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体外不同培养时间影响cd3-cd56 nk细胞数量及活性变化的研究
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【原创】关于mfc的培养
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这个帖子发布于4年零298天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
前段时间开始养mfc，在网上找了很久没找到相关详细的资料。自己摸索mfc有一个月了，斗胆拿出来跟大家分享分享。有什么不对的话，请大家不吝赐教。
第一次养细胞可谓是一波三折。在养细胞前，实验室出现一点意外，液氮罐里的冻存细胞被拿到室温下放置，幸好研二一个师姐及时通知我，让我去认领。3月17号开始复苏这批细胞，万幸，它还能长。刚开始的时候用的是DMEM，培养了十天后只能长大但没有长出mfc的拉网性状。后来发现犯了一个低级错误，不是用DMEM,而是用1640，换完液第三天细胞开始长出触角。
这是我的培养液：RPIM-1640（赛默飞世尔）80%，血清（gibico）20%。
细胞长触角前形态（*40）分裂的细胞（*40）生长的细胞（*10）中间的细胞（*10）从复苏到能传代我花了7天时间。mfc长得速度很慢，有没有人也再养，咱们可以交流讨论一下。在我目前传的细胞中，发现个一个现象。就是无论传代的时候打的多匀，细胞长得趋势都是中间长得最快而且最密。不知道大家的是不是这样情况。
不知道邀请谁？试试他们
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我买的上海拜力的，1640 10%fbs就行，长的特别快，两天就要消化了，跟贴壁细胞一样，没有特别注意点，很好养！种细胞时无论传代的时候打的多匀，细胞长得趋势都是边缘长得最快而且最密----边缘效应，任何细胞都一样，用10cm dish时最明显。
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我是leilei 我买的上海拜力的，1640 10%fbs就行，长的特别快，两天就要消化了，跟贴壁细胞一样，没有特别注意点，很好养！种细胞时无论传代的时候打的多匀，细胞长得趋势都是边缘长得最快而且最密----边缘效应，任何细胞都一样，用10cm dish时最明显。 你好，我是leilei 战友，
今天我复苏了MFC细胞，12h后很少细胞贴壁，细胞成团很多，我觉得没啥希望要复活了。请问你在哪个地区，能否馈赠给鄙人一些？因为做实验急着毕业~
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我是leilei 我买的上海拜力的，1640 10%fbs就行，长的特别快，两天就要消化了，跟贴壁细胞一样，没有特别注意点，很好养！种细胞时无论传代的时候打的多匀，细胞长得趋势都是边缘长得最快而且最密----边缘效应，任何细胞都一样，用10cm dish时最明显。 你好，我也在养mcf7细胞，我想喝您请教一些经验！这个细胞我是从一个师兄那拿到的，复苏后镜检还很多而且很圆，但是第二天贴壁的很少，大多都悬浮了，换液之后就更少了，养个3-4天背景就特别脏了，但是培养液还是澄清的没有浑浊，您能帮我分析一下是什么原因吗！不胜感激！！！
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yj1984ren 编辑于
关于丁香园三种细胞用于建立体外肥大细胞脱颗粒模型的比较研究-工作总结范文网
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三种细胞用于建立体外肥大细胞脱颗粒模型的比较研究
南方医科大学２００９级硕士学位论文三种细胞用于建立体外肥大细胞脱颗粒模型的比较研究ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＴｈｒｅｅＫｉｎｄｓｏｆＣｅｌｌＬｉｎｅｓｆｏｒＥｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇｉｎｖｉｔｒｏＭｏｄｅｌｏｆＭａｓｔＣｅｌｌＤｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ课题来源：广东省产学研资助项目（２０１０Ａ０９０２０００７６）专业名称中药学学位申请人高婕指导教师罗佳波教授答辩委员会主席于荣敏教授答辩委员会成员崔景朝教授张忠义教授富宁教授谭晓梅研究员论文评阅人雷林生教授向军俭教授２０１２年５月２９日广州硕士学位论文三种细胞用于建立体外肥大细胞脱颗粒模型的比较研究研究生：高婕指导教师：罗佳波教授摘要中药注射剂是我国特有的中药剂型，是中药应对急症重症的重要手段，它是以中医药理论为指导，采用现代科学技术和方法，将从中药或天然药物的单方或复方中提取的有效物质制成无菌溶液、混悬液或临用前配成溶液的灭菌粉末供注入体内的制剂。中药注射剂是传统中医药在现代发展的经典之作，它一改中药传统的给药方式，不经过胃肠道，直接进入血液，起效迅速，尤其适于急症重症。这种给药方式剂量准确并且不受消化系统及食物影响，临床上常用于神昏、抽搐、痉挛，或患消化系统障碍的患者，有着确切的临床疗效。近些年来，随着中药注射剂应用的不断扩大，临床不良反应的相关报道数量也呈上升趋势，其主要不良反应包括皮肤及粘膜损害、呼吸系统损害、心血管系统损害及药物热等。同时一种症状类似于过敏反应的不良反应也时有发生，它与经典的过敏反应不同之处在于，经典途径的过敏反应过敏原首次进入机体后，致敏机体产生特异性的ＩｇＥ，当过敏原再次刺激机体时，被特异性地识别，并与抗体发生反应，导致机体肥大细胞、嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放大量生物活性物质，继而引发一系列免疫效应；而类过敏反应的发生，不需预先接触抗原物质，也无特异性ＩｇＥ参与，因其临床症状与过敏反应相似而得名，但准确机制尚不明确。摘要然而，针对注射剂的过敏反应，《中国药典》（２０１０版）仅收录豚鼠主动全身过敏试验（ＡＳＡ）和被动皮肤过敏试验（ＰＣＡ）两项。豚鼠易于致敏，曾是理想的过敏试验对象，常规的过敏试验也多采用豚鼠作为模型。但由于豚鼠个体较小时行为改变不够典型和明确，加之行为学观察本身也存在较多主观因素，使得豚鼠试验容易出现假阳性或假阴性的结果。另外豚鼠的全身主动过敏试验和被动皮肤过敏试验主要针对依赖ＩｇＥ介导的经典途径过敏反应，检测效果确切，但中药注射剂常引发类过敏反应，豚鼠试验的检测效果并不理想，常出现漏筛的现象，这也是导致中药注射剂过敏反应频发的原因之一。因此，寻找针对中药注射剂所引发类过敏反应的筛查模型是控制中药注射剂用药安全的重要举措。目的：１在常用的肥大细胞及嗜碱性粒细胞系中筛选出一种最适合作为中药注射剂引发类过敏反应体外筛查模型的细胞系。２利用临床常用的几种中药注射剂，评价所筛选出的细胞系与临床的符合率。方法：１．测定细胞生长曲线：取对数生长的三种细胞，按不同浓度接种于９６孔板中，分别用ＭＴＴ法与ＣＣＫ．８法测定培养Ｏｄ，ｌｄ，２ｄ，３ｄ，４ｄ，５ｄ的细胞活力，每个时问点，每种细胞，每个浓度６个复孔。其中ＭＴＴ组每孔加入１０１ａＬ浓度为５ｍｇ／ｍＬ的ＭＴＴ溶液，孵育４ｈ后吸弃培养液，加入ＤＭＳＯ溶液震荡溶解，酶标仪５７０ｎｍ处测定各孔的吸光度；ＣＣＫ．８组每－孑Ｌｇｉ入１０ｒｔＬＣＣＫ．８溶液，培养１ｈ后，酶标仪４５０ｎｍ硕士学位论文测定各孔的。测得吸光度利用ＳＰＳＳｌ３．０计算均数及方差，分别对不同浓度的不同种类细胞利用Ｏｆｆｉｃｅ曲线。Ｅｘｃｅｌ２０１０对所求得的吸光度均数和培养时间绘制生长２．筛选用于建立体外肥大细胞脱颗粒模型的细胞系２．１组胺释放量测定分别取对数生长期的三种细胞，接种于２４孔板中，生长４８ｈ后，弃去培养基，加入Ｔｙｒｏｄｅ液培养条件下平衡１０分钟。实验组加入５０ｔ．ｔＬＣ４８／８０，并设置空白对照组加入等体积Ｔｙｒｏｄｅ液。分别反应０ｍｉｎ，１５ｍｉｎ，３０ｍｉｎ，４５ｍｉｎ和６０ｍｉｎ后终止反应。于０＿４。Ｃ以２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液备用。Ｋｕ８１２直接以平板离心机相同转速离心取上清液备用。２．２高效液相色谱．质谱（ＬＣ．ＭＳ）法测定组胺含量Ｃ１８固相萃取小柱活化后上样，以０．２％氨水３ｍＬ冲洗，再加入３ｍＬ甲醇，收集甲醇液，室温下氮气吹干，加入Ｏ．５ｍＬ甲醇充分溶解后，过０．２２１ａｍ滤膜备用。色谱条件：流动相为乙腈：加入Ｏ．３％甲酸的０．５ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸铵水溶液（６０：４０）；色谱柱：Ａｌｌｔｉｍａ柱温：３５℃。用ＯｆｆｉｃｅＰｈｅｎｙｌＥｘｃｅｌＣ１８柱（２５０ｍｍｘ４．６ｍｍ，５１．ｔｍ）；流速：Ｏ．８ｍＬ／ｍｉｎ；２０１０软件，以不同组胺标准品峰面积积分对浓度进行线性回归计算，得出标准曲线方程后计算各样品组胺含量。２．３氨基糖苷酶净释放度测定分别取对数生长期的三种细胞，接种于９６孔酶标板中，加入５０９Ｌ底物，生长４８ｈ后实验组每孔加入５０１．ｔＬＣ４８／８０；氨基糖苷酶总含量对照组加入５０９Ｌ０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ．１００细胞裂解液，将全部膜裂解，释放所有的氨基糖苷酶，作为氨基糖苷酶总含量对照组；空白组加入等量Ｔｙｒｏｄｅ液。分别反应０ｍｉｎ，１５ｍｉｎ，３０ｍｉｎ，４５ｍｉｎ，６０ｍｉｎ后加入１５０９Ｌ终止液终止反应，酶标仪测定４０５ｎｌＴｌ处各孔反应液的吸光度，结果扣除空白对照后，以实验组即Ｃ４８／８０刺激组吸光度与摘要氨基糖苷酶总含量对照组裂解全部膜后的吸光对之比，衡量实验组Ｃ４８／８０刺激后氨基糖苷酶的释放度。２．４脱颗粒百分率分别取对数生长期的三种细胞，接种于２４孔板中。生长４８ｈ后，弃去培养基加入Ｔｙｒｏｄｅ液，平衡１０分钟。实验组加入５０９ＬＣ４８／８０刺激，并设置空白对照组加入等量Ｔｙｒｏｄｅ液。分别于０ｍｉｎ，１５ｍｉｎ，３０ｍｉｎ，４５ｍｉｎ和６０ｍｉｎ终止反应并以中性红染色。随机计数１００个细胞中脱颗粒细胞的个数，计算出脱颗粒百分率。以上结果以ＳＰＳＳｌ３．０统计软件析因设计方差分析。其中组胺测定时的峰面积积分对浓度进行的线性回归计算，使用ＯｆｆｉｃｅＥｘｃｅｌ２０１０。３．几种常见中药注射剂对Ｐ８１５细胞脱颗粒的影响３．１检测几种常用中药注射液对Ｐ８１５细胞的Ｉｃ５０浓度中药注射剂样品以制剂原液为母液，稀释为一定浓度梯度，共设置连同母液在内的６个浓度，实验依次设空白对照组，６个浓度的注射剂组，每组设６个复孔。取对数期生长的Ｐ８１５细胞接种于９６孔板中，培养１２ｈ后，空白对照组加入５０９Ｌ培养液，注射剂组加入５０９Ｌ不同浓度中药注射剂，继续培养３６ｈ，每孔加入室温平衡过的ＭＴＴ溶液，相同条件下孵育４ｈ，吸弃培养液，另加入ＤＭＳＯ震荡溶解，测定各孔的吸光度，以ＳＰＳＳｌ３．０计算各注射剂品种各浓度吸光度均数，依照改良寇式法计算ＩＣ５０。每种注射剂平行测定三次利用ＳＰＳＳｌ３．０取平均值。３．２几种常见中药注射剂对Ｐ８１５细胞脱颗粒的影响以筛选建立体外肥大细胞脱颗粒模型的相同方法检测各种中药注射剂在其ＩＣ５０浓度下对Ｐ８１５细胞刺激６０ｍｉｎ后的组胺释放量，氨基糖苷酶净释放度和细胞脱颗粒率三项指标。实验过程中设置以Ｃ４８／８０刺激的阳性对照组和以Ｔｙｒｏｄｅ刺激的阴性对照组。结果以ＳＰＳＳｌ３．０统计软件ＯｎｅＷａｙＡｎｏｖａ方法分析。硕士学位论文结果：１．测定细胞生长曲线：ＭＴＴ法和ＣＣＫ．８所测定的同种细胞的生长曲线趋势基本相同，测定结果得出ＲＢＬ．２Ｈ３细胞在０．８×１０５个／ｍＬ．１．Ｏ×１０５个／ｍＬ范围内，Ｐ８１５细胞在Ｏ．５×１０５个／ｍＬ．０．８×１０５个／ｍＬ范围内，Ｋｕ８１２细胞在０．８×１０５个／ｍＬ．１．Ｏ×１０５个／ｍＬ范围内生长曲线有明显的指数生长期和平台期，没有明显的潜伏期，并且４８ｈ左右能够进入或接近平台期。细胞在该浓度下，适宜进行Ｃ４８／８０刺激后０－６０ｍｉｎ，三细胞系过敏活性物质释放均有明显增加，以析因设计方差分析的方法统计后，根据交互效应轮廓图可见，在相同刺激条件下，Ｐ８１５的组胺释放量，细胞脱颗粒率和氨基糖苷酶净释放度三项指标的突增均明显较其他两种细胞系发生时问早，突增效果明显。Ｋｕ８１２为悬浮细胞，细胞脱颗粒状况不宜观察，其结果只作为Ｋｕ８１２在各刺激时间点之间的比较，与同刺激时间点的其他两种细胞无可比性，这也可说明Ｋｕ８１２在细胞脱颗粒项目下，不利于实验观察。关于作用时间，根据临床报道，类过敏反应常发生在注射给药后６０ｍｉｎ内发生，将Ｐ８１５细胞的各项指标相邻两个时间点两两比较，根据交互效应轮廓图，选择６０ｍｉｎ为刺激时间。３．几种常见中药注射剂对Ｐ８１５细胞脱颗粒的影响在被检测的十二种注射剂中，血栓通注射液、清开灵注射液、双黄连粉针剂及水针剂、香丹注射液、肿节风注射液、胆木注射液、丹参注射液、苦参碱注射液在三项指标的检测中与阴性对照组相比均有明显的统计学差异，即Ｐ＜０．０５，提示上述注射剂品种对Ｐ８１５细胞有较强的致敏性；相对而言，柴胡注射液、银杏提取物注射液、生脉注射液三项检测指标与阴性对照组差异不显著，提示上述三种注射剂对Ｐ８１５细胞的致敏性相对较弱。Ｖ摘要结论：以在Ｐ８１５、ＲＢＬ一２Ｈ３、Ｋｕ８１２三种肥大细胞和嗜碱性粒细胞的细胞系中，以Ｐ８１５细胞系最适宜作为中药注射剂引发类过敏反应体外筛查模型。Ｐ８１５细胞在Ｃ４８／８０刺激下，表现出显著的脱颗粒反应，且反应结果易被量化检测，重复性较好。在几种常见中药注射剂刺激下，以本实验设计的检测方法测定，引起细胞脱颗粒程度与国家食品药品监督管理局的官方公示和《药物不良反应通报》中所述的中药注射剂不良反应发生情况吻合度较高。Ｐ８１５细胞在临床报道致敏性较高的中药注射剂刺激下，所测得指标结果与阴性对照差异明显；同时在临床报道致敏性不明显的中药注射剂刺激下，所测得指标结果与阳性对照差异明显。提示Ｐ８１５可能是一种新的检测效果确切的针对中药注射剂类过敏反应的快速稳定的体外过敏物质筛选模型。关键词：中药注射剂类过敏反应体外模型Ｋｕ８１２Ｐ８１５ＲＢＬ．２Ｈ３硕士学位论文ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＴｈｒｅｅＫｉｎｄｓｏｆＣｅｌｌＬｉｎｅｓｆｏｒＥｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇｉｎｖｉｔｒｏＭｏｄｅｌｏｆＭａｓｔＣｅｌｌＤｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎＮａｍｅ：ＧａｏＪｉｅＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：ＬｕｏＪｉａｂｏＡＢＳＴＲＡＣＴＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅａｎＩｎｊｅｃｔｉｏｎｉｓａｕｎｉｑｕｅｆｏｒｍｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ｏｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｅｔｈｏｄｔｏＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｈａｎｄｌｅａｎｄｃｒｉｔｉｃａｌｓｙｍｐｔｏｍｓ．Ｉｔ’Ｓｂａｓｅｄｔｈｅｏｒｙ，ｕｓｅｄｔｈｅＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅｍｏｄｅｍａｎｄｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，ｔｏａｂｓｔｒａｃｔｅｆｆｅｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｆｒｏｍＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｎｄｔｈｅｎｍａｄｅｔｈｅｍｉｎｔｏｓｔｅｒｉｌｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｒａｎｄｎａｔｕｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ．ＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅＩｎｊｅｃｔｉｏｎｉｓａｎｅｘｔｒａｏｒｄｉｎａｒｙａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｆｏｒｔｈｅｍｏｄｅｍｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ．Ｉｔｄｉｒｅｃｔｌｙｇｏｅｓｉｎｔｏｂｌｏｏｄｉｎｓｔｅａｄｏｆｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｒａｃｔ，ｔｈｅｎａｔｕｒｅｏｆｑｕｉｃｋａｃｔｉｎｇｉｓｖｅｒｙｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｃｒｉｔｉｃａｌｓｙｍｐｔｏｍｓ．Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｉｓｎｏｔａｆｆｅｃｔｅｄｂｙｄｉｇｅｓｔｉｖｅｓｙｓｔｅｍａｎｄｆｏｏｄ，ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙｏｆｔｅｎｕｓｅｄｆｏｒｐａｔｉｅｎｔｗｈｏｓｕｆｆｅｒｓｆｒｏｍｐｒｏｂｌｅｍ．ＴｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅｉｓｓｐｒｅａｄｗｉｄｅｌｙ；ｔｈｅｒｅｐｏｒｔｏｆｂａｄｒｅａｃｔｉｏｎｉｓａｌｓｏｉｎｃｏｍａ，ｔｗｉｔｃｈｉｎｇ，ｃｒａｍｐｏｒｄｉｇｅｓｔｉｖｅｓｙｓｔｅｍａｎｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｔｒｅｎｄ，ｍｏｓｔｏｆｗｈｉｃｈａｒｅｓｋｉｎ，ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｓｔｅｍｏｂｓｅｒｖｅｄ，ａａｎｄｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｓｙｓｔｅｍｄａｍａｇｅ．ＡｎａｎａｐｈｙｌａｃｔｏｉｄｒｅａｃｔｉｏｎｉｓａｌｓｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｒｏｍｔｈｅｃｌａｓｓｉｃａｎａｐｈｙｌａｃｔｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｗｈｉｃｈｗｉｌｌｒｅｐｒｏｄｕｃｅｓｐｅｃｉａｌＡＢＳＴＲＡＣＴａｎｔｉｂｏｄｙＩｇＥａｆｔｅｒｔｈｅａｎａｐｈｙｌａｃｔｏｇｅｎｆｉｒｓｔｅｎｔｅｒｅｄｔｈｅｂｏｄｙ．Ｗｈｅｎｔｈｅａｎａｐｈｙｌａｃｔｏｇｅｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｔｈｅｂｏｄｙａｆｔｅｒｗａｒｄ，ｉｔｗｉｌｌｂｅｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄａｎｄｈａｎｄｌｅｄｂｙｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙ，ｗｈｉｃｈｌｅａｄｓｔｈｅａｓｔｒｏｃｙｔｅａｎｄｂａｓｏｐｈｉｌｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎｔｏｒｅｌｅａｓｅｍａｓｓｉｖｅｂｉｏａｃｔｉｖｅｓｕｂｓｔａｎｃｅｔｏａｃｔｉｖｅｔｈｅｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｅｆｆｅｃｔ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｗｏｏｆｔｈｅ“ＣｈｉｎｅｓｅｐｉｇｓｆｏｒＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ”（２０１０）ｉｎｃｌｕｄｅｄｏｎｌｙｔｈｅｇｕｉｎｅａｉｎｊｅｃｔｉｏｎａｌｌｅｒｇｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｓ，ａｃｔｉｖｅｓｙｓｔｅｍｉｃａｎａｐｈｙｌａｘｉｓｔｅｓｔ（ＡＳＡ）ａｎｄｐａｓｓｉｖｅｃｕｔａｎｅｏｕｓｉｄｅａｌａｌｌｅｒｇｙｔｅｓｔａｎａｐｈｙｌａｘｉｓｔｅｓｔ（ＰＣＡ）．Ｇｕｉｎｅａａｌｌｅｒｇｙｔｅｓｔｓｐｉｇｓｅａｓｙｔｏａｌｌｅｒｇｅｎｓ，ｗａｓｔｈｅｏｆｔｈｅｇｕｉｎｅａｐｉｇ．Ｂｕｔ，ｄｕｅｔｏｏｂｊｅｃｔ，ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｕｓｅｔｈｅｓｍａｌｌｅｒｇｕｉｎｅａｐｉｇｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ，ａｎｄｓｏｍｅｔｉｍｅｓｂｅｈａｖｉｏｒｃｈａｎｇｅｉｓｎｏｔｔｙｐｉｃａｌａｎｄｏｂｖｉｏｕｓ，ｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈｔｈｅｂｅｈａｖｉｏｒｏｂｓｅｒｖｅｄｔｈｅｒｅｐｉｇｓｐｒｏｎｅｔｏｆａｌｓｅｐｏｓｉｔｉｖｅａｌｌｅｒｇｙｔｅｓｔｏｒａｒｅｍｏｒｅｓｕｂｊｅｃｔｉｖｅｆａｃｔｏｒｓ，ｇｕｉｎｅａｆａｌｓｅｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｓ．Ｏｔｈｅｒｇｕｉｎｅａｐｉｇ’ＳｂｏｄｙａｃｔｉｖｅａｎａｐｈｙｌａｘｉｓｔｅｓｔａｎｄｐａｓｓｉｖｅｃｕｔａｎｅｏｕｓｆｏｒｔｈｅｃｌａｓｓｉｃａｌｐａｔｈｗａｙｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｎＩｇＥ―ｍｅｄｉａｔｅｄａｌｌｅｒｇｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｓ，ａｍｏｒｅｐｒｅｃｉｓｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｒａｏｆｃｈｅｍｉｃａｌｄｒｕｇｓｓｉｎｇｌｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｃａｕｓｅｄｂｙｃｌａｓｓｉｃａｌｌｅｒｇｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｓ，ｂｕｔｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆｔｅｎＯｃｃｕｒｓ：ＮｏＩｇＥ?ｍｅｄｉａｔｅｄｆｉｒｓｔｃｏｎｔａｃｔｗｉｔｈｔｈｅａｄｖｅｒｓｅｒｅａｃｔｉｏｎｓｗｈｉｃｈｐｒｏｄｕｃｅｓｉｍｉｌａｒｃｌｉｎｉｃａｌｓｙｍｐｔｏｍｓｏｆｔｈｅｃｌａｓｓｉｃａｌｌｅｒｇｉｃｒｅａｃｔｉｏｎ，ｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｓｎｏｔｙｅｔｆｕｌｌｙｃｌｅａｒ，ｉｓｃａｌｌｅｄｔｈｅｃｌａｓｓｏｆａｌｌｅｒｇｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ａｇａｉｎｓｔａｌｌｅｒｇｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｓｉｎｔｈｉｓｃｌａｓｓｇｕｉｎｅａｐｉｇｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｔｅｓｔｉｎｇｔｈｅｅｆｆｅｃｔｉｓｎｏｔｓａｔｉｓｆａｃｔｏｒｙ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｏｆｉｎｄａｓｃｒｅｅｎｉｎｇｍｏｄｅｌｆｏｒｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｔｒｉｇｇｅｒａｌｌｅｒｇｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｓｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｅａｓｕｒｅｔｏｃｏｎｔｒｏｌｔｈｅａｄｖｅｒｓｅｒｅａｃｔｉｏｎｏｆａｒｔｉｃｌｅｆｒｏｍｔｈｅｉｎｖｉｔｒｏｃｅｌｌｍｏｄｅｌｂｅｇｉｎｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｔｈｉｓｔｏｆｉｌｔｅｒｏｕｔｔｈｅｍｏｓｔａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｔａｒｇｅｔｅｄｃｌａｓｓｏｆａｌｌｅｒｇｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｓｉｎｖｉｔｒｏｓｃｒｅｅｎｉｎｇｍｏｄｅｌ，ｌａｙｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｔｏｆｉｎｄａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｓｕｂｓｔａｎｃｅｓｔｒｉｇｇｅｒａｌｌｅｒｇｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｓｉｎｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．硕士学位论文ＡＩＭ：１．Ｆｒｏｍｍａｓｔｃｅｌｌｓａｎｄｂａｓｏｐｈｉｌｉｃｃｅｌｌ，ｃｈｏｏｓｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｍｏｄｅｌ．２．ＵｓｅｓｅｖｅｒａｌｃｌｉｎｉｃｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｃｈｏｓｅｎｃｅｌｌｌｉｎｅｓｍａｔｃｈｅｓｔｈｅｃｌｉｎｉｃｔｒｉａｌ．ｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｓｕｉｔａｂｌｅｃｅｌｌｌｉｎｅｓａｓａｉｎｊｅｃｔｉｏｎｔｏｔｒｉｇｇｅｒａｌｌｅｒｇｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｓｉｎｖｉｔｒｏｓｃｒｅｅｎｉｎｇｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｔｏｅｖａｌｕａｔｅｗｈｅｔｈｅｒｔｈｅＭＥＴＨｏＤＳ：１．Ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ：Ｔｈｅｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃｐｈａｓｅｏｆｇｒｏｗｔｈｏｆｔｈｒｅｅｋｉｎｄｓｏｆｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｅｅｄｅｄｉｎ９６－ｗｅｌｌｐｌａｔｅｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅＭＴＴａｓｓａｙａｎｄＣＣＫ－８ａｓｓａｙｃｕｌｔｕｒｅ０ｄ，ｌｄ，２ｄ，３ｄ，４ｄ，５ｄ，ｔｈｅｃｅｌｌｓｖｉｔａｌｉｔｙ，ａｔｅａｃｈｔｉｍｅｐｏｉｎｔ，ｅａｃｈｃｅｌｌ，ｅａｃｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｓｉｘｗｅｌｌｓ．ＷｈｉｃｈｔｈｅＭＴＴｇｒｏｕｐｅａｃｈｈｏｌｅｂｙａｄｄｉｎｇ１０９Ｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｃｕｂａｔｅｄｆｏｒ４ｈｃａｒｅｆｕｌＡｓｐｉｒａｔｅｍｅｄｉｕｍ５ｍｇ／ｍＬＭＴＴｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｄｉｓｓｏｌｖｅｄＤＭＳＯｓｏｌｕｔｉｏｎｓｈｏｃｋｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ５７０ｎｍａｔｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｂｓｏｒｂａｎｃｅｏｆｅａｃｈｗｅｌｌ（ＯＤｖａｌｕｅ）；ｏｆＣＣＫ－８ｇｒｏｕｐｉｎｅａｃｈｈｏｌｅｂｙａｄｄｉｎｇＣＣＫ一８ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ａｆｔｅｒｌｈｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ，ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ，４５０ｎｍ，ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｕｓｅｏｆｔｈｅＯＤｖａｌｕｅｓｏｆｅａｃｈｈｏｌｅｓｉｘｃｅｌｌｓｐｅｒｄａｙ．ＴｈｅＯＤｖａｌｕｅｏｆｔｈｅｃａｌｃｕｌａｔｅｔｈｅｏｆｔｈｅＳＰＳＳ１３．０Ｅｘｃｅｌ２０１０ｍｅａｎ，ｍｅａｎＯＤｖａｌｕｅｓｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅＷｉｎｄｏｗｓＯｆｆｉｃｅｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅ．２．Ｃｈｏｏｓｅｔｈｅｃｅｌｌｌｉｎｅｓｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｉｎｖｉｔｒｏｍａｓｔｃｅｌｌｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎｍｏｄｅｌ２．１ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｈｉｓｔａｍｉｎｅｒｅｌｅａｓｅＴａｋｅｔｈｅ４８ｈａｄｈｅｒｅｎｔｖｉｔｒｏｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃｐｈａｓｅｇｒｏｗｔｈ，ｄｉｓｃａｒｄｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｔｙｐｅｓｏｆｃｅｌｌｓｓｅｅｄｅｄｉｎ２４－ｗｅｌｌｐｌａｔｅｓ，ｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ，ａｄｄｉｎｇＴｙｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｍａｓｔｃｅｌｌｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎｍｏｄｅｌｏｄｅｆｌｕｉｄｂａｌａｎｃｅｏｆ１０ｍｉｎｕｔｅｓ．Ｃ４８／８０ＡＢＳＴＲＡＣＴｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｇｒｏｕｐｊｏｉｎｔｈｅ５０ｐＬＣ４８／８０，ａｎｄｓｅｔｔｈｅｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｂｙａｄｄｉｎｇ５０９ＬｏｆＴｙｒｏｄｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ａｔ０ｍｉｎ，１５ｍｉｎ，３０ｍｉｎ，４５ｍｉｎａｎｄ６０ｍｉｎｔｏｓｔｏｐｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎ．２０００ｒ／ｍｉｎｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ１０ｍｉｎａｔ０－４。Ｃ，ｔｈｅｓｕｐｅｍａｔａｎｔｓｐａｒｅ．ＴｈｅＫｕ８１２ｄｉｒｅｃｔｌｙｉｎｔｈｅｔａｂｌｅｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｓａｍｅｓｐｅｅｄｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｓｕｐｅｍａｔａｎｔｓｐａｒｅ．２．２Ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ―ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＬＣ－ＭＳ）ｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｈｉｓｔａｍｉｎｅｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎＳａｍｐｌｅｓａｆｔｅｒｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣ１８ｓｏｌｉｄｐｈａｓｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｌｕｍｎ，ａｎｄｔｈｅｎｔｏＯ．２％ａｍｍｏｎｉａ３ｍＬｗａｔｅｒ，ａｄｄ３ｍｌｍｅｔｈａｎｏｌｔｏｃｏｌｌｅｃｔｔｈｅｍｅｔｈａｎ０１ｓｏｌｕｔｉｏｎ．ｏｖｅｒａｅｖａｐｏｒａｔｅｄｔｏｄｒｙｎｅｓｓａｔｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｔａｋｅＯ．５ｍＬｍｅｔｈａｎｏｌｆｕｌｌｙｄｉｓｓｏｌｖｅ０．２２ｐｍｍｅｍｂｒａｎｅｓｐａｒｅ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：ｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅ：ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ：０．３％ｆｏｒｍｉｃａｃｉｄ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ，ａｍｍｏｎｉｕｍａｃｅｔａｔｅ（６０：４０）；ｆｌｏｗｒａｔｅ：Ｏ．８ｍＬ／ｍｉｎ；ｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：３５℃．Ｌｉｎｅａｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓｄｒａｗｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｅｑｕａｔｉｏｎｔｏｃａｌｃｕｌａｔｅｏｎｔｈｅｈｉｓｔａｍｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈｉｓｔａｍｉｎｅｓｔａｎｄａｒｄｐｅａｋａｒｅａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．２．３ＴｈｅｅｎｚｙｍｅｏｆｔｈｅａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｎｅｔｒｅｌｅａｓｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎＴａｋｅｔｈｒｅｅｔｙｐｅｓｏｆｃｅｌｌｓｉｎｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃｇｒｏｗｔｈｐｈａｓｅ，ｓｅｅｄｅｄｉｎ９６－ｗｅｌｌｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒｐｌａｔｅｓｂｙａｄｄｉｎｇ５０９Ｌｏｆｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐａｆｔｅｒｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆ４８ｈｅａｃｈｈｏｌｅｂｙａｄｄｉｎｇ５０９ＬｏｆＣ４８／８０ｏｆＴｒｉｔｏｎＧｒｏｕｐｂｙａｄｄｉｎｇ５０９Ｌｏｆ０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００ｃｅｌｌｌｉｓｐｓ，ａｌｌｍｅｍｂｒａｎｅｌｉｓｐｓ，ｒｅｌｅａｓｅｏｆａｌｌａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅａｎａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｅｎｚｙｍｅｃｏｎｔｅｎｔｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｂｌａｎｋａｄｄｉｎｇｅｑｕａｌａｍｏｕｎｔａｄｄｉｎｇｏｆＴｙｒｏｄｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．ＲｅａｃｔｉｏｎＯｍｉｎ，１５ｍｉｎ，３０ｍｉｎ，４５ｍｉｎ，ａｎｄ６０ｍｉｎ．Ｂｙ１５０９ＬｏｆＳｔｏｐＳｏｌｕｔｉｏｎｔｏｔｅｒｍｉｎａｔｅｎｌＴｌｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＯＤｖａｌｕｅｏｆ４０５ｈｏｌｅｒｅａｃｔｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎ，ａｎｄｒｅｓｕｌｔｓｅｘｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌｔｏｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｔｈａｔｔｈｅＣ４８／８０ｓｔｉｍｕｌａｔｅｇｒｏｕｐｌＶ硕士学位论文ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｇｒｏｕｐｏｆｅｎｚｙｍｅｒｅｌｅａｓｅｗｉｔｈＴｒｉｔｏｎｌｉｓｐｓＡｌｌｍｅｍｂｒａｎｅａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｒｅｌｅａｓｅｏｆｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｔｈｅｔｏｔａｌｍｅａｓｕｒｅｏｆｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐＣ４８／８０ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｔｈｅｎｅｔｒｅｌｅａｓｅｏｆａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ．２．４ＤｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎｐｅｒｃｅｎｔａｇｅＴａｋｅｔｈｒｅｅｏｆｔｈｅｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃｇｒｏｗｔｈｐｈａｓｅｃｅｌｌｓｐｌａｎｔｅｄｉｎ２４－ｗｅｌｌｐｌａｔｅｓ．４８ｈｓｔｉｃｋｅｒｓｗａｌｌｇｒｏｗｔｈ，ｄｉｓｃａｒｄｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｂｙａｄｄｉｎｇＴｙｒｏｄｅｆｌｕｉｄｂａｌａｎｃｅｏｆ１０ｍｉｎｕｔｅｓ．ＴｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｔｏｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｊｏｉｎｓＣ４８／８０ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄｓｅｔｔｈｅｂｌａｎｋｊｏｉｎｔｈｅＴｙｒｏｄｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ａｔ０ｍｉｎ，１５ｍｉｎ，３０ｍｉｎ，４５ｍｉｎａｎｄ６０ｍｉｎｔｏｓｔｏｐｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｏｆｎｅｕｔｒａｌｒｅｄｓｔａｉｎｉｎｇ，ｒａｎｄｏｍｃｏｕｎｔｏｆ１００ｃｅｌｌｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎｉｎｃｅｌｌｓｎｕｍｂｅｒｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓｅｌｌｏｆｆｐａｒｔｉｃｌｅｓｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓａｂｏｖｅｕｓｅｄＳＰＳＳ１３．０ＨｉｓｔａｍｉｎｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｅａｋａｒｅａｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｕｓｅｄＯｆｆｉｃｅＥｘｃｅｌ２０１Ｏ３．Ｓｅｖｅｒａｌｃｅｌｌ．３．１ＴｈｅＩＣ５０ｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｅｖｅｒａｌｄｒｕｇｓｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｉｎｔｈｅＰ８１５ｃｅｌｌｓＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｃｏｍｍｏｎｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅａｎａｌｙｚｅｏｎｓｏｆｔｗａｒｅ’Ｓ０ｎｅＷａｙＡｎｏｖａｍｅｔｈｏｄ．ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｌｉｎｅａｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ’ａｆｆｅｃｔｉｏｎｔｏＰ８１５ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆｉｎｊｅｃｔｉｏｎａｓａｍｐｌｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｌｉｑｕｉｄｍｏｔｈｅｒｌｉｑｕｏｒ，ａｎｄ１０ｔｉｍｅｓｔｈｅｖｏｌｕｍｅｐｅｒｄｉｌｕｔｅｄｔｏｍｏｔｈｅｒｌｉｑｕｏｒ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｗｅｒｅｓｅｔｕｐｔｏｇｅｔｈｅｒｗｉｔｈｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙａｓｉｘｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ，ｓｉｘｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｃｏｍｐｌｅｘｈｏｌｅｓ．Ｔａｋｅｔｈｅｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃｐｈａｓｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐ，ｅａｃｈｇｒｏｕｐｏｆｓｉｘｇｒｏｗｔｈＰ８１５ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｅｅｄｅｄｉｎ９６－ｗｅｌｌｐｌａｔｅｓｆｏｒ１２ｈ，ｔｈｅｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｂｙａｄｄｉｎｇ５０９Ｌｍｅｄｉｃｉｎｅｍｅｄｉｕｍ，ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐｂｙａｄｄｉｎｇ５０９Ｌｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｆｏｒ３６ｈ，ａｄｄｅｄｔｏｅａｃｈｗｅｌｌａｔｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｃｕｌｔｕｒｅｄＶＡＢＳＴＲＡＣＴｂａｌａｎｃｉｎｇＭＴＴｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｉｎｃｕｂａｔｅｄ４ｈｕｎｄｅｒｔｈｅｓａｍｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ＡｓｐｉｒａｔｅｍｅｄｉｕｍａｎｄａｄｄｉｎｇｔｏｔｈｅＤＭＳＯｓｏｌｕｔｉｏｎｓｈｏｃｋｓｄｉｓｓｏｌｖｅｄａｔｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＯＤｏｆｔｈｅｈｏｌｅａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｒｅｐｅａｔｅｄｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｔｈｒｅｅｔｉｍｅｓａｎｄａｖｅｒａｇｅｄ．３．２ＳｅｖｅｒａｌｃｏｍｍｏｎｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｃｅｌｌＴｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｉｎｖｉｔｒｏｍａｓｔｃｅｌｌｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎｍｏｄｅｌｔｏｆｉｌｔｅｒｔｈｅｓａｍｅｗａｙｔｏｄｅｔｅｃｔａｒａｔｅ（％）．ＥａｃｈＴＣＭｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｉｎｊｅｅｔｉｏｎｓ’ａｆｆｅｃｔｉｏｎｔｏＰ８１５ｖａｒｉｅｔｙｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎ６０ｍｉｎａｆｔｅｒｈｉｓｔａｍｉｎｅｒｅｌｅａｓｅｏｆＰ８１５ｃｅｌｌｓｔｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅＩＣ５０ｏｆｎｅｔｒｅｌｅａｓｅａｎｄｃｅｌｌｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ．ＴｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｅｔＣ４８／８０ｔｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄＴｙｒｏｄｅｓｔｉｍｕｌａｔｅｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓａｂｏｖｅｕｓｅｄＳＰＳＳ１３．０ａｎａｌｙｚｅｓｏｆｔｗａｒｅ’ＳＯｎｅＲｅｓｕｌｔｓ：１．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅＷａｙＡｎｏｖａｍｅｔｈｏｄ．ＭＴＴａｓｓａｙａｎｄｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＣＣＫ－８ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｔｒｅｎｄｉｓｂａｓｉｃａｌｌｙｔｈｅｓａｍｅ．ａｎｄｃｏｍｅｔｏｔｈｅＲＢＬ．２Ｈ３ｃｅｌｌｓｉｎ０．８×１０５／ｍＬ．１．０×１０５／ｍＬｗｉｔｈｉｎｔｈｅＰ８１５ｃｅｌｌｓａｔ０．５×１０５／ｍＬ．０．８×１０５／ｍＬｒａｎｇｅ．Ｋｕ８１２ｃｅｌｌｏｂｖｉｏｕｓｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｔｈｅｒｅｉｓｎｏｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｓｌｅｅｐｇｒｏｗｔｈｐｈａｓｅａｎｄｐｌａｔｅａｕｉｎ０．８×１０５／ｍＬ．１．０×１０５／ｍＬｒａｎｇｅ．ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌａｔｅｎｃｙｔｈｅｃｅｌｌｌｉｎｅｓｔｏ２．ＣｈｏｏｓｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｉｎｖｉｔｒｏｍａｓｔｃｅｌｌｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎｍｏｄｅｌＡｆｔｅｒｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｗｉｔｈ０－６０ｍｉｎ，ｔｈｒｅｅｃｅｌｌｌｉｎｅｓａｌｌｅｒｇｉｃａｃｔｉｖｅｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅｓａｍｅｓｔｉｍｕｌｕｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅｔｈｅＰ８１５ｃｅｌｌｓｕｂｓｔａｎｃｅｒｅｌｅａｓｅｒｅｌｅａｓｅｉｎｈｉｓｔａｍｉｎｅｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｈｅｘａｍｉｎｅｅｎｚｙｍｅｎｅｔｒｅｌｅａｓｅｔｏｔｈｅｓｕｄｄｅｎ硕士学位论文ｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｉｎｄｉｃａｔｏｒｓａｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｏｔｈｅｒｔｗｏｃｅｌｌｌｉｎｅｓｏｃｃｕｒｒｅｄｅａｒｌｙ，ｔｈｅｓｕｄｄｅｎｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｅｆｆｅｃｔ．３．ＳｅｖｅｒａｌｃｏｍｍｏｎｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ’ａｆｆｅｃｔｉｏｎｔｏＰ８１５ｃｅｌｌＦｉｌｔｅｒｏｕｔｔｈｅＰ８１５ｃｅｌｌｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｒｅｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｅｖｅｒａｌｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；ｔｈｒｅｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｍｅａｓｕｒｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓａｒｅｉｎｌｉｎｅ．ＷｈｉｃｈＸｕｅＳａｉＴｏｎｇｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ＱｉｎｇＫａｉｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｔｈｅＬｉｎｇＩｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｉｎｊｅｃｔｉｏｎＳｈｕａｎｇＨｕａｎｇＬｉａｎｐｏｗｄｅｒｆｏｒｔｈｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎａｎｄｗａｔｅｒＸｉａｎｇｄａｎＺｈｏｎｇｊｉｅｆｅｎｇｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆｍａｔｒｉｎｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｔｈｒｅｅｉｎｄｉｃａｔｏｒｓｗｉｔｈｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｍｏｒｅｔｈａｎｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｗｅｒｅＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ，ｎａｍｅｌｙ（Ｐ＜０．０１），ｐｒｏｍｐｔｅｄｏｆＰ８１５ｃｅｌｌｓｈａｖｅａｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｔｒｏｎｇａｌｌｅｒｇｅｎｉｃ．Ｄａｎｓｈｅｎｉｎｊｅｃｔｉｏｎｔｈｒｅｅｉｎｄｅｘｅｓｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ，Ｐ＜０．０５，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈａｔＤａｎｓｈｅｎｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎｏｆＰ８１５ｃｅｌｌｓｅｘｉｓｔ．Ｇａｌｌｗｏｏｄｉｎｊｅｃｔｉｏｎｎｅｔｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｃａｎｅｎｚｙｍｅｒｅｌｅａｓｅｉｎｄｉｃａｔｏｒｏｆｄｅｇｒｅｅｔｗｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔ，Ｐ＜Ｏ．０５，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｗｉｔｈｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｗａｓｉｎｊｅｃｔｉｏｎＰ８１５ｏｆｔｈｅｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒｗｏｏｄａｌｓｏｂｅｐａｒｔｌｙｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｔｈｅｒｅｍｏｖａｌｏｆｔｈｅｃｅｌｌｐａｒｔｉｃｌｅｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍｉｎｔｈｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｆｌｕｉｄ，ＧｉｎｋｇｏｉｎｄｅｘｅｓｗｉｔｈＰ８１５ｃｅｌｌｓｂｉｌｏｂａｅｘｔｒａｃｔｇｒｏｕｐｎｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ＳｈｅｎｇｍａｉＩｎｊｅｃｔｉｏｎｔｈｒｅｅｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｏｎｅｌｕｓｉｏｎ：ｔｈａｔｔｈｅｔｈｒｅｅｉｓｓａｆｅｒｉｎｔｅｒｍｓｏｆＡｍｏｎｇｔｈｒｅｅｋｉｎｄｓｏｆｍａｓｔｃｅｌｌｏｒｂａｓｏｐｈｉｌｃｅｌｌｌｉｎｅ，ｔｈｅＰ８１５ｃｅｌｌｌｉｎｅｉｓｍｏｓｔｖｉｔｒｏｓｃｒｅｅｎｉｎｇｍｏｄｅｌｗｈｉｃｈｃａｕｓｅｄｔｈｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｂｙｓｕｉｔａｂｌｅｔｏｔｒｉｇｇｅｒａｌｌｅｒｇｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｓｉｎｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ．ＵｎｄｅｒＣ４８／８０，Ｐ８１５ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｔｈｅｏｂｖｉｏｕｓｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓａｒｅｅａｓｉｌｙｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈｇｏｏｄｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ．ＵｎｄｅｒｔｈｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｅｖｅｒａｌｃｏｍｍｏｎｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＶｌｌＡＢＳＴＲＡＣＴＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｇｎｏｆｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｒｏｍｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｍａｔｃｈｅｓｍｏｓｔｏｆｔｈｅｏｆｆｉｃｉａｌａｎｎｏｕｎｃｅｍｅｎｔａｎｄｔｈｅＳｔａｔｅＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎａｎｄＡｄｖｅｒｓｅＤｒｕｇＲｅａｃｔｉｏｎｓＢｕｌｌｅｔｉｎａｄｖｅｒｓｅｒｅａｃｔｉｏｎ．ＵｎｄｅｒｔｈｅｄｅｓｃｒｉｂｅｄｉｎｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈａｌｌｅｒｇｉｃｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｗｅｏｂｓｅｒｖｅｄａｐｐａｒｅｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｓｕｌｔｏｆＰ８１５ｃｅｌｌａｎｄｔｈｅｎａｇｅｔｉｖｅｃｏｍｐａｒａｔｉｏｎ；ｕｎｄｅｒｔｈｅｎｏｎ－ａｌｌｅｒｇｉｃｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ’Ｓｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，ｗｅｏｂｓｅｒｖｅｄａｐｐａｒｅｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｓｕｌｔｏｆＰ８１５ａｎｄｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｍｐａｒａｔｉｏｎ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｓＰ８１５ｍａｙｂｅａｎｅｗｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｉｎｖｉｔｒｏｍａｓｔｃｅｌｌｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎｍｏｄｅｌｗｈｅｎｔｅｓｔｉｎｇａｌｌｅｒｇｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＫｕ８１２Ｐ８１５ＲＢＬ一２Ｈ３ｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓａｎａｐｈｙｌａｃｔｏｉｄｒｅａｃｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏｍｏｄｅｌＶＩｌｌ硕士学位论文目录摘要……………………………………………………………………ＩＡＢＳＴＲＡＣＴ…………………………………………………………………………………．．ｉ前月ｌＪ言…………………………………………………………………………一１吾…………………………………………………………………………………………．１１中药注射剂的发展历程………………………………………………………２２中药注射剂所引起的类过敏反应……………………………………………３３肥大细胞的相关研究…………………………………………………………６参考文献：……………………………………………………………………．１６第一章筛选建立体外肥大细胞脱颗粒模型的细胞系……………．２１第一节细胞培养条件的优化………………………………………………．２１１．材料与试剂……………………………………………………………２１２．实验方法………………………………………………………………２３３．实验结果………………………………………………………………２５４．结果讨论………………………………………………………………３３第二节用于建立体外肥大细胞脱颗粒模型细胞系的筛选………………．３８１．材料与试剂……………………………………………………………３８２．实验方法………………………………………………………………４１３．实验结果………………………………………………………………４４４．结果讨论………………………………………………………………４８目录参考文献………………………………………………………………………．５２第二章几种常见中药注射剂对Ｐ８１５细胞脱颗粒的影响…………５４第一节几种常用中药注射剂对Ｐ８１５细胞ＩＣ５０的检测……………………５４１．材料与试剂……………………………………………………………５４２实验方法………………………………………………………………．５５３实验结果………………………………………………………………．５６４结果讨论………………………………………………………………．５７第二节几种常见中药注射剂对Ｐ８１５细胞脱颗粒的影响…………………５９１．材料与试剂……………………………………………………………５９２．实验方法………………………………………………………………６０３．实验结果………………………………………………………………６２４．结果讨论………………………………………………………………６３参考文献：……………………………………………………………………．６５全文总结及展望………………………………………………………．６６参考文献………………………………………………………………．７０攻读硕士期间发表论文：……………………………………………．７１致谢…………………………………………………………………．７２南方医科大学学位论文原创性声明…………………………………７６统计学证明……………………………………………………………．７７硕士学位论文前言近些年来，中药注射剂以其疗效显著，起效迅速，逐渐在临床应用上崭露头角。随着其应用的不断扩大，它的安全性隐患也逐渐被重视起来，２００６年以来，中药行业相继发生了鱼腥草、双黄连、清开灵、刺五加、茵栀黄等一系列产品的严重不良反应事件。尽管造成这些事件的原因是多方面的，但是也给中药企业和相关产业，甚至关联产业的发展造成了巨大的负面影响，中药注射剂的最近十年走得着实步履维艰。然而，中药在中国有着几千年的使用历程，有广泛的群众基础，也确实对人民生活和生命健康做出过突出贡献。不能因为某一两个品种的质量问题而全盘否定。同时，中药注射剂是中药科技发展的里程碑，在临床上有不可替代的作用，更不能因为个别不良反应事件而放弃使用。２００９年７月国家食品药品监督管理局正式启动全国中药注射剂安全性再评价工作，发布《关于做好中药注射剂安全性再评价工作的通知》并同时发布《中药注射剂安全性再评价基本技术要求》（征求意见稿）作为再评价工作的基本技术要求，首批启动了双黄连注射液和参麦注射液的安全性再评价工作。２０１０年国家食品药品监督管理局再度发布《关于做好２０１０年中药注射剂安全性再评价工作的通知》，继续紧抓安全性再评价工作不放松。再次把鱼腥草注射液和鱼金注射液列入再评价工作。面对国家对于中药注射剂安全性重视程度的不断升高，坐等国家要求显然不是中药注射剂工作者应展现的工作作风。本课题依托广东省产学研重大专项“清热解毒类中药注射剂安全性共性关键技术的研究”，（项目编号：２０１０Ａ０９０２０００７６），着重对中药注射剂安全共性问题中致敏物质体外筛查模型进行了探索和研究。第一部分前言１中药注射剂的发展历程中药注射剂是我国特有的中药剂型，是中药应对急症重症的重要手段，它是以中医药理论为指导，采用现代科学技术和方法，将从中药或天然药物的单方或复方中提取的有效物质制成无菌溶液、混悬液或临用前配成溶液的灭菌粉末供注入体内的制剂【１】。中药注射剂从诞生至今已有近７０年的历史。２０世纪４０年代，八路军在临床急用的迫切条件下自行研制出了柴胡注射液，首开中国中药注射剂之先河。１９５４年，武汉制药厂将柴胡注射液投入批量生产。进入６０年代的中国，掀起了中药注射剂研究的第一次热潮，共研制出包括“板蓝根注射液”“抗６０１注射液”“茵栀黄注射液”在内的２０多个品种的注射剂，有的至今仍在广泛使用［２】。１９６３年版的《中国药典》也第一次的收录了中药注射液【３Ｊ。２０世纪７０年代，中药注射剂进入“大跃进”式的发展期，在此期间经过临床使用、有资料报道的中药注剂液就有７００余种，收载的中药注射剂也增至２３种之多【４】。《中国药典》１９７７年版（一部）依托现代基础药理、药物分析以及相关提取分离技术的发展与突破，中药注射剂以其确切的临床疗效，受到越发的关注，市场也在迅速扩增。在此期间，通过我国中药注射剂研究工作者的努力，研制出了世界上第一支中药粉针剂――注射用双黄连粉针剂，改变了中药水针剂型易水解、易沉淀、稳定性差等诸多弊端，大大增加了中药注射剂的稳定性，提高了临床疗效。这使传统中药在剂型和给药方式上有了划时代的突破，也堪称中药注射剂里程碑样的发展历程。上世纪８０年代，中药注射剂掀起了第二次研究热潮，其数量也曾一度达到１４００种之多。非常规的高速发展，也暴露了中药注射剂技术管理方面的缺陷，在这期间中药注射剂在治病救人的同时也埋下了安全隐患。随着１９９３年卫生部硕士学位论文颁发《中药注射剂研制指导原则》【５】，１９９９年原国家药品监督管理局发布《中药注射剂研究的技术要求》【６Ｊ，对于中药注射剂的质量管理才日趋规范。但由于中药注射剂具有多成份多靶点的特性，加之以注射方式给药，药物直接进入血液也带来了一些传统中药制剂所未曾有过的安全性问题。特别是中药注射剂引起的过敏反应更是危及生命。２００６年６月，鱼腥草注射液由于使用后引起过敏性休克等严重不良反应，被国家食品与药品监督局紧急叫停［７】；２００８年，刺五加注射液和茵栀黄注射液相继发生不良反应【８１，双黄连注射液在２００９年报出疑似不良反应【９１，同年，穿琥宁注射液因导致血小板减少而被停用，莪术油因导致肺炎和严重的过敏反应而停用，清开灵注射液也发现患者用药后因呼吸衰竭死亡的个例。中药注射剂的安全性问题越来越受到业内外人士的广泛关注。２中药注射剂所引起的类过敏反应中药注射剂危及生命的严重不良反应主要为过敏反应，约占不良反应发生率的８０％，其中以过敏性休克、呼吸困难、死亡等占多数。如果能够有效地控制过敏反应，定能够大大降低中药注射剂不良反应的发生率，尤其是严重不良反应的发生将大大降低。然而，针对注射剂过敏反应，《中国药典》（２０１０版）仅收录以豚鼠为对象的主动全身过敏试（ＡＳＡ）和被动皮肤过敏试验（ＰＣＡ）两项。豚鼠易于致敏，曾是理想的过敏试验对象，常规的过敏试验也多采用豚鼠。但由于豚鼠个体较小，有时行为改变不够典型和明显，加之行为学观察本身也存在较多主观因素，使得豚鼠试验容易出现假阳性或假阴性的结果。另外豚鼠的全身主动过敏试验和被动皮肤过敏试验主要针对依赖ＩｇＥ介导的经典途径过敏反应，对于化学药物或单一成分引发的经典过敏反应有较为确切的检测效果，但中药注射剂常发生无第一部分前言需ＩｇＥ介导的，首次接触即产生类似于经典过敏反应临床症状的类过敏反应，豚鼠试验对种不良反应的检测效果并不理想。经典途径的过敏反应，过敏原首次进入机体后，致敏机体产生特异性的ＩｇＥ，当过敏原再次刺激机体时被特异性地识别，并与抗体发生反应，导致机体肥大细胞、嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放大量生物活性物质，继而引起一系列免疫效应。而常发生于中药注射剂不良反应中的则是另外一种途径的免疫反应，即类过敏反应，两者有着根本区别。（见表１）表１类过敏反应和Ｉ型超敏反应比较【４０】Ｔａｂ．１Ｔｈｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｒｅａｃｔｉｏｎａｎｄａｎａｐｈｙｌａｃｔｏｉｄ，ｐｓｅｕｄｏａｌｌｅｒｇｉｃｉｄｉｏｓｙｎｃｒａｔｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｏｒＩ型超敏反应相同表现：类过敏反应血管性水肿、哮喘、支气管痉挛、胸痛、寒战、气哽、意识模糊、结膜炎、咳嗽发绀、死亡、皮炎、水肿、红斑、发热、潮红、头痛、高血压、低血压、血氧不足、背下部疼痛、腰痛、代谢性酸中毒、恶心、瘤痒、皮疹、鼻炎、休克、斑疹、喷嚏、呼吸急促、刺痛感、荨麻疹等。不同表现：多次暴露才会出现反应强度随反复暴露次数的增多而增强经对症治疗症状才会消失发生率极低需要ＩｇＥ介导首次暴露即可产生症状反应强度随反复暴露次数的增多而减弱甚至消失轻微症状及某些严重可自行消失发生率较高无需ＩｇＥ介导类过敏反应是非经典途径的免疫反应，即不需预先接触抗原物质，也无特异性ＩｇＥ参与，因临床症状与过敏反应相似而得名，其准确机制尚不明确。现已发现的类过敏反应发生机制主要有以下三种：４硕士学位论文１）药理性组胺释放类的过敏反应：许多药物可直接作用于肥大细胞和嗜碱性粒细胞致使其释放组胺等过敏活性物质。其释放量与药物剂量和注射速度相关，小量或缓慢给药可减少组胺释放，剂量加大或给药速度加快时，过敏反应发生概率更高，发生程度更剧烈。组胺是类过敏反应的主要介质，其他介质还有肿瘤坏死因子、嗜酸细胞趋化因子、５一羟色胺、前列腺素以及缓激肽等，病理作用与其血浓度相关。通常认为：人体循环系统中的组胺＜ｌｎｇ／ｍｌ并不引起症状。１～２ｎｇ／ｍｌ仅有皮肤反应，６ｎｇ／ｍｌ即可引发全身性反应，＞１００ｎｇ／ｍｌ患者可能发生严重的全身性过敏反应，甚至死亡。２）旁路途径补体激活：血浆补体主要有９种（Ｃ１～－Ｃ９），加之亚型共有３０余种。可由传统和旁路途径激活而释放过敏毒素，使肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放血管活性物质（组胺占优势）。传统途径激活的链锁反应如下：Ｃ１＿Ｃ４＿Ｃ２＿Ｃ３＿Ｃ５＿Ｃ６＿Ｃ７＿Ｃ８＿Ｃ９。旁路途径补体激活则越过Ｃ１、Ｃ４与Ｃ２，直接激活Ｃ３并介导其后各步反应。过敏反应可由此二种途径激活，而类过敏反应仅由旁路途径激活【１…。３）聚集作用：不适当的给药（速度过快或药物混合）会使蛋白质与体循环中某些免疫球蛋白（ＩｇＭ或ＩｇＧ）发生聚集。轻者会在注射局部出现水泡和沿静脉走行的皮肤变红的症状，严重时也可发生胸、腹及蔓延全身的荨麻疹。此种聚集物如进入肺内，可发生支气管痉挛或休克，这也是类过敏反应的一种。中药注射剂所引发的类过敏反应主要是由第一种途径即药物进入体内后直接刺激肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放生物活性，故原有的致敏物质筛选模型在中药注射剂质量控制方面效果欠佳。面对如此现状，当务之急就是解决致敏物质筛查模型，建立有效、稳定、快捷的针对中药注射剂类过敏反应的筛查模型。第一部分前言３肥大细胞的相关研究３．１肥大细胞研究概况白１８７８年，德国的ＰａｕｌＥｈｒｌｉｃｈ首次描述并命名了肥大细胞（ｍａｓｔｃｅｌｌ，ＭＣ），十多年后，ＥｌｉｅＭｅｔｈｃｎｉｋｏｆｆ首次提出肥大细胞能吞噬和杀死细菌，但能力较弱。日后人们逐渐发现，肥大细胞的主要功能是通过释放其颗粒内容物而在引发炎症反应程中起重要作用。近数十年来，随着生物学技术的发展，对肥大细胞的认识也愈来愈深刻。肥大起源于ＣＤ３４＋骨髓前体细胞，干细胞因子（ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ，ＳＣＦ）作用于细胞表面的干细胞因子受体ｃ．ｋｉｔ促进造血干细胞向肥大分化。分泌型干细胞因子可明显促进肥大细胞增殖、组胺分泌及肿瘤坏死因子（ＴＮＦ．ａ）ｍＲＮＡ的表达【１１１。进入血液循环系统的为未成熟型肥大细胞，无颗粒形成，细胞表面无高亲和力ＩｇＥ受体，在外周组织中继续成熟、分化。肥大细胞有２个细胞亚型：类胰蛋白酶肥大细胞（ｔｒｙｐｔａｓｅ＋，ＭＴＣ）和类糜蛋白酶肥大细胞ｆｃｈｙｍａｓｅ．，ＭＣＴＣ）。肥大细胞广泛分布于皮肤黏膜中，是皮肤许多生理和病理反应、速发型超敏反应、宿主防御性免疫反应和炎症反应的主要效应细胞。受到一些免疫或非免疫性刺激后，肥大细胞被激活并释放一系列炎性介质如组胺、中性蛋白酶、肿瘤坏死因子、白介素等，致使机体出现过敏症状。当发生过敏性炎症反应时，Ｔｈ２细胞分泌细胞因子，刺激肥大细胞成熟和增殖。而当刺激因素消退后，增殖的肥大细胞通又能过多种途径被机体清除。肥大细胞是速发型超敏反应的重要中介细胞和许多炎症反应后期的效应细胞。在速发型超敏反应中，肥大细胞被刺激后脱颗粒释放的介质可改变血管通透性和平滑肌张力，引起机体产生过敏、荨麻疹、血管水肿等症状。而在炎性反应后期，肥大细胞分泌的许多化学趋化因子会造成炎性细胞的浸润，导致亚急性和慢性病理变化。临床上，许多慢性皮肤炎症的增生性反应中都有肥大细胞的增殖和活化。肥大细胞也与瘙痒等症状密切相关。在变态反应性炎症过程中激活的肥大细胞通过淋巴管大量迁移到局部淋巴结并分泌化学趋化因子，吸６硕士学位论文引Ｔ细胞在淋巴结聚集而参与诱发初级免疫反应。激活的肥大细胞表达大量的ＩｇＥ高亲和力受体ＦｃｅＲＩ，并能够被诱导表达涉及Ｔ／Ｂ细胞相互作用和免疫球蛋白生成的ＣＤ４０配体，诱导表达Ｔｈ２细胞因子如ＩＬ．４和ＩＬ．１３，使肥大细胞对各种刺激更敏感，还能够促进肥大细胞与Ｂ细胞相互作，诱导其合成ＩｇＥ，分泌更多的炎性介质。３．２肥大细胞的激活肥大细胞的脱颗粒现象是超敏反应发生的基础，而肥大细胞的激活则是其脱颗粒并产生各种后续反应的前提。很多刺激物引起肥大细胞的活化，不同刺激物活化途径可以不同，通常分为免疫性激活和非免疫性激活两种。３．２．１免疫性激活免疫性激活是肥大细胞激活的经典途径，是由抗原抗体依赖的ＩｇＥ及其受体介导的激活途径。抗原抗体特异性复合物可以与肥大细胞表面ＩｇＥ高亲和受体ＦｃｅＲＩ结合，桥联后，在蛋白酪氨酸激酶ＰＴＫ的参与下，通过一系列的信号转导级联反应，使肥大细胞活化脱颗粒，释放组胺、５一羟色胺、ＴＮＦ．Ｑ等炎症介质和相关细胞因子［１２－１３】。这种激活与肥大细胞表面受体的数目、密度、和被结合受体数目密切相关。肥大细胞也表达ＩｇＧ高亲和力受体Ｆｃｌ＇ＲＩ，它也能通过受体桥联的方式激活肥大细胞，导致脱颗粒的反应［１３】。３．２．２非免疫性激活肥大细胞可由许多不依赖于抗原抗体复合物刺激物的激活，便能够分泌和释放炎症介质的激活途径，如补体片段、离子载体Ａ２３１８７、人工合成的多聚胺类物质Ｃ４８／８０、内源性多肽、细胞因子等，另外某些药物、病毒甚至物理刺激也可激活肥大细胞。Ｃ４８／８０是一种多胺类人工合成的化合物，常作为一种肥大细胞介质的释放剂它激活肥大细胞脱颗粒的机制有以下两种猜测，一种是：Ｃ４８／８０这类拟受体激动剂能绕过传统的受体而直接激活三聚体小分子Ｇ蛋ｎ（ＧＴＰａｓｅ），三聚体小第一部分前言分子Ｇ蛋白的ｐ丫亚基通过Ｄｂｌ家族的Ｇ蛋白作用于Ｒｈｏ家族Ｇ蛋白成员：Ｒｈｏ、Ｒａｃ、Ｃｄｃ４２［１４。１５１。另一种可能是它通过直接或间接的方式激活ＰＬＣ［３，进而激活ＰＫＣ并打开胞内钙库，触发胞Ｉ］－＿｜－［１６，１７１。Ｒｈｏ的激活不是直接与激动型的Ｇ蛋白偶联受体（ＧＰｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＧＲＣＰ）相互作用而调节其活性，它需要通过鸟嘌呤核苷交换因子（Ｇｕａｎｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｘｃｈａｎｇｅｆａｃｔｏｒ，ＧＥＦ）如Ｄｂｌ，Ｖａｖｌ，Ｖａｖ２等，来控制这类ＧＴＰａｓｅ的活性。当Ｒｈｏ与ＧＥＦ的ＤＨ结构域（Ｄｂｌｈｏｍｏｌｏｇｙｄｏｍａｉｎ）结合时，催化ＧＴＰ取代ＧＤＰ而激活Ｒｈｏ，当与ＧＡＰ（ＧＴＰａｓｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）作用时，它结合ＧＤＰ而失活。关于Ｒｈｏ调节分泌的下游信号机制目前不清楚，它可能通过多种途径调控细胞脱颗粒：一是Ｃｄｃ４２直接激活ＰＬＣｔｌ８］，二是Ｒｈｏ、Ｃｄｃ４２和Ｒａｃ通过调节质膜下的肌动蛋白丝或其他下游分泌器【１９１。离子载体Ａ２３１８７是链状离子载体，与钙离子配位后形成外部亲脂的配合物钙离子Ａ２３１Ｓ７，钙离配合子Ａ２３１Ｓ７是１：２配合物，由两个Ａ２３１８７分子相互首尾相连而形成。钙离子的运送是靠载体配合物在膜内运动而实现的，它使细胞内的钙离子浓度升高，激活钙离子依赖性的相关蛋白，导致肥大细胞的活化和分泌［２０】。降钙素基因相关肽、Ｐ物质、血管活性肠肽等为内源性神经多肽类物质。研究表明，在皮肤变应性炎症如异位性皮炎、硬币状湿疹的皮损处发现这些多肽数量增加，且与肥大细胞、神经感受器及相应的神经纤维密切相关【２１１。Ｐ物质不仅可诱导肥大细胞脱颗粒，还可诱导其迁移、调节其数量和增殖等。它激活肥大细胞亦和Ｇ蛋白有关［２２１。此外，某些植物凝集素如刀豆蛋白Ａ（ＣｏｎＡ）可引起ＩｇＥ受体交联，介导肥大细胞中组胺等介质的释放‘２３１。有些细胞因子也可激活肥大细胞，如干细胞因子通过肥大细胞表面受体（Ｃ．ｋｉｔ）活化肥大细胞【１１】。肥大细胞上的ＴＬＲ２（Ｔｏｌｌ．１ｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ２）和ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ―ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ４）可与某些细菌产物如多糖类结合而被活化，参与变态反应和天然免疫反应【２４】。硕士学位论文３．３肥大细胞介质的分泌肥大细胞被激活后，立即开始合成和分泌介质，参与炎症进程、免疫反应等各种病理变化。这些介质包括预先形成保存于肥大细胞内部的介质和肥大细胞激活后新合成的介质。它们或与胞浆颗粒一起从胞内排到胞外，或通过分子运动扩散到胞外。预先形成的介质以激活的形式从游离颗粒的可溶性膜中扩散出来，这些介质包括组胺、葡胺聚糖、化学趋化因子多肽、酸性水解酶、中性蛋白酶。新合成的介质主要有花生四烯酸的衍生物（ＬＴｓ、ＰＧｓ）、血小板激活因子等。近年来，还发现激活的肥大细胞能合成和分泌许多细胞因子如ＩＬ．Ｂ、ＩＬ．３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ一６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＴＮＦ一仅、ＩＦＮ―ａ、ＴＧＦ－Ｄ、ＭＩＰ－Ｉｎ、ＭＩＰ―Ｉ［３、ＭＣＰ－Ｉ、ＧＭ．ＣＳＦ、Ｔ细胞活化抗原．３等。３．３．１组胺组胺即Ｂ．咪唑乙胺，是广泛存在于人体内各组织中的一种自体活性物质，其中以肺脏、皮肤黏膜、支气管黏膜、胃黏膜中含量较高。组胺由组氨酸脱氢酶脱梭而形成。新合成的组胺主要与多糖硫酸盐、肝素或软骨素硫酸盐以及酸性蛋白形成复合物储存于肥大细胞和嗜碱性粒细胞的颗粒中。而活化的游离态组胺则是机体作为对刺激和损伤的一种反应而被释放到周围组织中。脑组织中的组胺作为神经递质存在，参与神经内分泌、心血管系统调节。组胺通过特异性的位于靶细胞膜表面的组胺受体而发挥其生理效应。迄今为止所确定的三种不同的组胺受体分别被命名为Ｈ１、Ｈ２和Ｈ３受体。组胺对人体心血管系统最突出的作用是扩张小血管。Ｈ１和Ｈ２受体均参与介导小动脉和小静脉的扩张，使外周阻力降低，血压下降，并伴有潮红、头痛等症状。组胺可增加毛细血管的通透性、使渗出增加，可引起水肿，严重时甚至导致循环血量减少，引起休克。该作用主要是微循环中血管内皮上的Ｈ１受体兴奋后，使细胞内肌动蛋白和肌球蛋白收缩，导致相邻的内皮细胞互相分离，间隙增大所致。组胺对心脏的直接作用包括增强心肌收缩力、加快心率和减慢房室传导，主要由ＨＩ受体介导。除第一部分前言减慢房室传导主要由Ｈ１受体介导外，其它心脏兴奋作用主要与Ｈ２受体兴奋有关。但在静脉注射组胺时，所见到的心脏兴奋主要是继发于血压降低的反射效应。组胺通过Ｈｌ受体兴奋各种血管外平滑肌，如可使支气管平滑肌收缩，哮喘患者对组胺尤为敏感，可致呼吸困难加重病情。组胺还可兴奋胃肠道平滑肌和子宫平滑肌，引起痉挛性腹痛。组胺可以刺激胃黏膜细胞的Ｈ２受体，是胃酸分泌的强烈刺激物。组胺也可以刺激胃主细胞使胃蛋白酶增加。常规剂量的组胺对其他腺体的分泌无明显影响，大剂量时可引起肾上腺髓质释放。另外，组胺促进胃酸分泌的作用可用于诊断真、假性胃酸缺乏症。组胺对感觉神经末梢有强烈的刺激作用，尤其对调节痛和痒的神经，该效应器由Ｈ１受体所调节。组胺还可激动中枢组胺受体，引起中枢兴奋【２５］。组胺是过敏反应中最主要的活性物质之一［２６１，其上述药理作用导致机体产生潮红、头痛、水肿、低血压以及休克等症状均与过敏反应相关。许多药物引起的过敏反应都怀疑与组胺有关，血浆组胺常作为急性过敏反应早期诊断指标之一，并已被临床医生们喻为一项急性过敏监测的“金标准”。一项对临床医生的问卷调查和文献调研显示，绝大多数医生认为，血浆组胺是诊断急性过敏反应发生与否的的一项必要检测指标，但同时他们也认为应针对临床过敏样症状和血浆组胺水平的具体相关性进行深入研究‘２７１。血浆组胺作为过敏反应的生物标志物还存在几个方面的问题：首先不同来源的肥大细胞释放组胺情况不一样。Ｅｎｎｉｓ等对能引起组胺释放的４种造影剂和２种阿片类镇痛剂引起不同组织来源肥大细胞释放组胺的程度进行体外试验，即将这些受试物与不同组织来源的猪的肥大细胞（包括肺、肝、肾和心肥大细胞）和大鼠的肥大细胞（包括肺肥大细胞和腹腔肥大细胞）进行共育，然后检测其组胺释放率，发现不同种属不同组织来源的肥大细胞对这些药物的反应差别极大【２８】。硕士学位论文其次血浆组胺水平与临床过敏样症状发生的一致性有待进一步确证。由于术前麻醉过程中患者易出现过敏反应，为确证这种反应与血浆组胺水平间的关系，Ｓｉｄｅｒ等刚分别在人体和犬中进行了相关试验。人体试验发现，健康受试者在静脉注射组胺后血浆组胺水平均出现不同程度升高，血浆组胺水平上升越高越易出现心率加快、血压升高和皮肤反应，但有时血浆组胺轻度升高时也会出现严重的过敏样症状。犬的试验发现，当静脉给予不同浓度的Ｃ４８／８０时，血浆组胺水平升高，组胺浓度在５０一１０００ｎｇ／ｍＬ范围内的犬７０％出现严重反应，但却未发现血压升高和心率加快现象。皮肤反应、血压和心率变化这些在人体和动物体内均易于监测的症状指标与血浆组胺水平存在一定的相关性，但可能存在种属差异。因此还需对其他过敏样症状与血浆组胺的相关性进行研究，并将研究对象扩大到更多的不同物种中。另外血浆组胺作为过敏反应临床诊断和实验室检验指标还存在检测方法上的局限性，主要表现在如下两点：一为组胺半衰期短，要求在症状出现后３０ｍｉｎ内取血检测；另一为血液中的嗜碱性粒细胞含组胺，溶血会影响血浆组胺测定。另外血浆组胺的检测对取血过程本身也有较高要求‘２９１。３．３．２类胰蛋白酶肥大细胞脱颗粒释放的另一种生物活性物质类胰蛋白酶也可作为过敏反应的生物标志物。类胰蛋白酶是特异性存在于肥大细胞的中性蛋白质，占肥大细胞蛋白酶含量的２５％，与其他的肥大细胞蛋白酶一样，类胰蛋白酶合成后以非活性形式储存于肥大细胞中，脱颗粒时释放到胞外。类胰蛋白酶具有４个非共价结合亚单位组成的四聚体结构，四个亚单位有共同的抗原性，各有一个活性中心，其相对分子量为１３４×１０３。由于其分子量较大，并可以与肝素及其他糖蛋白结合，故在生理缓冲液或人体血浆中经高速离心后０－４。Ｃ保存时仍能保持活性。游离的类胰蛋白酶在生理条件下很不稳定，迅速转化为无活性的物质。类胰蛋白酶可裂解为一些细胞外底物如血管活性肠肽、降钙素基因相关肽、纤维粘连第一部分前言蛋白和激肽。类胰蛋白酶还可作为上皮细胞、气道平滑肌细胞和成纤维细胞的生长因子。炎症状态下，类胰蛋白酶可刺激粒细胞趋化因子ＩＬ．８，上调上皮细胞表面ＩＣＡＭ．１的表达，对于上皮细胞的修复及炎性细胞向肥大细胞激活部位迁移具有重要意义。被激活的肥大细胞释放的类胰蛋白酶还可以刺激邻近肥大细胞释放介质，从而起到放大炎性效应的作用［３０－３１］。机体正常情况下血液中几乎不含类胰蛋白酶，而出现过敏反应时血浆类胰蛋白酶浓度可显著升高。人体正常时血浆类胰蛋白酶基础值为０．８．１．５ｎｇ／ｍＬ，浓度大于１５ｎ／ｍＬ时为非正常升高，但患者血浆类胰蛋白酶浓度在正常范围内并不能绝对排除出现过敏反应的可能。类胰蛋白酶的过敏阳性反应和阴性反应的预测准确率分别为９２．６％和５４．３％【３ｌ】。肥大细胞能释放类胰蛋白酶，而嗜碱性粒细胞则不能，因而类胰蛋白酶与组胺相比更能特异性的表征肥大细胞是否发生脱颗粒反应。与组胺相比，类胰蛋白酶释放更缓慢，作用时间更长，但其生理功能目前并不被完全知晓，只知其可能是炎症反应和组织重构的关键活性介质之一。由于类胰蛋白酶在白细胞内的含量极低，溶血和凝血均不会影响其在血液中的浓度，另外类胰蛋白酶半衰期长（约２ｈ），取血时间点容易控制‘２９’３３出】。海洛因可引发过敏反应，体外研究表明海洛因可无需抗体介导而直接刺激肥大细胞脱颗粒释放组胺和类胰蛋白酶等生物活性介质，怀疑其为类过敏反应产生的原因。Ｒｏｏｋ等【３３Ｊ对此进行了体内验证，以类胰蛋白酶作为肥大细胞脱颗粒释放活性介质的生物标志物，他们检测了静脉注射海洛因的患者注摄药物前后血浆类胰蛋白酶水平，发现给药后患者血浆类胰蛋白酶水平均不同程度升高，急性过敏等严重症状患者的血浆类胰蛋白酶升高程度尤为显著。血浆组胺和类胰蛋白酶可以作为诊断过敏反应的生物标志物，但在临床实际应用中二者的灵敏性还有待提高。临床系列研究显示，在急诊部就诊的９７名被诊断为过敏反应阳性的患者中，只有４２％的患者血浆组胺水平升高，２１％的患者血浆类胰蛋白酶水平升高【３４１。这可能与患者就诊时间和取血检测的时间点有硕士学位论文关，类胰蛋白酶最佳检测时间为过敏样症状出现后１．２ｈ，而组胺的最佳检测时间为症状出现后１０ｍｉｎ［２９１。３．３．３特异性ＩｇＥ血浆组胺和类胰蛋白酶为类过敏反应和Ｉ型超敏反应共同的生物标志物，区别两类反应建立类过敏反应的专属性生物标志物，还应进行特异性ＩｇＥ检测，特异性的ＩｇＥ仅在过敏反应中出现，类过敏反应过程中，并没有它的参与。其检测方法主要有两种：皮肤试验和体外特异性ＩｇＥ含量测定。Ｉ型超敏反应需ＩｇＥ介导，在Ｉ型超敏反应的临床诊断中常需进行特异性ＩｇＥ检测，当特异性ＩｇＥ水平升高时，表明机体极有可能发生Ｉ型超敏反应，并可依据所检测的ＩｇＥ的特异性确定引起此次Ｉ型超敏反应的特异性抗原。同时，当血浆组胺和类胰蛋白酶水平升高却未见特异性ＩｇＥ产生时，则说明机体可能发生类过敏反应【３５１。因此，诊断类过敏反应类型应对机体的血浆组胺、类胰蛋白酶和ＩｇＥ进行综合评价。３．３．４ＴＮＦ．值ＴＮＦ．Ｇ【有广泛的生物活性，是生物体内重要的炎症因子，参与炎症反应、免疫应答和抗肿瘤等过程。肥大细胞是ＴＮＦ．０【等多利，细胞因子的重要来源，这些细胞因子在变态反应性炎症中起着重要作用。肥大细胞既可预先形成ＴＮＦ．ｃ【并贮存于其颗粒内，也可在被激活后合成新的ＴＮＦ．Ｑ，继而迅速而大量的释放【２８１。由于药物类过敏反应的发生机制目前并不完全知晓，上述过敏反应的生物标志物并不能全面反应类过敏反应发生过程，药物类过敏反应还应监测涉及其他生物标志物。另外，目前对上述生物标志物的研究仍然还不够成熟，在对生物标志物定量检测的同时还应结合症状对患者进行临床监测。随着对药物类过敏反应研究的不断推进，希望能发现某一种或某一系列灵敏而可靠的生物标志物，使对药物类过敏反应的预测和诊断变为可能。第一部分前言３．４肥大细胞活化和介质分泌调节肥大细胞对各种刺激的反应以及反应的强弱受到多种因素的调节，包括细胞内的蛋白激酶、接头分子、第二信使，细胞外钙离子浓度、细胞因子，细胞膜上相应受体的数量和密度、膜糖脂的含量，外界的刺激等。肥大细胞活化是细胞内的一系列信号分子通过酶促级联反应来完成的，活化信号最终导致细胞分泌和脱颗粒等改变。细胞内的很多调节因子可调节细胞对这些活化信号的反应。蛋白激酶ＫＰＡ和ＰＫＣ的激活作用于相应的底物加强活化信号。Ｐ１３Ｉ研可通过各种Ｇｉ．蛋白偶联受体传递各种炎症信号，是肥大细胞活化信号的传递的中心【３２１。ＳＴＡＰ．２／ＢＳＫ通过抑制Ｆｃ￡Ⅺ介导的钙动员，负调节肥大细胞活化信号的转导，并能通过直接抑制ＰＬＣｙ的磷酸化来抑制肥大细胞脱颗粒【３３１。细胞内的一些相关的接头分子也能调节肥大细胞的活化，如Ｇｂａ２能与细胞内的Ｌｙｎ、ＰＬＣｙ相互作用负调节Ｆｃ￡刚诱导的肥大细胞活化【３４１。鸟嘌呤核苷交换因子Ｃｄｃ４２和Ｒａｃｌ对于抗原刺激的肥大细胞钙动员和脱颗粒有重要作用，可能和ＰＬＣｙ有关【３５１。肥大细胞内的肌动蛋白能通过解聚和聚合反应调节其活化和脱颗粒１３６－３７】。细胞外的一些细胞因子、多肽、前列腺素等也能调节肥大细胞的激活和介质的分泌。ＩＮＦ叫可以诱导产生ＮＯ，抑制肥大细胞的功能和炎症反应【３６｜。ＮＯ可能通过修饰肥大细胞内的相关蛋白来抑制其脱颗粒和细胞因子的表达，从而达到调节炎症反应的作用【３７Ｉ。ＰＧＥ２与ＥＰ３受体结合激活活化相关的钙动员，降低细胞内ｃＡＭＰ，因此ＰＧＥ２／ＥＰ３作为一种炎症信号可加强肥大细胞的激活。由于血管通透性升高，血清白蛋白渗漏到炎症部位，被肥大细胞分泌的蛋白酶分解成多肽型的组胺释放肽（ｈｉｓｔａｍｉｎｅｒｅｌｅａｓｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅ，ＨＲＰ）。组胺释放肽可促进肥大细胞释放组胺，促进白细胞趋化、并增强巨嗜细胞的吞噬功能。组胺释放肽可加剧炎症反应并使之慢性化‘３８ｌ。此外，细胞膜上的一些离子通道的开阖能也调节细胞内的相关离子水平，调节细胞的反应性【３９ｌ。１４硕士学位论文综上所述，无论是依据类过敏反应发生的机制和还是肥大细胞自身的生理特点，都有理由相信肥大细胞能够作为中药注射剂致敏物质的体外筛查模型，本实验将分别对三种肥大细胞模型和嗜碱性粒细胞进行研究，筛查出最适合建立中药注射剂引发类过敏反应质体外筛查模型的细胞系，为中药注射剂的安全使用保驾护航。第一部分前言参考文献：［１］赵新先．中药注射剂学［Ｍ］．广东科技出版社，２００３：１．［２］陆廷夷．浅谈中药注射剂的发展之路［Ｊ］．临床药物治疗杂志，２００６，４（６）：３０．２．［３］国家药典委员会．中国药典，ＩＩ部［Ｓ］．北京：人民卫生出版社，１９６３：５３６．［４］国家药典委员会．中国药典Ｉ部【Ｓ］．北京：人民卫生出版社，１９７７：８６３．［５］中华人民共和国卫生部．中药注射剂研制指导原则［Ｓ］．１９９３．０４．２４．［６］国家药品监督管理局．中药新药研究的技术要求ｉｓ］．１９９９．１１．１２．［７】国家食品与药品监督管理局．关于暂停使用和审批鱼腥草注射液等７个注射剂的通告［Ｓ］．国食药监安［２００６］２１８号．２００６．０６．０１．［８】国家食品与药品监督管理局．关于加强葛根素注射剂管Ｎ＠Ｎ矢Ｎ［Ｓ］国食药监注［２００５１６４７号．２００５．１２．２９．［９］国家食品与药品监督管理局．关于开展刺五加注射液药品生产企业整顿工作的通知［Ｓ］．食药监办［２００８］１７２号．２００８．１１．１９．［１０］ＷｅａｎｇｓｒｉｐａｎａｖａｌＴ，ＮｏｍｕｒａＮ，ＭｏｒｉｙａｍａａｓａＴ，ｅｔａｌＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｕｂｅｒｉｚａｔｉｏｎ―ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｉｏｎｉｃｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｐｏｓｓｉｂｌｅａｌｌｅｒｇｅｎｉｃｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍｔｏｍａｔｏ［Ｊ］．ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｃｈｅｍ，２００３，６７（６）：１２９９－３０４．ＲＭ，ｅｔａ１．．Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌ［１１］ＬｕｋａｃｓＮＷ，ＫｕｎｋｅｌＳＬ，Ｓｔｒｉｅｔｅｒｆａｃｔｅｒ（ｃ―ｋｉｔｌｉｇａｎｄ）ａｎｄｉｎｆｌａｍｍｌａｔｏｒｙＢｌｏｏｄ．２００６，８７（６）：２２６２－８．［１２］Ｔａｍｉｒｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｍａｓｔｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎ【Ｊ］．Ｉ，Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ－ＳｔｅｎｎｅｒＲ，ＰｅｃｈｔＩ．ＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｙｐｅＩｒｅｃｅｐｔｏｒｆｏｒＩｇＥｉｎｉｔｉａｔｅｓｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｉｎｍａｓｔ６８７２．８３．ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｅｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００６，３５（２１）：［１３］ＴｋａｃｚｙｋＣ，ＯｋａｙａｍａＹ，ＷｏｏｌｈｉｓｅｒＭＲ，ｅｔｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙＩｇＧａ１．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｍａｓｔｃｅｌｌｓｒｅｃｅｐｔｏｒ［Ｊ】．Ｍ０１．Ｉｍｍｕｎ０１．２００２，３８（１６―１８）：１６硕士学位论文１２８９．９３．［１４］ＡｒｉｄｏｒＭ，ＲａｊｍｉｌｅｖｉｃｈＧｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃＧｐｒｏｔｅｉｎＢｅａｖｅｎＭＡ，ｅｔａ１．ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓｂｙｔｈｅＧｉ３．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２６２（５１３９）：１５６９－７２．［１５］ＣａｍｐｓＭ，ＨｏｕＣ，ＳｉｄｉｒｏｐｏｕｌｏｓＤ，ｅｔａ１．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅｂｙｇｕａｎｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｂｅｔａｇａｍｍａｓｕｂｕｎｉｔｓ［Ｊ］．ＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９９２，２０６（３）：８２１―３１．［１６］ＳｕｌｌｉｖａｎＲ，ＰｒｉｃｅＬＳ，ＫｏｆｆｅｒＡ．ＲｈｏｃｏｎｔｏｌｓＣｏＮｉｃａｌＦ－ａｃｔｉｎｉｎｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙｉｎａｄｄｉｔｉｏｎｔｏ，ｂｕｔｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙｏｆｓｅｃｒｅｔｉｏｎｉｎｍａｓｔｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９９９，２７４（５３）：３８１４０－６．［１７］ＡｌｆｏｎｓｏＡ，ＣａｂａｄｏＡＧＶｉｅｙｔｅｓＭＲ，ＢｏｔａｎａＬＭ．Ｃａｌｃｉｕｍ－ｐＨｃｒｏｓｓｔａｌｋｓｉｎｒａｔａｍａｓｔｃｅｌｌｓ：ｃｙｔｏｓｏｌｉｃａｌｋａｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ，ｂｕｔｎｏｔｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｒｅｌｅａｓｅ，ｉｓｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔｓｉｇｎａｌｆｏｒｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ０１．２０１０，１３０８：８０９―１６．［１８］ＪａｒｖｉｋａｌｌｉｏＡ，ＨａｒｖｉｍａＩＴ，ＮａｕｋｋａｒｉｎｅｎＡ．Ｍａｓｔｃｅｌｌｓ，ｎｅｒｖｅｓａｎｄｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓｉｎａｔｏｐｉｃｄｅｒｍａｔｉｔｉｓａｎｄｎｕｍｍｕｌａｒ２．７．ｅｃｚｅｍａ［Ｊ］．Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔ０１．Ｒｅｓ．２００８，２９５（１）：［１９］ＫｏｚａｋｉｅｗｉｃｚＭ，ＧｏｄｌｅｗｓｋｉＡ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍａｓｔｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅｏｒａｌｍｕｃｏｓａｂｙｏｆｔｈｅｍｉｔｏｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｕｂｓｔａｎｃｅ［Ｊ】．ＣｅｌｌＭ０１．Ｂｉ０１．Ｌｅｔｔ．２００３，８（３）：７２７－３４．［２０］ＴｒｉｅｓｅｌｍａｎｎＮＺ，ＳｏｂｏｌｏｆｆＪ，ＢｅｒｇｅｒＳＡ．Ｍａｓｔａｒｅｃｅｌｌｓｏｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｂｙｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ，ｂｕｔｎｏｔｓｏｌｕｂｌｅ，ｓｔｅｅｌｆａｃｔｏｒｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＣａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＣｅｌｌＭ０１．ＬｉｆｅＳｃｉ．２００３，６０（４）：７５９－６６．［２１］ＶｏｌａｌｕｃｋＳ，ＨｉｒｏｋｏＵ，ＡｔｓｕｈｉｔｏＮ，ｅｔａ１．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆｍａｓｔｃｅｌｌＴｏｌｌ―ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓ２ａｎｄ４ｉｎａｌｌｅｒｇｙａｎｄｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００２，１０９（１０）：１３５１－９．［２２］ＧｕｏＹＭｏｃｈｉｚｕｋｉＴ，ＭｏｒｒｉＥ，ｅｔａ１．Ｒｏｌｅｏｆｍａｓｔｃｅｌｌｈｉｓｔａｍｉｎｅｉｎｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ第一部分前言ｏｆｒａｔｐａｗｅｄｅｍａ：ａｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ２３７．４３．ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｅ０１．２００７，３３１：［２３】ＡｓｓａｎｓｅｎＰ，ＮａｃｌｅｒｉｏＲＭ．ＡｎｔｉａｌｌｅｒｇｙＨ１－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