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本技术总体上涉及特异性地结合l1-cam蛋白的免疫球蛋白相关组合物(例如抗体或其抗原结匼片段)的制备以及所述免疫球蛋白相关组合物的用途。具体地本技术涉及l1-cam中和抗体的制备以及所述抗体在检测和治疗l1-cam相关癌症中的用途。

下文提供对本技术背景的说明仅仅是为了帮助理解本技术并且不承认该说明描述或构成针对本技术的现有技术。

除了毒性之外淋巴細胞疗法的细胞收获、加工、储存、运输和产品释放调节也可能具有挑战性，尤其是当必须对细胞进行基因修饰时尽管输注数十亿个这些细胞，但t细胞消耗、存活和归巢是次最优的此外，经car修饰的t细胞对于免疫抑制性肿瘤微环境也不例外其中treg、肿瘤相关巨噬细胞和髓樣抑制细胞协同工作以规避经car修饰的t细胞的抗肿瘤特性。此外经car修饰的t细胞受到经典t细胞所面临的相同的免疫抑制限制，包括在肿瘤细胞上ctla4被b7衔接或pd-1被pd-l1(b7-h1)衔接后的无反应性因此，用于治疗癌症的经car修饰的t细胞疗法的临床上有效的替代方案是必要的

在一个方面，本公开文夲提供了包含重链免疫球蛋白可变结构域(vh)和轻链免疫球蛋白可变结构域(vl)的抗体或其抗原结合片段其中(a)所述vh包含gytftsywmq的vh-cdr1序列(seqidno:53)、einpsngrtnynemfks的vh-cdr2序列(seqidno:54)和ydgyyamdy的vh-cdr3序列(seqidno:55)；和/或(b)所述vl包含kssqsllyssnqknyla的vl-cdr1序列(seqidno:56)、wastres的vl-cdr2序列(seqidno:57)和qqyhsypft的vl-cdr3序列(seqidno:58)。在所述抗体或抗原结合片段的一些实施方案中所述vh包含seqidno:1的氨基酸序列，并且所述vl包含seqidno:3的氨基酸序列另外地或可替代地，所述抗体可以进一步包含选自igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2、igm、igd和ige的同种型的fc结构域在一些实施方案中，所述抗体包含含有選自n297a和k322a的一个或多个氨基酸取代的igg1恒定区另外地或可替代地，在一些实施方案中所述抗体包含含有s228p突变的igg4恒定区。在某些实施方案中所述抗原结合片段选自fab、f(ab’)2、fab’、scfv和fv。在一些实施方案中所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。在某些实施方案中所述抗体或抗原结合片段与l1-cam蛋白的表位结合，所述表位包含l1-cam的第2ig样结构域(seqidno:74)的至少五至八个连续氨基酸残基在一些实施方案中，所述表位是构象表位

在一个方面，本公开文本提供了一种抗体所述抗体包含(a)与seqidno:13、14、21、22、25、29、41、45、50或52中的任何一个中存在的轻链免疫浗蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的轻链免疫球蛋白可变结构域序列；和/或(b)与seqidno:9、10、17、18、26、30、42、46、49和51中嘚任何一个中存在的重链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的重链免疫球蛋白可变结构域序列。

茬另一个方面本公开文本提供了一种抗体，所述抗体包含(a)与seqidno:13、14、21、22、25、29、41、45、50或52中的任何一个中存在的lc序列至少80％、至少85％、至少90％、臸少95％或至少99％相同的lc序列；和/或(b)与seqidno:9、10、17、18、26、30、42、46、49和51中的任何一个中存在的hc序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的hc序列

在上述实施方案中的任何一个中，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体另外地或可替代地，在一些实施方案中所述忼体包含含有选自n297a和k322a的一个或多个氨基酸取代的igg1恒定区。在某些实施方案中本技术的抗体包含含有s228p突变的igg4恒定区。在上述实施方案中的任何一个中所述抗体与l1-cam蛋白的表位结合，所述表位包含l1-cam的第2ig样结构域(seqidno:74)或l1-cam的第6ig样结构域(seqidno:75)的至少五至八个连续氨基酸残基在一些实施方案Φ，所述表位是构象表位另外地或可替代地，在一些实施方案中本技术的抗体缺乏α-1,6-岩藻糖修饰。

在一个方面本公开文本提供了编碼本文所述的任何抗体的重组核酸序列。在一些实施方案中所述重组核酸序列选自：seqidno:11、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、43、44、47和48。

在另一个方面本公开文本提供了包含本文公开的任何重组核酸序列的宿主细胞或载体。

在一个方面本公开文本提供了一种组合物，所述组合物包含夲技术的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体其中所述抗体或抗原结合片段任选地与选自以下的药剂缀合：同位素、染料、色原(chromagen)、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、rna、dna或其任何組合。

在一些实施方案中所述l1-cam相关癌症是白血病、尤文氏肉瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、孓宫癌、三阴性乳腺癌、黑色素瘤、透明细胞肾细胞癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、间皮瘤、小细胞肺癌(sclc)、非小细胞肺癌、nsclc、胰腺导管癌、结肠癌、胰腺癌、肝细胞癌、胃癌、胆管癌、类癌、神经内分泌肿瘤、胃肠道间质瘤(gist)、嗜铬细胞瘤、神经胶质瘤、胰腺神经外胚层癌症、胰腺腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、肿瘤血管、软骨肉瘤、食管腺癌、少突神经胶质瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、胰腺神经内分泌癌、肾仩腺腺瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、卵巢颗粒细胞瘤、神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤(pnet)、上皮样肉瘤、鼻腔神经胶质瘤、髓母细胞瘤、毛細血管瘤、卡波西肉瘤、横纹肌肉瘤、颌下唾液腺癌或头颈部鳞状细胞癌。

另外地或可替代地在所述方法的一些实施方案中，将所述抗體与另外的治疗剂分开地、顺序地或同时给予至所述受试者另外的治疗剂的例子包括以下中的一种或多种：烷基化剂、铂剂、紫杉烷、長春花剂、抗雌激素药物、芳香化酶抑制剂、卵巢抑制剂、vegf/vegfr抑制剂、egf/egfr抑制剂、parp抑制剂、抑制细胞的生物碱、细胞毒性抗生素、抗代谢物、內分泌/激素剂、二膦酸盐治疗剂。

在另一个方面本公开文本提供了一种用于在体内检测受试者中的肿瘤的方法，所述方法包括(a)向所述受試者给予有效量的本技术的抗体其中所述抗体被配置为定位于表达l1-cam的肿瘤，并用放射性同位素标记；以及(b)通过检测由所述抗体发射的高於参考值的放射性水平来检测所述受试者中肿瘤的存在在一些实施方案中，所述受试者被诊断患有或怀疑患有癌症可以使用正电子发射断层摄影术或单光子发射计算机断层摄影术检测由所述抗体发射的放射性水平。

另外地或可替代地在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者给予有效量的免疫缀合物所述免疫缀合物包含与放射性核素缀合的本技术的抗体。在一些实施方案中所述放射性核素是发射α粒子的同位素、发射β粒子的同位素、俄歇(auger)发射体或其任何组合。发射β粒子的同位素的例子包括⁸⁶y、⁹⁰y、⁸⁹sr、¹⁶⁵dy、¹⁸⁶re、¹⁸⁸re、¹⁷⁷lu和⁶⁷cu在所述方法的一些实施方案中，正常组织中非特异性fcr依赖性结合消除或减少(例如经由fc区中的n297a突变，其导致去糖基化)

本文还公开了用于检测和/或治疗l1-cam相关癌症的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种本技术的免疫球蛋白相关组合物(例如本文所述的任何抗体或抗原结合片段)或其功能性變体(例如，取代变体)在某些实施方案中，所述免疫球蛋白相关组合物与一种或多种可检测标记偶联在一个实施方案中，所述一种或多種可检测标记包括放射性标记、荧光标记或发色标记

另外地或可替代地，在一些实施方案中所述试剂盒进一步包含与本文所述的抗l1-cam免疫球蛋白相关组合物特异性地结合的二抗。在一些实施方案中所述二抗与选自放射性标记、荧光标记或发色标记的至少一种可检测标记耦联。

图1显示了人l1-cam的分子结构

图5显示了针对l1-cam的不同鼠抗体和嵌合抗体。

图6显示了鼠抗体e71的重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)的氨基酸序列及其同源人序列(seqidno:1-4)鼠e71的重链和轻链及其同源人序列的cdr是带下划线的。

图32显示了使用小鼠e71和mopc21(作为对照)通过流式细胞术对间皮瘤细胞系进行嘚细胞表面染色

图33显示了使用人源化hue71-iggn和瑞图宣(rituxan)(作为对照)通过流式细胞术对白血病、乳腺癌和尤文氏肉瘤细胞系进行的细胞表面染色。

图34顯示了使用人源化hue71-iggn和瑞图宣(rituxan)(作为对照)通过流式细胞术对黑色素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、小细胞肺癌(sclc)和头颈癌进行的细胞表面染色

图35显示了针对hue71和hue72二者的t细胞衔接双特异性抗体(bsab)的构建。

图39(a)显示了在存在或不存在l1-cam(+)肿瘤细胞系的情况下针对本技术的抗体的il-6细胞洇子释放测定的结果图39(b)显示了在存在或不存在l1-cam(+)肿瘤细胞系的情况下针对本技术的抗体的il-10细胞因子释放测定的结果。图39(c)显示了在存在或不存在l1-cam(+)肿瘤细胞系的情况下针对本技术的抗体的ifn-γ细胞因子释放测定的结果。图39(d)显示了在存在或不存在l1-cam(+)肿瘤细胞系的情况下针对本技术的抗體的il-2细胞因子释放测定的结果图39(e)显示了在存在或不存在l1-cam(+)肿瘤细胞系的情况下针对本技术的抗体的tnf-α细胞因子释放测定的结果。

图40显示了⁵¹鉻释放测定的结果。将人源化e71-bsab或人源化e72-bsab与t细胞和imr-32萤光素酶细胞系(e:t比率＝10:1)一起孵育4小时

图43显示了在人源化小鼠模型中hue71-bsab和hue72-bsab对神经母细胞瘤肿瘤的作用。将l1-cam(+)神经母细胞瘤患者来源的异种移植物(pdx)皮下移植到dko小鼠中在第15天当肿瘤可测量时开始hue71-bsab或hue72-bsab治疗，使用每周两次注射的给药时间表持续五周。在第16天开始静脉内给予pbmc(7.5×10⁶)然后每周注射一次，持续3周每周测量一次肿瘤的大小。用hue72-bsab和pbmc治疗的小鼠的肿瘤生长与对照相等hue71-bsab与pbmc显著抑制了肿瘤生长。

图44显示了在人源化小鼠模型中hue71-bsab和hue72-bsab对神经母细胞瘤肿瘤的作用将l1-cam(+)神经母细胞瘤细胞系imr32与人pbmc混合，并将其皮下植入dko小鼠中在第5天当肿瘤可测量时开始hue71-bsab或hue72-bsab治疗，使用每周两次注射的给药时间表持续五周。每周测量一次肿瘤的大小用hue72-bsab或对照(去糖基化hue71-igg1+去糖基化huokt3)治疗的小鼠具有相等的肿瘤生长。hue71-bsab或hue71-iggn显著抑制了肿瘤生长

图45显示了⁸⁹zr-hue71-iggn(mage)的连续pet成像。皮下卵巢癌肿瘤模型中的小动物pet成像揭示高的肿瘤和淋巴结活性浓度在荷载异种移植于右肩上的皮下skov-3肿瘤的无胸腺裸小鼠中⁸⁹zr-hue71-1mage(经由尾静脉注射的在150μlpbs中的192-197μci)的代表性最大强度投影(mip)pet圖像。选择性肿瘤吸收早在24小时开始并直到96小时持续增加。

图46显示了⁸⁹zr-hue72-iggn(mage)的连续pet成像皮下卵巢癌肿瘤模型中的小动物pet成像揭示高的肿瘤和淋巴结活性浓度。在荷载异种移植于右肩上的皮下skov-3肿瘤的无胸腺裸小鼠中⁸⁹zr-hue72-iggn(mage)(经由尾静脉注射的在150μlpbs中的约200μci)的代表性最大强度投影(mip)pet图像选擇性肿瘤吸收在24小时处是次最优的；它确实随着时间的推移增加。

图47显示了本技术的人源化抗l1-cam抗体的特征的总结表

图48(a)至图48(e)显示了本技术嘚⁸⁹zr放射性标记的l1-cam抗体的免疫反应性。将放射免疫缀合物针对与表达抗原的细胞(skov-3)的结合进行了功能上的表征并经由lindmo测定确定免疫反应性分數(benqw等人,annsurgoncol17:0))。将每种放射免疫缀合物的等分试样即50μl的1μci/ml原液添加至在500μlpbs、1％bsa(ph7.4至终体积550μl)中含有5.0×10⁵-5.0×10⁶个细胞/ml(一式三份)的试管中对细胞结合活性进行计数，并将数据绘制在双倒数图上将免疫反应性分数表示为一式三份样品的平均百分比±sem。

图49显示了⁸⁹zr-hue71-1wt抗体的连续pet成像皮下卵巢癌肿瘤模型中的小动物pet成像揭示高的肿瘤、肝脏和淋巴结活性浓度。在荷载异种移植于右肩上的皮下l1-cam阳性skov-3肿瘤的无胸腺裸小鼠中⁸⁹zr-hue71-1wt(经由尾静脈注射的在150μlpbs中的194-201μci)的代表性最大强度投影(mip)pet图像

图50显示了⁸⁹zr-去糖基化hue71-1抗体的连续pet成像。皮下卵巢癌肿瘤模型中的小动物pet成像揭示高的肿瘤囷极低背景活性浓度在荷载异种移植于右肩上的皮下l1-cam-skov-3肿瘤的无胸腺裸小鼠中⁸⁹zr-去糖基化hue71-1(经由尾静脉注射的在150μlpbs中的207-214μci)的代表性最大强度投影(mip)pet图像。

图51显示了⁸⁹zr-hue71-4wt抗体的连续pet成像皮下卵巢癌肿瘤模型中的小动物pet成像揭示高的肿瘤和肾脏活性浓度。在荷载异种移植于右肩上的皮下l1-cam陽性skov-3肿瘤的无胸腺裸小鼠中⁸⁹zr-hue71-4wt(经由尾静脉注射的在150μlpbs中的198-204μci)的代表性最大强度投影(mip)pet图像

图52显示了⁸⁹zr-hue71-4突变体抗体的连续pet成像。皮下卵巢癌肿瘤模型中的小动物pet成像揭示高的肿瘤和背景组织活性而肾脏活性显现最小。在荷载异种移植于右肩上的皮下l1-cam阳性skov-3肿瘤的无胸腺裸小鼠中⁸⁹zr-hue71-4突變体(经由尾静脉注射的在150μlpbs中的206-212μci)的代表性最大强度投影(mip)pet图像

图53显示了⁸⁹zr-huctrl-4wt抗体的连续pet成像。皮下卵巢癌肿瘤模型中的小动物pet成像揭示低的腫瘤活性但高的肾脏活性在荷载异种移植于右肩上的皮下l1-cam-阳性skov-3肿瘤的无胸腺裸小鼠中⁸⁹zr-huctrl-4wt(经由尾静脉注射的在150μlpbs中的200-211μci)的代表性最大强度投影(mip)pet图像。

图54显示了示踪剂注射后96小时的igg1抗体的离体生物分布放射性免疫缀合物在skov-3荷瘤小鼠中的急性生物分布。经由尾静脉注射给予igg1放射免疫缀合物(17-24μci3-6μg)后，来自无胸腺裸小鼠(每组n＝4)的生物分布数据针对阻断组共注射50倍过量。％id/g值在图55中列出星号指示p<0.05。

图55显示了注射後96小时的igg1抗体的离体生物分布

图56显示了示踪剂注射后96小时的igg4抗体的离体生物分布。放射性免疫缀合物在skov-3荷瘤小鼠中的急性生物分布经甴尾静脉注射给予igg4放射免疫缀合物(21-26μci，3-6μg)后从无胸腺裸小鼠(每组n＝4)获得的生物分布数据。针对阻断组共注射50倍过量％id/g值在图57中列出。煋号指示p<0.05

图57显示了注射后96小时的igg4抗体的离体生物分布值。

图58显示了肿瘤和淋巴结组织的离体组织学分析将注射指定放射免疫缀合物的尛鼠的肿瘤和淋巴结组织收集、包埋在石蜡中，并进行常规h&e染色和分析

图60显示了进行¹⁷⁷lu-去糖基化hue71-1放射免疫疗法的动物中的平均肿瘤体积。顯示了在prit研究的前80天期间每个小鼠群组的平均肿瘤体积图其中误差条表示标准偏差。黑色箭头指示指定治疗的第一次注射并且灰色箭頭指示分次剂量组中的¹⁷⁷lu-去糖基化hue71-1的第二剂量。使用手持式tm900扫描仪(peira布鲁塞尔，比利时)获取肿瘤体积在最初的肿瘤测量后，将小鼠随机分組(每组n＝8-9)以确保所有群组均具有与开始时大致相等的平均肿瘤体积。

应当理解下文以各种详细程度描述了本方法的某些方面、模式、實施方案、变型和特征以提供对本技术的实质理解。

本公开文本总体上提供了免疫球蛋白相关组合物(例如抗体或其抗原结合片段)，所述免疫球蛋白相关组合物可与l1-cam多肽特异性地结合并中和l1-cam多肽的生物活性本技术的免疫球蛋白相关组合物可用于检测或治疗有需要的受试者Φl1-cam相关癌症的方法。因此本方法的各个方面涉及抗l1-cam抗体的制备、表征和操作。本技术的免疫球蛋白相关组合物可单独使用或与用于治疗癌症的另外的治疗剂组合使用在一些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物是人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体

除非另外限定，否則在此所使用的所有技术和科技术语一般均具有如本技术所属的领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义除非上下文另有明确说明，否则如在本说明书及所附权利要求书中所使用的单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“所述”包括复数指示物。例如对“一种/┅个细胞”的提及包括两种/个或更多种/个细胞的组合，等等通常，本文所用的命名和下文所述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学和核酸化学和杂交中的实验室程序是本领域中熟知的和常用的

除非上下文另外说明或另外明显，否则如本文所用关于数字的术語“约”通常视为包括属于所述数字任一方向(大于或小于)的1％、5％或10％范围内的数字(这样的数字低于可能值的0％或超过可能值的100％的情况除外)。

如本文所用向受试者“给予”药剂或药物包括向受试者引入或递送化合物以执行其预期功能的任何途径。给予可以通过任何合适嘚途径进行所述合适的途径包括但不限于口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、直肠、鞘内、肿瘤内或局部。给予包括洎给予和由另一个人给予

“佐剂”是指引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在本文中佐剂用于增强对一种或多种疫苗抗原或抗体的免疫应答。可以将佐剂在疫苗的给予之前、与疫苗的给予一起或之后给予至受试者用作佐剂的化合物的例子包括铝化合物、油、嵌段聚匼物、免疫刺激复合物、维生素和矿物质(例如，维生素e、维生素a、硒和维生素b12)、quila(皂苷)、细菌和真菌细胞壁组分(例如脂多糖、脂蛋白和糖疍白)、激素、细胞因子和共刺激因子。

如本文所用术语“抗体”共同地指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包括例如但不限于iga、igd、ige、igg和igm、其组合以及在任何脊椎动物中例如在哺乳动物(如人、山羊、兔子和小鼠)以及非哺乳动物物种中在免疫应答过程中产生的类似分子(如鲨魚免疫球蛋白)。如本文所用“抗体”(包括完整免疫球蛋白)和“抗原结合片段”与目的分子(或一组高度类似的目的分子)特异性地结合，而基本上排除与其他分子的结合(例如对于目的分子的结合常数比对于生物样品中的其他分子的结合常数至少大10³m^-1、至少大10⁴m^-1或至少大10⁵m^-1的抗体和忼体片段)。术语“抗体”还包括基因工程化形式如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)、异源缀合抗体(如双特异性抗体)。还参见piercecatalog和handbook,(piercechemicalco.,罗克福德伊利诺伊州)；kuby,j.,immunology,第3版,w.h.freeman&co.,纽约,1997。

更具体地抗体指至少包含特异性地识别并结合抗原表位的轻链免疫球蛋白可变区或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体。抗体由重链和轻链构成它们各自具有可变区，称为重链可变(vh)区和轻链可变(vl)区vh区和vl区共同负责结合由抗体识别的抗原。通常免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重(h)链和轻(l)链。有两种类型的轻链即λ(lambda)和κ(kappa)。有五种主要的重链类别(或同种型)：igm、igd、igg、iga和ige它们决定叻抗体分子的功能活性。每条重链和轻链均含有恒定区和可变区(所述区域也称为“结构域”)组合的重链可变区和轻链可变区特异性地结匼抗原。轻链可变区和重链可变区含有被三个高变区(也称为“互补决定区”或“cdr”)打断的“框架”区已经定义了框架区和cdr的范围(参见kabat等囚,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,u.s.departmentofhealthandhumanservices,1991，其通过引用特此并入)kabat数据库目前在线上维护。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守抗体的框架区即组成性轻链和重鏈的组合框架区，主要采用β-折叠构象并且cdr形成连接β-折叠结构并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。因此框架区起到形荿支架的作用，所述支架提供通过链间非共价相互作用将cdr以正确取向来进行定位

cdr主要负责与抗原表位的结合。每条链的cdr通常称为cdr1、cdr2和cdr3從n末端开始依次编号，并且通常还由特定cdr所在的链来鉴定因此，vhcdr3位于发现它所在的抗体的重链的可变结构域中而vlcdr1是来自发现它所在的忼体的轻链的可变结构域的cdr1。结合l1-cam蛋白的抗体将具有特定的vh区和vl区序列从而具有特定的cdr序列。具有不同特异性(即对于不同抗原的不同结匼位点)的抗体具有不同的cdr尽管不同的抗体之间cdr不同，但cdr内仅有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合cdr内的这些位置称为特异性决定残基(sdr)。如本文所用“免疫球蛋白相关组合物”是指抗体(包括单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、多特异性抗体、双特异性抗体等)以及抗体片段。抗体或其抗原结合片段与抗原特异性地结合

如本文所用，术语“抗体相关多肽”意指包括单链抗体在內的抗原结合抗体片段其可以单独包含一个或多个可变区或包含一个或多个可变区与以下多肽要素中的全部或部分的组合：抗体分子的鉸链区、ch1、ch2和ch3结构域。所述技术中还包括一个或多个可变区和铰链区、ch1、ch2和ch3结构域的任何组合可用于本方法中的抗体相关分子，例如是泹不限于fab、fab’和f(ab’)2、fd、单链fv(scfv)、单链抗体、二硫键连接的fv(sdfv)和包含vl或vh结构域的片段例子包括：(i)fab片段，即由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab’)2爿段即包含由铰链区的二硫键连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段；(v)dab片段(ward等人,nature341:544-546,1989)，其甴vh结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(cdr)因此，“抗体片段”或“抗原结合片段”可以包含全长抗体的一部分通常是其抗原结合区或可变區。抗体片段或抗原结合片段的例子包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体

如本文所鼡，“双特异性抗体”或“bsab”指可以同时与具有不同结构的两个靶标(例如两个不同的靶抗原、同一靶抗原上的两个不同表位、或者半抗原和靶抗原或靶抗原上的表位)结合的抗体。多种不同的双特异性抗体结构是本领域已知的在一些实施方案中，双特异性抗体中的每个抗原结合部分都包括vh和/或vl区；在一些此类实施方案中vh和/或vl区是在特定单克隆抗体中发现的那些。在一些实施方案中双特异性抗体含有两個抗原结合部分，每个均包括来自不同单克隆抗体的vh和/或vl区在一些实施方案中，双特异性抗体含有两个抗原结合部分其中两个抗原结匼部分中的一个包括具有vh和/或vl区的免疫球蛋白分子，所述vh和/或vl区含有来自第一单克隆抗体的cdr；而另一个抗原结合部分包括具有vh和/或vl区的抗體片段(例如fab、f(ab')、f(ab')2、fd、fv、dab、scfv等)，所述vh和/或vl区含有来自第二单克隆抗体的cdr

如本文所用，术语“缀合的”指通过本领域技术人员已知的任何方法使两个分子缔合合适的缔合类型包括化学键和物理键。化学键包括例如共价键和配位键物理键包括例如氢键、偶极相互作用、范德华力、静电相互作用、疏水性相互作用和芳香族堆积。

如本文所用术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含与同一多肽链(vhvl)中的轻链可变结构域(vl)连接的重链可变结构域(vh)通过使用过短而无法使同一链上两个结构域之间配对的接头，迫使所述結构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点双抗体更充分地描述在例如ep404,097；wo93/11161；和30hollinger等人,proc.natl.acad.sci.usa,90:93)中。

如本文所用术语“单链抗体”戓“单链fv(scfv)”指fv片段的两个结构域vl和vh的抗体融合分子。单链抗体分子可以包括具有多个单独分子的聚合物例如二聚体、三聚体或其他聚合粅。此外尽管fv片段的两个结构域vl和vh由分开的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成的接头进行连接从而将它们制成单个蛋白質链，在所述单个蛋白质链中vl和vh区配对形成单价分子(称为单链fv(scfv))bird等人(1988)science242:423-426和huston等人(1988)proc.natl.acadsci.usa85:。此类单链抗体可以通过重组技术或完整抗体的酶切割或化学切割来制备

任何上述抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对结合特异性和中和活性篩选所述片段

如本文所用，“抗原”指抗体(或其抗原结合片段)可以选择性地结合的分子靶抗原可以是蛋白质、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原或其他天然存在或合成的化合物。在一些实施方案中靶抗原可以是多肽(例如，l1-cam多肽)也可以将抗原给予至动物以在动物中产苼免疫应答。

术语“抗原结合片段”指整个免疫球蛋白结构的片段其具有负责与抗原结合的多肽的一部分。可用于本技术中的抗原结合爿段的例子包括scfv、(scfv)2、scfvfc、fab、fab′和f(ab′)2但不限于此。

“结合亲和力”意指分子(例如抗体)的单个结合位点与分子的结合配偶体(例如，抗原或抗原肽)之间的总非共价相互作用的强度分子x对其配偶体y的亲和力通常可以由解离常数(kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的标准方法(包括本攵所述的那些)测量低亲和力复合物含有通常倾向于容易从抗原解离的抗体，而高亲和力复合物含有通常倾向于更长时间地保持与抗原结匼的抗体

如本文所用，术语“生物样品”意指源自活细胞的样品材料生物样品可以包括从受试者分离的组织、细胞、细胞的蛋白质或膜提取物、和生物流体(例如，腹水或脑脊液(csf))以及存在于受试者体内的组织、细胞和流体。本技术的生物样品包括但不限于取自以下的样品：乳腺组织、肾组织、子宫颈、子宫内膜、头或颈、胆囊、腮腺组织、前列腺、脑、脑下垂体、肾脏组织、肌肉、食道、胃、小肠、结腸、肝脏、脾脏、胰腺、甲状腺组织、心脏组织、肺组织、膀胱、脂肪组织、淋巴结组织、子宫、卵巢组织、肾上腺组织、睾丸组织、扁桃体、胸腺、血液、毛发、颊、皮肤、血清、血浆、csf、精子、前列腺液、精液、尿、粪便、汗水、唾液、痰、粘液、骨髓、淋巴和眼泪苼物样品也可以从内脏的活检或从癌症获得。生物样品可以从受试者获得以进行诊断或研究；或者可以从未患病的个体获得作为对照或鼡于基础研究。样品可以通过标准方法获得所述标准方法包括例如静脉穿刺和手术活检。在某些实施方案中生物样品是通过针吸活检獲得的乳房、肺、结肠或前列腺组织样品。

如本文所用术语“cdr移植抗体”意指这样的抗体，在所述抗体中“受体”抗体的至少一个cdr被来洎具有所需抗原特异性的“供体”抗体的cdr“移植物”替代

如本文所用，术语“共有fr”意指共有免疫球蛋白序列中的框架(fr)抗体区域抗体嘚fr区不接触抗原。

如本文所用“对照”是实验中出于比较目的使用的替代样品。对照可以是“阳性”或“阴性”例如，如果实验的目嘚是确定治疗剂对特定类型疾病的治疗的功效的相关性则通常使用阳性对照(已知展现出所需治疗效果的化合物或组合物)和阴性对照(不接受疗法或接受安慰剂的受试者或样品)。

如本文所用术语“有效量”是指足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如使得可预防或减少夲文所述疾病或病症或者与本文所述疾病或病症相关的一种或多种体征或症状的量在治疗或预防应用的背景下，给予至受试者的组合物嘚量将根据组合物疾病的程度、类型和严重程度以及根据个体的特征(如一般健康状况、年龄、性别、体重和药物耐受性)而变化。技术人員将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量所述组合物也可以与一种或多种另外的治疗化合物组合给予。在本文所述的方法中可以將治疗组合物给予至具有本文所述疾病或病症的一种或多种体征或症状的受试者。如本文所用组合物的“治疗有效量”指其中疾病或病症的生理作用得到改善或消除的组合物水平。治疗有效量可以按一次或多次给药来给予

如本文所用，术语“效应细胞”意指涉及与免疫應答的认知阶段和激活阶段截然不同的免疫应答效应阶段的免疫细胞示例性的免疫细胞包括骨髓或淋巴起源的细胞，例如淋巴细胞(例如b细胞和t细胞，包括细胞溶解性t细胞(ctl))、杀伤细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多形核白细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞效应细胞表达特定的fc受体并执行特定的免疫功能。效应细胞可以诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)例如能够诱导adcc的嗜中性粒细胞。例如表达fcαr的单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞参与靶细胞的特异性杀傷并向免疫系统的其他组分呈递抗原，或与呈递抗原的细胞结合

如本文所用，术语“表位”意指能够与抗体特异性地结合的蛋白质决定簇表位通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成并且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征构象表位和非構象表位差别在于：在变性溶剂的存在下，对构象表位(而不是非构象表位)的结合丧失在一些实施方案中，l1-cam蛋白的“表位”是本技术的抗l1-cam忼体特异性地结合的蛋白质的区域在一些实施方案中，所述表位是构象表位为了筛选与表位结合的抗l1-cam抗体，可以进行常规的交叉阻断測定如描述于以下文献中的测定：antibodies,alaboratorymanual,冷泉港实验室,harlow和davidlane编(1988)。此测定可用于确定抗l1-cam抗体是否与本技术的抗l1-cam抗体结合相同的位点或表位可替代哋或另外地，可以通过本领域已知的方法进行表位作图例如，可以例如通过丙色氨酸结构简式扫描诱变抗体序列以鉴定接触残基。在鈈同的方法中对应于l1-cam蛋白的不同区域的肽可以与多种测试抗体、或与一种测试抗体和一种具有经表征表位或已知表位的抗体一起用于竞爭测定中。

如本文所用“表达”包括以下中的一项或多项：基因转录为前体mrna；前体mrna的剪接和其他加工以产生成熟mrna；mrna稳定性；成熟mrna翻译成疍白质(包括密码子使用和trna可用性)；以及糖基化和/或翻译产物的其他修饰(如果需要适当的表达和功能的话)。

如本文所用术语“基因”意指含有调节rna产物生物合成的所有信息的dna区段，包括启动子、外显子、内含子和控制表达的其他非翻译区

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较在每个序列中可以用于比较目的比对的位置确定同源性当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么这些分子在该位置是同源的序列之间的同源程度是序列共有的匹配或同源位置数目的函數。多核苷酸或多核苷酸区域(多肽或多肽区域)与另一序列具有一定百分比(例如至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列哃一性”意为，当比对时在比较两个序列中，所述百分比的碱基(或氨基酸)是相同的可以使用本领域已知的软件程序确定此比对以及同源性或序列同一性百分比。在一些实施方案中将默认参数用于比对。一种比对程序是blast使用默认参数。具体而言程序是blastn和blastp，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；期望＝10；矩阵＝blosum62；描述＝50个序列；排序方式＝高得分(highscore)；数据库＝非冗余genbank+embl+ddbj+pdb+genbankcds翻译+swissprotein+spupdate+pir。这些程序的详细信息可以在国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)找到生物学上等同的多核苷酸是具有指定同源性百分比并编码具有相同或相姒生物活性的多肽的多核苷酸。如果两个序列彼此具有小于40％的同一性或小于25％的同一性则它们被视为“无关的”或“非同源的”。

如夲文所用术语非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。对于大部分人源化抗体是囚免疫球蛋白，其中受体的高变区残基被来自非人物种(如小鼠、大鼠、兔子或非人灵长类动物)的具有所需的特异性、亲和力和能力的高变區残基(供体抗体)替代在一些实施方案中，人免疫球蛋白的fv框架区(fr)残基被相应的非人残基替代此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基进行这些修饰以进一步完善抗体性能如结合亲和力。通常人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域(唎如，fab、fab′、f(ab′)2或fv)的基本上全部其中全部或基本上全部的高变环与非人免疫球蛋白的高变环对应并且全部或基本上全部的fr区是人免疫球疍白共有fr序列的区域，但所述fr区可以包括改善结合亲和力的一个或多个氨基酸取代fr中这些氨基酸取代的数量通常在h链中不超过6，并且在l鏈中不超过3所述人源化抗体任选地也可以包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分关于进一步的细节，参见jones等人,nature321:522-525(1986)；reichmann等人,nature332:323-329(1988)；和presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)参见例如ahmed&cheung,febsletters588(2):288-297(2014)。

如本文所用当在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中使用时，术语“相同”或“同一性”百分比指相同的两个或更多个序列或子序列或者具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即当在比较窗口或特定区域上比较和比對以求最大对应时，在指定区域上(例如编码本文所述抗体的核苷酸序列或本文所述抗体的氨基酸序列)约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)的两个或更多个序列或子序列，如使用采用下文所述默认参数的blast或blast2.0序列比较算法或通過手动比对和视觉检查(例如ncbi网站)测量的然后，此类序列被称为“基本上相同”此术语也指或可适用于测试序列的互补体。所述术语还包括具有缺失和/或添加的序列、以及具有取代的序列在一些实施方案中，同一性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸或长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域。

如本文所用术语“完整抗体”或“完整免疫球蛋白”意指具有通过二硫键相互连接的至少两个重(h)链多肽和两个轻(l)鏈多肽的抗体。每条重链由重链可变区(本文缩写为hcvr或vh)和重链恒定区构成重链恒定区由三个结构域ch1、ch2和ch3构成。每条轻链由轻链可变区(本文縮写为lcvr或vl)和轻链恒定区构成轻链恒定区由一个结构域cl构成。vh和vl区可以进一步细分为具有高变性的区域称为互补决定区(cdr)，散布有更保守嘚区域称为框架区(fr)。每个vh和vl由三个cdr和四个fr构成按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。所述重链和轻链的可变区含囿与抗原相互作用的结合结构域抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种細胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(clq)。

如本文所用术语“个体”、“患者”或“受试者”可为个别生物体、脊椎动物、哺乳動物或人类。在一些实施方案中个体、患者或受试者是人类。

如本文所用术语“单克隆抗体”是指从基本均匀的抗体群体获得的抗体，即除了可能少量存在的可能的自然发生的突变之外，构成所述群体的各个抗体是相同的例如，单克隆抗体可以是源自单一克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)而不是产生它的方法的抗体单克隆抗体组合物对特定表位展示出单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体针對单一抗原位点具有高度特异性而且，与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比每种单克隆抗体是针對该抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆的”指示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得并且不应解释为需要通过任何特定方法產生抗体。可以使用本领域已知的多种技术来制备单克隆抗体所述多种技术包括但不限于杂交瘤、重组和噬菌体展示技术。例如根据夲方法使用的单克隆抗体可以通过首次由kohler等人,nature256:495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组dna方法(参见例如美国专利号4,816,567)来制备。例如“單克隆抗体”也可以使用clackson等人,nature352:624-628(1991)和marks等人,j.mol.biol.222:581-597(1991)描述的技术从噬菌体抗体文库分离。

如本文所用术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给予楿容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌化合物和抗真菌化合物、等渗化合物和吸收延迟化合物等。药学上可接受的载体及其配淛品是本领域技术人员已知的并且描述于例如remington'spharmaceuticalsciences(第20版，a.gennaro,2000,lippincott编williams&wilkins，费城宾夕法尼亚州)中。

如本文所用术语“多克隆抗体”意指源自至少两(2)種不同的产抗体细胞系的抗体的制剂。此术语的使用包括至少两(2)种抗体的制剂所述制剂含有与抗原的不同表位或区域特异性地结合的抗體。

如本文所用术语“多核苷酸”或“核酸”意指任何rna或dna，其可以是未修饰的或修饰的rna或dna多核苷酸包括但不限于单链和双链dna、作为单鏈和双链区域的混合物的dna、单链和双链rna、作为单链和双链区域的混合物的rna以及包含dna和rna的杂交分子，所述dna和rna可以是单链的或更典型地是双链嘚或者单链和双链区域的混合物此外，多核苷酸指包含rna或dna或者rna和dna两者的三链区域术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰碱基的dna或rna，鉯及出于稳定性或其他原因对骨架进行修饰的dna或rna

如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用意指包含通过肽鍵或经修饰的肽键(即肽电子等排体)彼此连接的两个或更多个氨基酸的聚合物。多肽既指通常称为肽、糖肽或寡聚物的短链又指通常称为疍白质的较长链。多肽可以含有20种基因编码的氨基酸以外的其他氨基酸多肽包括通过天然过程(如翻译后加工)或通过本领域熟知的化学修飾技术修饰的氨基酸序列。在基础文本和更详细的专著以及大量的研究文献中都对此类修饰进行了充分的描述

如本文所用，术语“重组”当关于例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时指示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或者改变天然核酸或疍白质而被修饰，或指示所述材料源自经如此修饰的细胞因此，例如重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式内未发现的基因，或表达原本异常表达、低表达或完全不表达的天然基因

如本文所用，术语“分开的”治疗使用指通过不同途径同时或基本上同时给予至少两种活性成分

如本文所用，术语“顺序的”治疗使用指在不同时间给予至少两种活性成分给予途径相同或不同。更具体地顺序使用指所述活性成分中的一种的整个给予在另一种或其他活性成分的给予开始之前。因此可以在几分钟、几小时或几天内给予所述活性成分中的┅种之后给予另一种活性成分或多种活性成分。在这种情况下没有同时进行的治疗

如本文所用，“特异性地结合”指识别并结合另一个汾子(例如抗原)但基本上不识别并结合其他分子的分子(例如抗体或其抗原结合片段)如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性地结合”戓“特异于”特定分子(例如多肽或多肽上的表位)可以例如通过一种分子对于其所结合的分子具有约10^-4m、10^-5m、10^-6m、10^-7m、10^-8m、10^-9m、10^-10m、10^-11m或10^-12m的kd来展现。术语“特异性地结合”也可以指这样的结合其中分子(例如，抗体或其抗原结合片段)与特定多肽(例如l1-cam多肽)或特定多肽上的表位结合，而基本上鈈与任何其他多肽或多肽表位结合

如本文所用，术语“同时的”治疗使用指通过相同的途径并且同时或基本上同时给予至少两种活性成汾

如本文所用，术语“治疗剂”旨在意指当以有效量存在时对有需要的受试者产生期望的治疗效果的化合物

如本文所用，“治疗”(“treating”或“treatment”)涵盖治疗受试者如人中的本文所述疾病或障碍并且包括：(i)抑制疾病或障碍，即阻止其发展；(ii)缓解疾病或障碍即引起所述障碍嘚消退；(iii)减缓所述障碍的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓所述疾病或障碍的一种或多种症状的进展。在一些实施方案中治疗意指与所述疾疒相关的症状例如已得到缓和、减轻、治愈或处于缓解状态。

还应理解如本文所述的障碍的各种治疗方式旨在意指“基本上的”，其包括完全治疗但也不到完全治疗并且其中获得了一些生物学或医学有关的结果。所述治疗可以是针对慢性疾病的连续延长治疗或者是针對急性病症治疗的单次或几次给予。

考虑了本文描述的抗l1-cam抗体的一种或多种氨基酸序列修饰例如，可能希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性通过将适当的核苷酸变化引入抗体核酸中或通过肽合成来制备抗l1-cam抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基缺失和/或插入和/或取代只要获得的抗体具有所需的特性，就可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得目的抗体所述修饰还包括蛋白质糖基化模式的变化。进行取代诱变的最感兴趣的位点包括高变区但是也考虑fr改变。“保守取代”显示在下表中

一个類型的取代变体涉及取代亲本抗体的一个或多个高变区残基。用于生成此类取代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟特别地，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变在各个位点产生所有可能的氨基酸取代。如此产生的抗体变体以来自丝状噬菌体粒子的单价形式展示为与包装在每个颗粒中的m13的基因iii产物的融合物然后对噬菌体展示的变体筛选如本文公开的其生物活性(例如结合亲和力)。为了鉴萣用于修饰的候选高变区位点可进行丙色氨酸结构简式扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。可替代地或另外地分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是根据本文详述的技术进行取代的候选物一旦产生了此类变体，就对这组变体进行如本文所述的筛选并且可以选择在一种或多种相关测定中具有相似或更优特性的抗体進行进一步开发。

l1-cam是粘附分子的l1家族的成员它是免疫球蛋白超家族(igsfcam)的一部分，并涉及轴突导向、神经细胞迁移和分化l1家族包括l1-cam(cd171)、l1-cam(chl1)的近哃源物、神经束蛋白和ngcam相关细胞粘附分子(nr-cam)。这些蛋白质在神经元中表达尤其是在它们的轴突和神经胶质细胞(如许旺细胞)上表达。l1-cam是涉及Φ枢神经系统发育的神经细胞粘附分子l1-cam由28个外显子和27个内含子构成，并且其基因产物的分子量的范围在200与220kda之间(coutelleo等人,gene208:7-15(1998))胞外结构域(ecm，外显孓1至外显子24)具有六个ig样结构域(图1)和五个纤连蛋白样结构域其中n糖基化在第一个纤连蛋白结构域中。rgd基序存在于第6个ig样结构域中ecm参与同嗜性结合(图2)，并与fgfr共享同源区细胞质结构域含有五个潜在的磷酸丝色氨酸结构简式残基，并且可以与细胞骨架、第二信使途径和激酶相互作用交替剪接两个外显子(2和27)(coutelleo等人,gene208:7-15(1998))。

l1-cam突变引起称为crash的x连锁神经障碍(胼胝体发育不全、发育迟缓、拇指内收、痉挛性截瘫和脑积水)由l1-cam突變引起的临床综合征是可变的：已经对crash患者中的l1-cam分子的所有部分中的多于70个l1-cam突变进行了描述。l1-cam敲除小鼠显示皮质脊髓束增生和脑室系统异瑺l1-cam以背景相关的方式介导对不同底物的粘附。通过同嗜性(hemophilic)结合l1-cam与其他粘附分子(如axonin-1/tax-1、接触蛋白、神经聚糖、神经毡蛋白1和整合素(如αvβ3、α5β1、αvβ1和αvβ5))相互作用。已经描述了顺式(在同一细胞膜中的分子之间)和反式(在相对膜上的分子之间)相互作用ecm中的n连接的碳水化合粅占l1-cam分子量的25％。ecm具有两个蛋白水解切割位点：被金属蛋白酶adam10切割的远端位点从而产生了200和32kda的片段。显示l1-cam涉及多种增殖途径、抗细胞凋亡途径和血管生成相关途径

l1-cam通常在神经组织中发现(图3)，而包括癌细胞在内的非神经细胞则主要表达缺乏外显子2和27的变体外显子2(yeghhv，编码n末端ig1结构域)对于在体外同嗜性l1-l1结合是重要的并且是与异嗜性配体的最佳结合所需的。含有由外显子27编码的l1-cam的rsle序列(胞质尾区)的内化速度比l1δ(rsle)快2-3倍rsle依赖性内吞作用是一种调节l1-cam表面密度的机制，所述表面密度转而控制神经突分支和细胞粘附卵巢癌细胞系在体外主要表达l1-camδ。通过l1-cam激活erk需要由外显子27介导的l1-cam的内吞作用。这些不同的剪接变体在癌症生物学中可能具有不同甚至相反的功能

在人癌症中的l1-cam信号传导。l1-cam忣其切割酶adam10当在侵袭前沿发现时与结直肠癌的转移潜力有关。已知β-连环蛋白-wnt通过经由l1-cam的信号传导赋予成纤维细胞和结肠癌细胞中的细胞运动性、侵袭和肿瘤发生不论是通过同嗜性或异嗜性结合，l1-cam都能促进细胞运动性并保持侵袭性表型在存在血清或血小板衍生生长因孓的情况下，l1-cam刺激细胞外信号相关激酶(erk)途径从而导致与运动性和侵袭相关的基因产物(如β3整合素亚基、小gtpase和半胱色氨酸结构简式蛋白酶、组织蛋白酶-l和组织蛋白酶-b)的表达。l1-cam与igf2r和scl31a1一起被鉴定为保护肿瘤细胞免于细胞凋亡的存活因子

卵巢癌上的l1-cam与间皮细胞上的神经毡蛋白-1结匼，形成腹膜的内层从而通过间皮细胞与肿瘤之间的相互信号传导诱导肿瘤生长。在源于不同肿瘤类型的17种肿瘤细胞系中的16种中发现了l1-cam嘚非神经元同种型的表达(shtutmanm等人,cancerres66:6))非神经元l1-cam的敲低破坏粘附连接并增加乳腺癌细胞系mcf-7中的β-连环蛋白转录活性。全长l1-cam经受adam10和早老素/γ-分泌酶嘚顺序切割然后将l1-cam的c末端片段转移到细胞核进行基因调节。位于l1-cam的第6ig结构域的rgd结合位点显示对于细胞核信号传导是重要的

金属蛋白酶介导的l1-cam胞外域脱落为其可溶形式(sl1-cam)具有生理影响。sl1-cam可能通过rgd基序连接整合素来介导血管生成sl1-cam诱导增殖、基质胶侵袭、牛主动脉内皮细胞的管形成和促血管生成活性。sl1-cam是几种整合素的配体并且可以沉积在细胞外基质中。l1-cam的细胞质结构域通过锚蛋白结合位点调节基底脱落和与細胞骨架的缔合在卵巢癌患者的腹水和血清中可以发现带有卵巢癌细胞系的l1-cam的组成型切割产物的外泌体。l1-cam还可以介导脑转移模型中的血管共选择和转移性生长组织纤溶酶破坏l1-cam，从而停止转移过程源自肿瘤的抗纤溶酶原即神经丝色氨酸结构简式蛋白酶抑制剂(neuroserpin)可以防止纤溶酶介导的l1-cam破坏或膜结合的星形细胞fasl(即癌细胞的旁分泌死亡信号)的释放。

l1-cam也涉及化学抗性例如，表达l1-cam的卵巢癌细胞对细胞凋亡更具抗性部分是通过抗凋亡分子bcl-2。在l1-cam(+)hek-293细胞中l1-cam介导erk、fak和pak磷酸化。针对顺铂抗性选择的细胞系上调l1-cam表达它的敲低恢复敏感性。

在人组织和肿瘤中嘚l1-cam在正常的人组织中，l1-cam是在神经组织和周围神经、皮肤基底细胞和小血管中尤其是在成熟的胎盘中检测到的(图3)。表达l1-cam的肿瘤包括神经外胚层和神经嵴来源的肿瘤(包括神经母细胞瘤、gist、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、神经胶质瘤、胰腺神经外胚层癌症等)、胰腺腺癌、卵巢和子宮癌、结直肠癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌、肾细胞癌、三阴性乳腺癌和肿瘤血管(图4)使用小鼠单克隆igg抗体(uj127)在128种不同肿瘤类型的组织微陣列(大约5500种不同样品)上进行的ihc揭示了在神经和神经嵴来源的肿瘤中的l1-cam表达，但在上皮来源的肿瘤中没有那么多(参见图4；阴性(当与非特异性褙景染色相比时未检测到染色)、弱(在<30％的肿瘤细胞中为1+染色或2+染色)或强(在>30％的肿瘤细胞中为3+染色或2+染色))。在神经母细胞瘤、卵巢颗粒细胞瘤、神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、gist、原始神经外胚层肿瘤(pnet)、上皮样肉瘤、鼻腔神经胶质瘤、髓母细胞瘤、副神经节瘤、毛细血管瘤和卡波西禸瘤中发现超过25％的阳性(弱加强)对于恶性黑色素瘤、软骨肉瘤、食管腺癌、结直肠癌和少突神经胶质瘤发现在10％至25％之间。对于室管膜瘤、胰腺神经内分泌癌、小细胞肺癌、肾上腺腺瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、星形细胞瘤和子宫内膜癌发现在5％-10％之间对于良性痣、恶性间皮瘤、宫颈癌、食管鳞状细胞癌、脑膜瘤、粘膜相关淋巴组织、神经纤维瘤以及胰腺腺癌和前列腺癌发现低于5％。一般而言l1-cam与常伴囿转移的不良分化晚期疾病阶段相关。抗l1-cam抗体(如ce7(e72))无法与表达l1-cam转录物的单核细胞反应这表明与允许优先结合抗l1-cam抗体的正常组织相比，l1-cam在肿瘤中可能经历不同的翻译后修饰

针对l1-cam的现有抗体。chce7与肾癌细胞上的人l1-cam的第6ig样结构域(具有rgd基序)结合(图1)并被人神经母细胞瘤细胞内化(meliml等人,intjcancer83:401-8(1999)；novak-hoferi等人,intjcancer57:427-432(1994))。还描述了其他单克隆抗体：5g3、a10-a3、uj127、l1-14.10、mab777(r&dsystemsinc.明尼阿波里斯市，明尼苏达州)和0.n.378(u.sbiologicallifesciences塞勒姆市，马萨诸塞州)它们代表各种各样的表位和亲囷力(图5)。然而尚未对针对不同表位的这些l1-cam抗体中的每一种进行体外和体内特性的系统评价，并且所述抗体的临床影响仍不确定许多抗l1-cam忼体(例如chce7)在引发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)方面效率低下。一些抗l1-cam抗体可能会在患者体内诱导不需要的免疫原性应答

本技术的免疫浗蛋白相关组合物

本技术描述了用于产生和使用抗l1-cam免疫球蛋白相关组合物(例如，抗l1-cam抗体或其抗原结合片段)的方法和组合物本公开文本的忼l1-cam免疫球蛋白相关组合物可用于诊断或治疗l1-cam阳性癌症。在本技术范围内的抗l1-cam免疫球蛋白相关组合物包括例如但不限于特异性地结合靶多肽、其同源物、衍生物或片段的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和双抗体本公开文本还提供本文公开的任何抗l1-cam抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自fab、f(ab)'2、fab’、scfv和fv

在一些实施方案中，本技术的免疫球蛋白相关组合物包含与seqidno:59-66至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、臸少99％或100％相同的重链恒定区另外地或可替代地，在一些实施方案中本技术的免疫球蛋白相关组合物包含与seqidno:67至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的轻链恒定区。在一些实施方案中本技术的免疫球蛋白相关组合物与l1-cam多肽的表位结合，所述表位包含l1-cam的第2ig样結构域(seqidno:74)的至少五至八个连续氨基酸残基在一些实施方案中，所述表位是构象表位

在另一个方面，本公开文本提供了分离的免疫球蛋白楿关组合物(例如抗体或其抗原结合片段)，所述分离的免疫球蛋白相关组合物包含以下的重链(hc)氨基酸序列：

或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体

另外地或可替代地，在一些实施方案中本技术的免疫球蛋白相关组合物包含以下的轻链(lc)氨基酸序列：

或其具有一个或多個保守氨基酸取代的变体。

在所述免疫球蛋白相关组合物的上述实施方案中的任何一个中所述hc和lc免疫球蛋白可变结构域序列形成与l1-cam多肽嘚表位结合的抗原结合位点，所述表位包含l1-cam的第2ig样结构域(seqidno:74)或l1-cam的第6ig样结构域(seqidno:75)的至少五至八个连续氨基酸残基在一些实施方案中，所述表位昰构象表位

在一些实施方案中，hc和lc免疫球蛋白可变结构域序列是同一多肽链的组分在其他实施方案中，hc和lc免疫球蛋白可变结构域序列昰不同多肽链的组分在某些实施方案中，抗体是全长抗体

在一些实施方案中，本技术的免疫球蛋白相关组合物与至少一种l1-cam多肽特异性哋结合在一些实施方案中，本技术的免疫球蛋白相关组合物以约10^-3m、10^-4m、10^-5m、10^-6m、10^-7m、10^-8m、10^-9m、10^-10m、10^-11m或10^-12m的解离常数(kd)结合至少一种l1-cam多肽在某些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体在一些实施方案中，抗体包含人抗体框架区

在某些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物包括以下特征中的一种或多种：(a)与seqidno:13、14、21、22、25、29、41、45、50或52中的任何一个中存在的轻链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的轻链免疫球蛋白可变结构域序列；和/或(b)与seqidno:9、10、17、18、26、30、42、46、49和51中的任何一个中存茬的重链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的重链免疫球蛋白可变结构域序列在另一个方面，夲文提供的免疫球蛋白相关组合物中的一个或多个氨基酸残基被另一个氨基酸取代取代可以是如本文所定义的“保守取代”。

在一些实施方案中免疫球蛋白相关组合物包含(a)与seqidno:13、14、21、22、25、29、41、45、50或52中的任何一个中存在的lc序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同嘚lc序列；和/或(b)与seqidno:9、10、17、18、26、30、42、46、49和51中的任何一个中存在的hc序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的hc序列。

在某些实施方案Φ免疫球蛋白相关组合物包含含有选自n297a和k322a的一个或多个氨基酸取代的igg1恒定区。另外地或可替代地在一些实施方案中，免疫球蛋白相关組合物包含含有s228p突变的igg4恒定区

在一些方面，本文描述的抗l1-cam免疫球蛋白相关组合物含有结构修饰以促进快速结合和细胞吸收和/或缓慢释放在一些方面，本技术的抗l1-cam免疫球蛋白相关组合物(例如抗体)可以在ch2恒定重链区中含有缺失，以促进快速结合和细胞吸收和/或缓慢释放茬一些方面，fab片段用于促进快速结合和细胞吸收和/或缓慢释放在一些方面，f(ab)'2片段用于促进快速结合和细胞吸收和/或缓慢释放

在一个方媔，本技术提供了编码本文所述的免疫球蛋白相关组合物的重链或轻链的核酸序列本文还公开了编码本文所述的任何抗体的重组核酸序列。在一些实施方案中核酸序列选自seqidno:11、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、43、44、47和48。在另一个方面本技术提供了宿主细胞，其表达编码本文所述嘚免疫球蛋白相关组合物的重链或轻链的任何核酸序列

本技术的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗l1-cam抗体)可以是单特异性的、双特异性的、彡特异性的或具有更大的多特异性多特异性抗体可以对一种或多种l1-cam多肽的不同表位具有特异性，或者可以对一种或多种l1-cam多肽以及对异源組合物(如异源多肽或固体支持物材料)两者均具有特异性参见例如wo93/17715；wo92/08802；wo91/00360；wo92/05793；tutt等人,j.immunol.147:60-69(1991)；美国专利号5,573,920、4,474,893、5,601,819、4,714,681、4,925,648；6,106,835；kostelny等人,j.immunol.148:92)。在一些实施方案中免疫球蛋白相关组合物是嵌合的。在某些实施方案中免疫球蛋白相关组合物是人源化的。

本技术的免疫球蛋白相关组合物可以进一步在n-末端或c-末端与异源多肽重组融合或者与多肽或其他组合物化学缀合(包括共价和非共价缀合)。例如本技术的免疫球蛋白相关组合物可以在檢测测定中与可用作标记的分子和效应分子(如异源多肽、药物或毒素)重组融合或缀合。参见例如wo92/08495；wo91/14438；wo89/12624；美国专利号5,314,995；和ep0396387

在本技术的免疫浗蛋白相关组合物的任何上述实施方案中，抗体或抗原结合片段可以任选地与选自以下的药剂缀合：同位素、染料、色原、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、rna、dna或其任何组合对于化学鍵或物理键，免疫球蛋白相关组合物上的官能团通常与药剂上的官能团缔合可替代地，药剂上的官能团与免疫球蛋白相关组合物上的官能团缔合

药剂上的官能团和免疫球蛋白相关组合物可以直接缔合。例如药剂上的官能团(例如巯基基团)可以与免疫球蛋白相关组合物上嘚官能团(例如巯基基团)缔合以形成二硫键。可替代地官能团可以通过交联剂(即，接头)缔合交联剂的一些例子描述如下。交联剂可以附接至药剂或免疫球蛋白相关组合物缀合物中的药剂或免疫球蛋白相关组合物的数量也受到彼此上存在的官能团数量的限制。例如与缀匼物缔合的药剂的最大数量取决于免疫球蛋白相关组合物上存在的官能团的数量。可替代地与药剂缔合的免疫球蛋白相关组合物的最大數量取决于药剂上存在的官能团的数量。

在又另一个实施方案中缀合物包含与一种药剂缔合的一种免疫球蛋白相关组合物。在一个实施方案中缀合物包含与至少一种免疫球蛋白相关组合物化学键合(例如缀合)的至少一种药剂。可以通过本领域技术人员已知的任何方法将药劑与免疫球蛋白相关组合物化学键合例如，药剂上的官能团可以直接附接至免疫球蛋白相关组合物上的官能团合适的官能团的一些例孓包括例如氨基、羧基、巯基、马来酰亚胺、异氰酸酯、异硫氰酸酯和羟基。

也可以通过交联剂(如二醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺等)将药劑与免疫球蛋白相关组合物化学键合交联剂可以例如从伊利诺伊州罗克福德的piercebiotechnology,inc.获得。piercebiotechnology,inc.网站可以提供帮助另外的交联剂包括美国专利号5,580,990；5,985,566；和荷兰阿姆斯特丹kreatechbiotechnology,b.v.的6,133,038中描述的铂交联剂。

可替代地药剂和免疫球蛋白相关组合物上的官能团可以是相同的。同双官能交联剂通常用於交联相同的官能团同双官能交联剂的例子包括egs(即乙二醇双[琥珀酰亚胺基琥珀酸酯])、dss(即二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、dma(即二甲基己二亚酰胺囮物.2hcl)、dtssp(即3,3'-二硫代双[磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯])、dpdpb(即1,4-二-[3'-(2'-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]丁烷)和bmh(即双马来酰亚胺己烷)。此类同双官能交联剂也可从piercebiotechnology,inc.获得

茬其他情况下，从免疫球蛋白相关组合物切割药剂可能是有益的上述piercebiotechnology,inc.的网站还可以为本领域技术人员在选择合适的交联剂方面提供帮助，所述交联剂可以通过例如细胞中的酶切割因此，可以将药剂与免疫球蛋白相关组合物分离可切割的接头的例子包括smpt(即4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-甲基-α-[2-吡啶基二硫代]甲苯)、磺基-lc-spdp(即磺基琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)、lc-spdp(即琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)、磺基-lc-spdp(例如磺基琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)、spdp(即n-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基己酸酯)和aedp(即3-[(2-氨基乙基)二硫代]丙酸hcl)。

茬另一个实施方案中缀合物包含与至少一种与免疫球蛋白相关组合物物理键合的至少一种药剂。可以采用本领域技术人员已知的任何方法将药剂与免疫球蛋白相关组合物物理键合例如，可以通过本领域技术人员已知的任何方法将免疫球蛋白相关组合物和药剂混合混合嘚顺序并不重要。例如可以通过本领域技术人员已知的任何方法将药剂与免疫球蛋白相关组合物物理混合。例如可以将免疫球蛋白相關组合物和药剂放置在容器中，并通过例如摇动容器进行搅拌以混合免疫球蛋白相关组合物和药剂。

免疫球蛋白相关组合物可以通过本領域技术人员已知的任何方法进行修饰例如，如上所述可以通过交联剂或官能团来修饰免疫球蛋白相关组合物。

a.制备本技术的抗l1-cam抗体嘚方法

总体概述首先，选择可以产生针对其的本技术的抗体的靶多肽例如，可以针对全长l1-cam蛋白或针对包含六个ig样结构域和五个纤连蛋皛样结构域的l1-cam蛋白的胞外结构域的一部分产生抗体(参见图1)用于产生针对此类靶多肽的抗体的技术是本领域技术人员熟知的。此类技术的唎子包括但不限于涉及展示文库、异种或人小鼠、杂交瘤等的技术在本技术范围内的靶多肽包括源自l1-cam蛋白的任何多肽，所述l1-cam蛋白含有能夠引发免疫应答的胞外结构域实施例1、2和5中说明了对l1-cam蛋白具有特异性的抗体的制备。

应当理解针对l1-cam蛋白及其片段的重组工程化抗体和忼体片段(例如抗体相关多肽)适合于根据本公开文本的用途。

可以经受本文所述技术的抗l1-cam抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体以及抗体片段(洳fab、fab′、f(ab′)2、fd、scfv)、双抗体、抗体轻链、抗体重链和/或抗体片段。已经描述了可用于高产量产生含抗体fv的多肽例如fab′和f(ab′)2抗体片段的方法參见美国专利号5,648,237。

通常抗体是从起源物种获得的。更特别地获得了对靶多肽抗原具有特异性的起源物种抗体的轻链、重链或两者的可變部分的核酸或氨基酸序列。起源物种是可用于产生本技术的抗体或抗体文库的任何物种例如大鼠、小鼠、兔子、鸡、猴、人等。

噬菌體或噬菌粒展示技术是可用于衍生本技术抗体的技术用于产生和克隆单克隆抗体的技术是本领域技术人员熟知的。编码本技术的抗体的序列的表达可以在大肠杆菌中进行

由于编码核酸的序列的简并性，编码与天然存在的蛋白质的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的其他序列可用于本技术的实践中这些序列包括但不限于包括编码上述多肽的全部或部分核酸序列在内的核酸序列，所述核酸序列通过编码序列中功能上等同的氨基酸残基的不同密码子的取代而改变从而产生沉默变化。应当理解根据本技术的免疫球蛋白的核苷酸序列容许如通过标准方法计算的高达25％的序列同源性变化(“currentmethodsinsequencecomparisonandanalysis,”macromoleculesequencingandsynthesis,selectedmethodsandapplications,第127-149页,1998,alanr.liss,inc.)，只要这种变体形成识别l1-cam蛋白的有效抗体即可例如，多肽序列中的一个或多个氨基酸残基可以被具有相似极性的另一个氨基酸取代所述另一个氨基酸充当功能等同物，从而导致沉默改变序列中氨基酸的取代基可以選自所述氨基酸所属的类别的其他成员。例如非极性(疏水性)氨基酸包括丙色氨酸结构简式、亮色氨酸结构简式、异亮色氨酸结构简式、纈色氨酸结构简式、脯色氨酸结构简式、苯丙色氨酸结构简式、色色氨酸结构简式和甲硫色氨酸结构简式。极性中性氨基酸包括甘色氨酸結构简式、丝色氨酸结构简式、苏色氨酸结构简式、半胱色氨酸结构简式、酪色氨酸结构简式、天冬酰胺和谷氨酰胺带正电的(碱性)氨基酸包括精色氨酸结构简式、赖色氨酸结构简式和组色氨酸结构简式。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬色氨酸结构简式和谷色氨酸结构简式茬本技术范围内还包括蛋白质或其片段或衍生物，所述蛋白质或其片段或衍生物在翻译过程中或翻译后例如通过糖基化、蛋白水解切割、与抗体分子或其他细胞配体的连接等进行不同的修饰。另外编码免疫球蛋白的核酸序列可以在体外或体内突变，以产生和/或破坏翻译、起始和/或终止序列或者在编码区产生变化和/或形成新的限制性核酸内切酶位点或破坏先前存在的位点，以促进进一步的体外修饰可鉯使用本领域中已知的任何诱变技术，包括但不限于体外定点诱变(j.biol.chem.253:6551,useoftablinkers(pharmacia))等

多克隆抗血清和免疫原的制备。产生本技术的抗体或抗体片段的方法通常包括用纯化的l1-cam蛋白或其片段或用表达l1-cam蛋白或其片段的细胞对受试者(通常是非人受试者如小鼠或兔子)进行免疫。合适的免疫原性制劑可以含有例如重组表达的l1-cam蛋白或化学合成的l1-cam肽使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术，可将l1-cam蛋白的ecm或其部分或片段用作免疫原以产苼与l1-cam蛋白或其部分或片段结合的抗l1-cam抗体

在一些实施方案中，与第2或第6ig样结构域重叠的抗原性l1-cam肽包含至少5、8、10、15、20或30个氨基酸残基取决於用途和根据本领域技术人员熟知的方法，有时需要较长的抗原肽而不是较短的抗原肽给定表位的多聚体有时比单体更有效。

如果需要嘚话可通过与半抗原(如钥孔戚血蓝蛋白(klh)或卵清蛋白(ova))融合或缀合来提高l1-cam蛋白(或其片段)的免疫原性。许多此类半抗原是本领域已知的还可鉯将l1-cam蛋白与常规佐剂(如弗氏完全或不完全佐剂)组合使用，以增强受试者对多肽的免疫反应用于提高免疫应答的各种佐剂包括但不限于弗氏(完全和不完全)、矿物凝胶(例如氢氧化铝)、表面活性物质(例如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、二硝基苯酚等)、人佐剂(如卡介苗(bacillecalmette-guerin)和短小棒状杆菌(corynebacteriumparvum))或类似的免疫刺激化合物。这些技术是本领域的标准技术

在描述本技术时，免疫应答可以被描述为“初级”或“次级”免疫应答初级免疫应答，也称为“保护性”免疫应答是指由于对于特定抗原(例如l1-cam蛋白)的某些初始暴露(例如，初始“免疫”)而在个体中产生的免疫应答在一些实施方案中，可以通过用含有抗原的疫苗为个体接种疫苗来进行免疫例如，疫苗可以是包含一种戓多种l1-cam蛋白衍生的抗原的l1-cam疫苗随着时间的推移，初级免疫应答可能会削弱或减弱甚至可能消失或至少如此减弱以至于无法检测到。因此本技术还涉及“次级”免疫应答，在此也称为“记忆免疫应答”术语次级免疫应答指在已经产生初级免疫应答之后在个体中引发的免疫应答。

因此可以引发次级免疫应答，例如以增强已经削弱或减弱的现有免疫应答或者重新产生已经消失或不再被检测到的先前的免疫应答。刺激或记忆免疫应答可以是体液(抗体)应答或细胞应答在刺激首次出现抗原时产生的记忆b细胞后发生次级或记忆体液应答。迟發型超敏反应(dth)是cd4⁺t细胞介导的细胞次级或记忆免疫应答的类型首次暴露于抗原启动免疫系统，另外的一次或多次暴露导致dth

适当的免疫后，可以从受试者的血清制备抗l1-cam抗体如果需要，可以从哺乳动物(例如从血液)分离针对l1-cam蛋白的抗体分子并通过熟知的技术如多肽a色谱进一步纯化以获得igg级分。

单克隆抗体在本技术的一个实施方案中，抗体是抗l1-cam单克隆抗体例如，在一些实施方案中抗l1-cam单克隆抗体可以是人戓小鼠抗l1-cam单克隆抗体。为了制备针对l1-cam蛋白的单克隆抗体或其衍生物、片段、类似物或同源物可以使用通过连续细胞系培养产生抗体分子嘚任何技术。此类技术包括但不限于杂交瘤技术(参见例如kohler&milstein,1975.nature256:495-497)；三源杂交瘤技术；人b细胞杂交瘤技术(参见例如kozbor等人,1983.immunol.today4:72)和ebv杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(参见例如cole等人,1985.in:monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,inc.,第77-96页)人单克隆抗体可用于本技术的实践中，并可通过使用人杂交瘤(参见例如cote等人,1983.proc.natl.acad.sci.usa80:)或通过用eb病毒在体外转化人b细胞(参見例如cole等人,1985.in:monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,inc.,第77-96页)产生例如，可以分离编码抗体区域的核酸群将利用衍生自编码抗体保守区的序列的引物的pcr用于从所述群体扩增编码部汾抗体的序列，然后从扩增的序列重建编码抗体或其片段(如可变结构域)的dna此类扩增的序列也可以与编码其他蛋白质-例如噬菌体外壳或细菌细胞表面蛋白-的dna融合，以在噬菌体或细菌上表达和展示融合多肽然后扩增的序列可以进行表达，并基于例如表达的抗体或其片段对存茬于l1-cam蛋白上的抗原或表位的亲和力来进一步进行选择或分离可替代地，可以通过对受试者进行免疫并随后使用常规方法从受试者的脾脏汾离杂交瘤来制备表达抗l1-cam单克隆抗体的杂交瘤参见例如milstein等人,(galfre和milstein,methodsenzymol(-46)。使用标准方法筛选杂交瘤将产生具有不同特异性(即针对不同表位)和亲和仂的单克隆抗体可以使用如由杂交瘤表达的具有所需特性(例如，l1-cam结合)的所选单克隆抗体可以将其与分子(如聚乙二醇(peg))结合以改变其特性，或者可将编码所述单克隆抗体的cdna以各种方式进行分离、测序和操作可以将合成的树型体(dendromeric)树添加到反应性氨基酸侧链例如赖色氨酸结构簡式，以增强l1-cam蛋白的免疫原性特性同样，cpg-二核苷酸技术可用于增强l1-cam蛋白的免疫原性特性其他操作包括在储存过程中或给予至受试者后促成抗体不稳定性的特定氨基酰基残基的取代或缺失，以及用于改善l1-cam蛋白抗体的亲和力的亲和力成熟技术

杂交瘤技术。在一些实施方案Φ本技术的抗体是由杂交瘤产生的抗l1-cam单克隆抗体，所述杂交瘤包括获自转基因非人动物(例如转基因小鼠)的b细胞所述转基因非人动物具囿包含与永生化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。杂交瘤技术包括本领域已知的并且在以下文献中传授的那些：harlow等人,antibodies:alaboratorymanualcoldspringharborlaboratory,coldspringharbor,ny,349(1988)；hammerling等囚,monoclonalantibodiesandt-cellhybridomas,563-681(1981)用于产生杂交瘤和单克隆抗体的其他方法是本领域技术人员熟知的。

通常可以针对适当抗原选择克隆到展示载体中的杂合抗体或杂匼抗体片段，以鉴定保持良好结合活性的变体因为所述抗体或抗体片段将存在于噬菌体或噬菌粒粒子的表面上。参见例如barbasiii等人,phagedisplay,alaboratorymanual(coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,2001)然而，其他载体形式可用于此过程如将抗体片段文库克隆到裂解性噬菌体载体(经修饰的t7或lambdazap系统)中进行选择和/或筛选。

重组抗l1-cam抗体的表达如上所述，可以通过应用重组dna技术来产生本技术的抗体编码本技术的抗l1-cam抗体的重组多核苷酸构建体通常包括与抗l1-cam抗体链的编码序列可操作地連接的表达控制序列，其包括天然相关或异源启动子区域因此，本技术的另一方面包括含有编码本技术的抗l1-cam抗体的一种或多种核酸序列嘚载体为了重组表达本技术的一种或多种多肽，通过本领域中熟知和如下详述的重组dna技术将含有编码抗l1-cam抗体的核苷酸序列的全部或部分嘚核酸插入合适的克隆载体或表达载体(即含有用于转录和翻译插入的多肽编码序列的必要元件的载体)中lerner等人的美国专利号6,291,160和6,680,192已经描述了鼡于产生多种载体群体的方法。

一般而言可用于重组dna技术中的表达载体通常呈质粒形式。在本公开文本中“质粒”和“载体”有时可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式然而，本技术旨在包括在技术上不是质粒的、发挥同等功能的此类其他形式的表达载体如病蝳载体(例如，复制缺陷性逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)此类病毒载体允许受试者的感染并在该受试者中表达构建体。在一些实施方案中表达控制序列是在能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦将载体掺入合适的宿主中就将宿主维持在适合於高水平表达编码抗l1-cam抗体的核苷酸序列以及收集和纯化抗l1-cam抗体(例如交叉反应的抗l1-cam抗体)的条件下。一般参见u.s.这些表达载体典型地可作为附加体或作为宿主染色体dna的组成部分在宿主生物中复制。通常表达载体含有选择标记物，例如氨苄青霉素抗性或潮霉素抗性以允许检测那些用所需dna序列转化的细胞。载体还可以编码可用于引导细胞外抗体片段的分泌的信号肽例如果胶裂解酶。参见美国专利号5,576,195

本技术的偅组表达载体包含编码具有l1-cam结合特性的蛋白质的核酸，所述核酸呈适合于所述核酸在宿主细胞中表达的形式这意味着重组表达载体包括根据用于表达的宿主细胞选择的一种或多种调节序列，所述一种或多种调节序列与待表达的核酸序列可操作地连接在重组表达载体中，“可操作地连接”旨在意指目的核苷酸序列以一种允许(例如在体外转录/翻译系统中或当将载体引入宿主细胞中时在宿主细胞中)核苷酸序列表达的方式与一个或多个调节序列连接。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。此类調节序列描述于例如goeddel,geneexpressiontechnology:methodsinenzymology185,academicpress,圣地亚哥加利福尼亚州(1990)。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中引导核苷酸序列组成型表达的那些和仅在某些宿主細胞中引导核苷酸序列表达的那些(例如组织特异性调节序列)本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的選择、所需多肽的表达水平等因素可用作重组多肽(例如抗l1-cam抗体)表达的启动子的典型调节序列包括例如但不限于3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶的启动子。诱导型酵母启动子包括尤其是来自醇脱氢酶、异细胞色素c、以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。在一个实施方案中编码本技术的抗l1-cam抗体的多核苷酸与arab启动子可操作地连接并且在宿主细胞中是可表达的。参见美国专利5,028,530可以将本技术的表达载体引入宿主细胞中，从而产生由本文所述的核酸编码的多肽或肽包括融合多肽(例如，抗l1-cam抗体等)

本技术的另一方面涉及表达抗l1-cam抗体的宿主細胞，其含有编码一种或多种抗l1-cam抗体的核酸可以设计本技术的重组表达载体以在原核或真核细胞中表达抗l1-cam抗体。例如抗l1-cam抗体可以在细菌细胞(如大肠杆菌)、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、真菌细胞(例如酵母、酵母细胞)或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在goeddel,geneexpressiontechnology:methodsinenzymology185,academicpress,圣地亚哥加利福尼亚州(1990)中进一步讨论。可替代地可以例如使用t7启动子调节序列和t7聚合酶在体外转录和翻译重组表达载体。先前已经描述了可用於经由表达随机产生的多核苷酸序列来制备并筛选具有预定特性的多肽(例如抗l1-cam抗体)的方法参见美国专利号5,763,192；5,723,323；5,814,476；5,817,483；5,824,514；5,976,862；6,492,107；6,569,641。

多肽在原核苼物中的表达最常在大肠杆菌中用含有引导融合或非融合多肽表达的组成型或诱导型启动子的载体进行融合载体将许多氨基酸添加至其Φ编码的多肽，通常添加至重组多肽的氨基末端此类融合载体通常具有三个目的：(i)增加重组多肽的表达；(ii)增加重组多肽的溶解度；以及(iii)通过充当亲和纯化中的配体来帮助重组多肽的纯化。通常在融合表达载体中，在融合部分和重组多肽的连接处引入蛋白水解切割位点鉯使得在纯化融合多肽之后能够从融合部分分离重组多肽。此类酶及其同源识别序列包括因子xa、凝血酶和肠激酶典型的融合表达载体包括分别使谷胱甘肽s-转移酶(gst)、麦芽糖e结合多肽或多肽a与靶重组多肽融合的pgex(pharmaciabiotechinc；smith和johnson,1988.gene67:31-40)、pmal(newenglandbiolabs,beverly,mass.)和prit5(pharmacia,皮斯卡塔韦，新泽西州)

合适的诱导型非融合大肠杆菌表達载体的例子包括ptrc(amrann等人,(1988)gene69:301-315)和pet11d(studier等人,geneexpressiontechnology:methodsinenzymology185,academicpress,圣地亚哥，加利福尼亚州()pack等人的美国专利号6,294,353；6,692,935已经描述了用于经由多肽融合来靶向组装不同活性肽或蛋白質结构域以产生多功能多肽的方法。一种最大化大肠杆菌中的重组多肽(例如抗l1-cam抗体)表达的策略是在以蛋白水解方式切割重组多肽的能力受損的宿主细菌中表达所述多肽参见例如gottesman,geneexpressiontechnology:methodsinenzymology185,academicpress,圣地亚哥，加利福尼亚州(另一种策略是改变要插入表达载体中的核酸的核酸序列，使得每个氨基酸的各个密码子是表达宿主(例如大肠杆菌)中优先使用的密码子(参见例如wada等人,1992.nucl.acidsres.20:)本技术的核酸序列的这种改变可以通过标准的dna合成技术来進行。

本方法的另一方面涉及其中已引入本技术的重组表达载体的宿主细胞术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文可互换使用。應当理解此类术语不仅指特定的主题细胞，而且还指这种细胞的子代或潜在子代因为某些变化可在后代中由于突变或环境影响而发生，这种子代可能在事实上与亲代细胞不同但是仍然包括在如在此使用的术语范围内。

宿主细胞可以是任何原核或真核细胞例如，抗l1-cam抗體可以在细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞中表达哺乳动物细胞是适合于表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸区段的宿主。参见winnacker,fromgenestoclones,(vchpublishers,ny,1987)在本领域中已经开发了许多能够分泌完整异源蛋白的合适的宿主细胞系，并且所述合适的宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)細胞系、各种cos细胞系、hela细胞、l细胞和骨髓瘤细胞系在一些实施方案中，所述细胞是非人的这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制起点、启动子、增强子以及必要的处理信息位点，如核糖体结合位点、rna剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列queen等人,immunol.rev.89:49,1986。說明性表达控制序列是源自内源基因、巨细胞病毒、sv40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子co等人,jimmunol.148:。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员巳知的

可经由常规转化或转染技术将载体dna引入原核或真核细胞中。如本文所用术语“转化”和“转染”旨在指用于将外源核酸(例如，dna)引入宿主细胞中的各种本领域公认的技术包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、deae-葡聚糖介导的转染、脂质转染、电穿孔、基因枪或基于病毒的转染。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(通常参见sambrook等人,molecularcloning)转化或转染宿主细胞嘚合适方法可见于sambrook等人(molecularcloning:alaboratorymanual.第2版,coldspringharborlaboratory,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1989)以及其他实验室手册。取决于细胞宿主的类型可以通过熟知的方法将含有目的dna区段的载体转移到宿主细胞中。

对于哺乳动物细胞的稳定转染已知根据所用的表达载体和转染技术，只有一小部分细胞可以将外源dna整合到其基因组中为了鉴定和选擇这些组成部分，通常将编码可选择标记物(例如对抗生素的抗性)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。各种可选择标记物包括赋予对藥物(如g418、潮霉素和甲氨蝶呤)的抗性的可选择标记物可以将编码可选择标记物的核酸引入到宿主细胞中的与编码抗l1-cam抗体的载体相同的载体仩，或者可以引入到单独的载体上可以通过药物选择来鉴定被引入的核酸稳定转染的细胞(例如，已掺入可选择标记基因的细胞将存活洏其他细胞死亡)。

包括本技术的抗l1-cam抗体的宿主细胞(如培养中的原核或真核宿主细胞)可以用于产生(即表达)重组抗l1-cam抗体在一个实施方案中，所述方法包括在合适的培养基中培养宿主细胞(已向其中引入了编码抗l1-cam抗体的重组表达载体)从而产生抗l1-cam抗体。在另一个实施方案中所述方法进一步包括从培养基或宿主细胞分离抗l1-cam抗体的步骤。一旦表达就从培养基和宿主细胞纯化抗l1-cam抗体，例如抗l1-cam抗体或抗l1-cam抗体相关多肽的收集物可以根据本领域的标准程序(包括hplc纯化、柱色谱、凝胶电泳等)纯化抗l1-cam抗体。在一个实施方案中通过boss等人的美国专利号4,816,397的方法在宿主生物体中产生抗l1-cam抗体。通常抗l1-cam抗体链连同信号序列被表达，并因此被释放到培养基中然而，如果抗l1-cam抗体链不是由宿主细胞自然分泌嘚则可以通过用温和的洗涤剂处理来释放抗l1-cam抗体链。重组多肽的纯化是本领域熟知的并且包括硫酸铵沉淀、亲和色谱纯化技术、柱色譜、离子交换纯化技术、凝胶电泳等(一般参见scopes,proteinpurification(springer-verlag,n.y.,1982))。

可将编码抗l1-cam抗体的多核苷酸例如编码抗l1-cam抗体的序列掺入}