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&&请教做过基因染色体整合的大侠们
请教做过基因染色体整合的大侠们
我现在想做基因染色体整合，看文献中所整合的基因有不同形式的。有的是说所整合的基因带的是自有启动子，但我不明白基因的自有启动子是指什么，ATG开始就可以了还是说前面有一段课本上所说的-35序列什么的？还有的是基因前面加了Ptac或或者T7等启动子，那这些基因是怎么表达的呢，需要IPTG诱导什么的呢还是说不用诱导就可以自己表达了？
& && &总的就是我想知道我要整合基因是只将该基因ATG到TAA之间的序列整合上去还是说ATG前面应该有什么序列才能保证基因能够正常表达？分子生物学没学好，还望各位不吝赐教，谢谢大家了！
非常感谢您的指导！我还是有以下疑问：
1、我是往大肠杆菌染色体上添加基因，如果是用基因自带启动子，应该就是加上它前面的-10、-35特定序列，也就是大概50bp就可以了吧。但是这有个问题，因为我们是做工程菌，就是想过表达其中几个关键基因，我看过有的文章介绍用质粒载体做表达可能没有在染色体上整合来的稳定，那仅仅是给它单纯的在染色体上添加一个基因拷贝数效果会好吗？
2、你说的T7启动子是组成型启动子，但是pET载体质粒中的表达都要IPTG诱导的，这是怎么回事呢？如果我把要表达的基因ATG前面加上T7启动子序列然后放进染色体中，它会表达吗或者仍然需要IPTG诱导表达？因为我看到T7启动子需要T7 RNA 聚合酶的作用，用DE3化的菌株可以解决这个问题吗？
3、另外就是想请您帮我推荐几种可以直接在染色体上表达的强启动子。
问题比较多，再次感谢，
1.. -10和-35是狭义上的启动子，一般的启动子要包含更长的序列。如果你要克隆一个基因的启动子，不是50bp就能解决的。整合到染色体上的基因比在质粒上表达稳定，但是由于拷贝数的限制，同样的启动子表达量可能不如在质粒上高。有研究表明增加拷贝在染色体上可以提高表达效果。
2. T7启动子本身不是诱导型的。T7启动子只能被T7 RNA聚合酶识别，而这个酶在原始的大肠杆菌里是没有的，一些工程菌在染色体上整合了T7 RNA聚合酶基因，而这个基因是由lac operon调控的，因而T7启动子下游的基因可以被IPTG诱导。DE3是表达蛋白常用的工程菌株，可以识别T7启动子。
3. 做大肠杆菌表达的话，你提到过的T7和tac都是常用的强启动子。
非常感谢！还是有些不明白的地方想请教您：
1、我怎么找特定基因自身的启动子？
2、我算是又进一步的认识了T7启动子，我是不可以这样认为，我在加上T7启动子之后再给它加上T7 RNA聚合酶基因就可以成为组成型表达了？那么我如果使用DE3化的菌株应该就直接是组成型表达的吧？
3、Tac可以直接添加而组成型表达吗？
1. 有一些分析基因启动子的软件和online程序，把序列输进去就可以分析。原核生物启动子一般在ATG上游的数百bp之内，保守一些可以克隆1kb。
2. DE3是工程菌株，染色体上有溶原噬菌体整合的T7 RNA聚合酶了，而且是用lacI抑制的，所以pET系列的表达载体在DE3里是诱导表达的。
3. Ptac是一个杂交启动子，被lacI抑制，经IPTG诱导表达。Tac启动子是诱导表达的代表，可以通过诱导剂量来控制表达量，尽管完全抑制时可能有少许本底表达。
基因表达用诱导启动子的优势很明显。因为有些基因产物对宿主有害，在强启动子大量表达下会抑制菌体生长，甚至死亡。
非常感谢您的帮助！
您好，抱歉又打扰到您了！
我现在整合做成功了，菌株是自己DE3化的，然后将pET载体上的基因连同T7启动子和终止子（启动子后有lac）一起整合入DE3化的菌株，结果我要的目的产物产量有了提高，但是提高量不是很多，而且整合后的菌株不加IPTG诱导剂才会有所提高，而加了IPTG(1 mM)后的产量几乎与原菌株无差别。跑SDS-PAGE图两者都没有明显蛋白表达量增多。那么请问出现这种现象是为什么呢？按理说应该是添加IPTG后才会表达更多吧，那么如果 这样是不是可以认为我现在的提高是一种基底表达，而真正的表达条件我可能还没有摸索清楚，所以产量反倒因为IPTG的毒性而不会提高呢？
再次感谢！
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&&关于将基因整合到染色体上
关于将基因整合到染色体上
现在准备将过表达基因整合到染色体上（细菌），但是基因组上已经有一套这个基因了。如果整合上去后会不会造成其中一个丢失呀:arm:
有种插入失活的方法你知道吧，但是据说插入失活有插入片段丢失现象。我做整合，同样有同源序列，会不会也造成其中某个基因丢失呀，
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质粒载体是如何整合到动物受体细胞染色体DNA上的呢收藏
是什么机理？怎样的过程？我的疑问主要是：1、载体（质粒）是环状的，它要整合到受体细胞DNA上先要断开成直链，动物细胞里貌似没有什么限制酶能断开它。2、就算断开了，它又是怎样被连在受体细胞DNA上的呢？我知道真核细胞里也有DNA连接酶，可是他为什么会把不是自己的DNA连在自己DNA上？
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是依靠同源重组（重组酶介导的）整合上去的。以农杆菌转化植物细胞为例，农杆菌内部本身具有一个可编码重组酶的巨大质粒，侵染植物后，可将穿梭载体上的T-DNA区切下，依靠同源重组插入植物基因组。不要死套分子克隆操作中的酶切-连接操作。
那么整合到动物细胞染色体DNA上也是因为重组酶吗？有人说这种质粒整合是靠运气的，机率很低，病毒载体的整合率要高。但质粒载体会在细胞质中大量复制，细胞分裂时也可以一定程度上保证传给子代细胞，不知道对不对？
还有，基因枪法是怎样达到整合的呢？光金属颗粒打入就可以？
嗯，是的。细胞内本身也有重组酶的存在。转化率大约1%左右。质粒载体在宿主内不复制的。靠的就是插入宿主基因组内后随着基因组复制而复制。
看我ls第一句。
质粒载体上不是有复制原点吗?（高中生物书上写的）
质粒载体的复制起始位点只能被原核生物和少数真核生物（主要是酵母）识别。真核宿主（如植物细胞、动物细胞）不能识别质粒载体的复制起始位点。
哦，懂了，实在太感谢了！
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不好意思，突然想问为什么真核宿主不能识别复制起点呢？
我查了一下，为了能让真核宿主识别，要加上病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列，那么这样就能虽不整合DNA但一定程度上可以传给子代了吗？穿梭载体(shuttle vector)
又称双功能载体，能在两种不同的生物体内复制的载体。 同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列(ARS)，它既能在原核细胞中扩增又能在 真核细胞中复制和表达。 主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体 和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞 中表达，并可提高外源基因的表达效率。
11L的问题改成：为什么原核质粒上的复制起点不能被真核细胞识别？那真核质粒上的复制起点不能被原核细胞识别吗？
刚才看到这个帖子，对于质粒载体是如何整合到动物受体细胞染色体DNA有了大致了解。但是我想问如果用脂质体转染的办法整合质粒载体是怎么的过程？环形质粒载体是进入细胞后是怎么断开的，难道普通真核的载体也可编码重组酶，自己切断吗，还是在包进脂质体之前人为把它切开？还有您说质粒载体整合到基因组是依靠同源重组（重组酶介导的），那么我能否根据这个同源性大致推测我的质粒整合到基因组哪个位置？这个同源重组是否把整个质粒载体全部整合上去，还是只把目的基因整合上去而载体部分没有整合上去？质粒载体整合到基因组DNA上后，还是以一个完整的线性片段存在吗，还是会被断开，分成几个片段？
复制起始相关蛋白要识别一定的DNA序列才行。具有特异性。
转染对于所用质粒和细胞株是有一定要求的。质粒是有特殊区域可进行重组的。真核细胞内一般都有重组酶存在。同源区比较短，在整个基因组上可以看做随机插入。重组的只是一个片段，不是整个质粒。质粒载体整合到基因组DNA上后还是一个完整的线性片段。
真核原核生物的DNA启动子序列完全不同，而且两类生物的DNA聚合酶及配套的各种酶联复合物也完全不同。所以，真核生物是无法识别原核生物复制七点的。
谢谢！我还有几个问题请较：1、pCI-neo载体是否具有与细胞重组的特殊区域？2、您说重组的只是一个片段，不是整个质粒，是说质粒中会有部分丢失，还是环形质粒被切成片段后全部重组上去？3、同源区一般多短，才会随机插入？
谢谢您的指点!我还想请教几个问题：1、如果是pCI-neo质粒载体，与动物细胞基因组重组也是Cre-LoxP系统的原理？那是不是说这个载体中具有LoxP（locus of X-over P1）序列？2、您之前说先把质粒切成线性的，是用特定的酶切位点吗？一般是什么位点？
pCI-neo是动物表达载体，您说的直接在动物细胞里面复制，转录，不需要经过重组是什么意思，是没有整合到染色体上吗？质粒整合到基因组上时，质粒中会有部分丢失吗，还是环形质粒被切成线性后全部重组上去？
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【求助】重组质粒转化时，是否会整合到染色体上？
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这个帖子发布于10年零40天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我在做连接转化时，抗生素筛选到的菌落做菌落PCR显示含有目的片段，但提取质粒跑电泳却显示什么都没有。请问，有没有可能整合到宿主的染色体上？谢谢！
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不可能整和上吧?
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我接着采用电泳并没有任何条带的质粒提取物为模板（2ul），进行PCR，尽然得到了相应的片段，很是奇怪。
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是啊，很奇怪，我也遇到这样的情况了是何原因阿？
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