、菌株2、菌株3分别接种在上述4种不同的培养基上，
在30。【=恒温条件下培养48h后观察并测定其培养结果。
测定方法 菌落总数采用逐级稀释法来计数；pH值用pHS一2C酸度计测定；乳酸定性
及含量测定依据食品检验技术
1I．2．1乳酸菌的分离与筛选的试验程序 自然发酵酸菜汁液一稀释一培养一挑起单菌落染色、镜检一挑
选革兰氏阳性球菌单菌落一Ⅲ号培养基一挑选溶钙圈大的球菌反复在Ⅲ号培养基上几次纯化筛选一单菌落优
良菌株一试管穿刺低温保存。
1．2 1．2 乳酸菌的鉴定 用光学显微镜、放大镜进行乳酸菌的形态特征鉴定。生理生化特征鉴定：产乳
酸定性试验——乳酸纸层析法0- 、过氧化氢酶(接触酶)反应？、明胶水解反应 、硫化氢反应 、乳酸菌
发酵营养型试验0 、耐盐、酸、温度试验。
1．2．I．3 乳酸菌的保存？ 采用定期移植低温保藏法。培养基配方：葡萄糖1％ 、蛋白胨0 2％ 、
l(}l2PQ|0．2％、琼脂20％、pH值7 0，分装试管，121。c灭菌30min。将使用对数生长期后期的细胞进行穿刺
培养，然后密封存于冰箱玲藏室内(5qc左右)，2个月移植1次。
1．2．2 分离乳酸菌的生理特点试验
1 2 2．1 最适生长温度的测定OD值以同温下不接种培养基作对照，定期取出接种培养基在721分光光度
计上，用最大吸收光波长 =6001RIifl测定。
1．2．2．2 生长周期的测定oD值(方法同上)；pH值：PHB一4pH计；可滴定酸(以乳酸计)：吸取ImL菌液
加入9Ⅱ1L蒸馏水，加入1～2滴酚酞，用0．1NNaOH滴定。
1．2 2．3 最适pH值的测试、最适盐浓度的测试。
供试样品及培养基
分离用样品：泡菜汁、酸奶及西红柿均为市售
分离用培养基：①BCP培养基：酵母膏2 5g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，溴甲酚紫0 04g，琼脂15g，
蒸槽水lO00ml，pH7 0；②MRS培养基见文献 。
菌种保藏用培养基：脱脂乳培养基：新鲜牛乳离心去掉上层乳脂，下层奶液分装试管，105℃
灭菌20mln。
菌利 鉴定用培养基见文献 6。
1 2 方法
1 2 1 乳酸菌的分离纯化 取泡菜汁、酸奶、西红柿表面洗液进行梯度稀释，分别用倾注法、涂布
法和划线法在BCP和MRS培养基平板上进行菌种分离。挑取在BCP平板上有透明目的菌落，在
MRS平扳上有溶钙圈的菌落，反复纯化至纯种，挑菌至脱脂牛奶试管中保存
1．2 2 乳酸菌复筛对初筛菌株进行革兰氏染色，保留革兰氏阳性菌株．并对其所产乳酸能力进
行定性、定量分析，筛选出产酸高的菌株保存，再把产酸高的菌株经萝l、汁发酵 】，进一步选择产
酸高、_l】味纯正的菌株保存鉴定
1 2 3 乳酸定性测定果用纸层析法。溶剂系统为乙醇：浓氨水：水=80：5：15，显色剂为0 04％
的溴甲酚紫酒精溶液。层析时将乳酸、柠檬酸配成1％ 的标准溶液，两种标准溶液 及乳酸发酵液
均点样3 ．上行层析，显色与标准样比较
1．2 4 乳酸的定量测定采用气相色谱法，利用苄酯化法制备乳酸衍生物，将待测乳酸菌株在产
酸培养基内37"C培养3d，离心。取上清液剃备衍生物，气相色谱分析含量。气相色谱工作条件为：
EGS色谱柱，柱温160'C，气化温度180'17．，检测器温度l70"C，载气为N，。
1．2 5 菌种鉴定根据《简明第八版伯杰细菌鉴定手册》 和《一般细菌常用鉴定手册》[6 对复筛
出的菌株的形态、生理生化、碳源利用等方面进行系统鉴定，并提取乳酸菌株DNA，采用熔链温度
法捌G+C％含量 J。
共0条评论&
回答时间： 12:58:27
建议去丁香园求助。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。
共0条评论&
回答时间： 13:05:55
都要求无菌操作
菌种的分离 取lmL卤汁以10倍递增稀释方法（一份酸奶，九份无菌水，再取一份第一只管中溶液，加九份无菌水，依次类推），将其稀释至1/10～10的-10次幂（我打不上去），然后从不同浓度稀
释液中分别取lmL倾注在平皿中，再倒入培养基相混合，待培养基凝固后倒置于30~C恒温下
培养48h。挑取长势良好的单个茵落划线分纯，直至纯化(茵落单个大小一致，革兰氏染色镜
检，茵体一致)。结果分离得到3株不同菌株，分别编号为菌株1、菌株2、菌株3。再分别转移
到试管斜面上进行保存。
分离用培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1 000 mL，琼脂20g，pH7．0—7．2
；保存用斜面培养基：酵母膏1％ ，碳酸钙2％ ，葡萄糖1％ ，琼脂2％ ，pH 7．0。
将分离出的菌株1、菌株2、菌株3分别接种在上述4种不同的培养基上，
在30。【=恒温条件下培养48h后观察并测定其培养结果。
测定方法 菌落总数采用逐级稀释法来计数；pH值用pHS一2C酸度计测定；乳酸定性
及含量测定依据食品检验技术
1I．2．1乳酸菌的分离与筛选的试验程序 自然发酵酸菜汁液一稀释一培养一挑起单菌落染色、镜检一挑
选革兰氏阳性球菌单菌落一Ⅲ号培养基一挑选溶钙圈大的球菌反复在Ⅲ号培养基上几次纯化筛选一单菌落优
良菌株一试管穿刺低温保存。
1．2 1．2 乳酸菌的鉴定 用光学显微镜、放大镜进行乳酸菌的形态特征鉴定。生理生化特征鉴定：产乳
酸定性试验——乳酸纸层析法0- 、过氧化氢酶(接触酶)反应？、明胶水解反应 、硫化氢反应 、乳酸菌
发酵营养型试验0 、耐盐、酸、温度试验。
1．2．I．3 乳酸菌的保存？ 采用定期移植低温保藏法。培养基配方：葡萄糖1％ 、蛋白胨0 2％ 、
l(}l2PQ|0．2％、琼脂20％、pH值7 0，分装试管，121。c灭菌30min。将使用对数生长期后期的细胞进行穿刺
培养，然后密封存于冰箱玲藏室内(5qc左右)，2个月移植1次。
1．2．2 分离乳酸菌的生理特点试验
1 2 2．1 最适生长温度的测定OD值以同温下不接种培养基作对照，定期取出接种培养基在721分光光度
计上，用最大吸收光波长 =6001RIifl测定。
1．2．2．2 生长周期的测定oD值(方法同上)；pH值：PHB一4pH计；可滴定酸(以乳酸计)：吸取ImL菌液
加入9Ⅱ1L蒸馏水，加入1～2滴酚酞，用0．1NNaOH滴定。
1．2 2．3 最适pH值的测试、最适盐浓度的测试。
供试样品及培养基
分离用样品：泡菜汁、酸奶及西红柿均为市售
分离用培养基：①BCP培养基：酵母膏2 5g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，溴甲酚紫0 04g，琼脂15g，
蒸槽水lO00ml，pH7 0；②MRS培养基见文献 。
菌种保藏用培养基：脱脂乳培养基：新鲜牛乳离心去掉上层乳脂，下层奶液分装试管，105℃
灭菌20mln。
菌利 鉴定用培养基见文献 6。
1 2 1 乳酸菌的分离纯化 取泡菜汁、酸奶、西红柿表面洗液进行梯度稀释，分别用倾注法、涂布
法和划线法在BCP和MRS培养基平板上进行菌种分离。挑取在BCP平板上有透明目的菌落，在
MRS平扳上有溶钙圈的菌落，反复纯化至纯种，挑菌至脱脂牛奶试管中保存
1．2 2 乳酸菌复筛对初筛菌株进行革兰氏染色，保留革兰氏阳性菌株．并对其所产乳酸能力进
行定性、定量分析，筛选出产酸高的菌株保存，再把产酸高的菌株经萝l、汁发酵 】，进一步选择产
酸高、_l】味纯正的菌株保存鉴定
1 2 3 乳酸定性测定果用纸层析法。溶剂系统为乙醇：浓氨水：水=80：5：15，显色剂为0 04％
的溴甲酚紫酒精溶液。层析时将乳酸、柠檬酸配成1％ 的标准溶液，两种标准溶液 及乳酸发酵液
均点样3 ．上行层析，显色与标准样比较
1．2 4 乳酸的定量测定采用气相色谱法，利用苄酯化法制备乳酸衍生物，将待测乳酸菌株在产
酸培养基内37"C培养3d，离心。取上清液剃备衍生物，气相色谱分析含量。气相色谱工作条件为：
EGS色谱柱，柱温160'C，气化温度180'17．，检测器温度l70"C，载气为N，。
1．2 5 菌种鉴定根据《简明第八版伯杰细菌鉴定手册》 和《一般细菌常用鉴定手册》[6 对复筛
出的菌株的形态、生理生化、碳源利用等方面进行系统鉴定，并提取乳酸菌株DNA，采用熔链温度
法捌G+C％含量 J。
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