PBMC培养(细胞聚集) - 细胞实验 - 生物秀
标题: PBMC培养(细胞聚集)
摘要: [PBMC培养(细胞聚集)] 我用PHA诱导人pbmc细胞，第二天观察发现细胞聚集成团生长，刚开始做培养，不知道这种现象是否正常？有老师说他以前培养的是单个散在生长的，也有老师说是聚集生长的，我有些迷糊。望各位不吝赐教，谢谢！ 关键词:[细胞聚集]……
我用PHA诱导人pbmc细胞，第二天观察发现细胞聚集成团生长，刚开始做培养，不知道这种现象是否正常？有老师说他以前培养的是单个散在生长的，也有老师说是聚集生长的，我有些迷糊。望各位不吝赐教，谢谢！
回复是正常现象，而且表明刺激已经生效。回复非常感谢您的帮助！细胞聚集成团生长很难将它们吹打分散混匀，这样的情况况如何做？如何确定是否需要传代？回复想问问楼主你用的PHA剂量多少啊？回复一般10 ug/mL。
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主题：PBMC
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HD、NHL及MM患者PBMC的CD和HLA表达
免疫学杂志 2001年第1期第17卷 短篇报道
作者：王志光　曾云　何争春　 曾卫玲　胡石秀
单位：昆明医学院第一附属医院中心实验室， 云南 昆明 650032
关键词：霍奇金病；非霍奇金淋巴瘤；多发性骨髓瘤；分化群；人白细胞抗原
　　分类号：R392.11　文献标识码：B
　　文章编号：（6-01
Expression of CD and HLA antigen of PBMC in patients with HD，NHL and MM
WANG Zhi-guang　ZENG yun　HE Zheng-chun　ZENG Wei-ling　HU Shi-xiu　
　　作者简介：王志光（1948－），男，云南保山市人，副主任医师，副教授，本科，主要从事临床免疫学的研究。Tel：（8-2776；　E-mail：ckj＠km169．net　参考文献：
　　［1］吕 鸣，孔宪涛，李 莉，等．流式细胞术分析NHL患者细胞免疫功能变化［J］．上海医学，）：73－75．
　　［2］于锦香，栗翠銮，李 霞，等．MM患者外周血T淋巴细胞亚群和CD38细胞的变化及其意义［J］．中华血液学杂志，）：572－574．
　　［3］Fukai K，Kakumu S，Murakami S，et al．Increased peripheral blood Ia positive T cells and their chronic active liver disease［J］．Clin Exp Immunol，－93．
收稿日期：日
修稿日期：日
出版日期：日
日期：日 - 来自[]栏目
抗CD4人-鼠嵌合抗体的鉴定及对PBMC增殖反应的影响
免疫学杂志 2000年第4期第16卷 基础免疫学
作者：张智红　沈关心　杨敬　朱慧芬　张悦
单位：张智红（同济医科大学免疫学教研室，湖北　武汉　430030）；沈关心（同济医科大学免疫学教研室，湖北　武汉　430030）；杨敬（同济医科大学免疫学教研室，湖北　武汉　430030）；朱慧芬（同济医科大学免疫学教研室，湖北　武汉　430030）；张悦（同济医科大学免疫学教研室，湖北　武汉　430030）
关键词：人-鼠嵌合抗体；相对亲和力；增殖抑制效应
　　［摘　要］　目的　对已构建表达的抗CD4人-鼠嵌合抗体的生物学特性进行鉴定，比较嵌合抗体与鼠源性单抗对抗CD3　McAb和EBV转化细胞诱导的外周血单个核细胞（PBMC）增殖反应的影响，以探讨抗CD4抗体的增殖抑制作用机制。方法　采用间接免疫荧光竞争抑制实验比较两种抗体对CD4抗原的相对亲和力，MTT法检测抗CD4抗体的增殖抑制作用。结果　转染瘤细胞具有稳定表达及分泌特异性抗CD4人-鼠嵌合抗体的能力；两种抗体对CD4抗原的相对亲和力相同；对经TCR途径刺激诱导的PBMC增殖反应均有抑制作用，嵌合抗体的增殖抑制作用较鼠源性单抗强。结论　抗CD4抗体的抑制作用很大程度上直接作用于TCR诱导的活化信号。
　　［中图分类号］　R392.11　　　　 ［文献标识码］　A
　　［文章编号］（5-03
Identification of anti-CD4 chimeric antibody and detection of its effects on PBMC proliferation
ZHANG Zhi-hong，SHEN Guan-xin，YANG Jing，ZHU Hui-fen，ZHANG Yue
　　（Department of Immunology，Tongji Medical University，Wuhan 430030，China）
　　［Abstract］ Objective To explore the mechanism of the inhibitory effects of anti-CD4 antibody on the peripheral blood mononuclear cells （PBMC） proliferation，we identified the biological characteristic of the anti-CD4 human／murine chimeric antibody，and compared their effects of the chimeric antibody with murine McAb on PBMC proliferation induced by anti-CD3 McAb or EBV transformed cell．Methods Using indirect immunofluorescence competed inhibiting experiment to compare two kinds of anti-CD4 antibodies on relative affinity，and to detect the inhibitory effects of anti-CD4 antibody on PBMC proliferation with MTT test．Results Transfectoma has the ability to express and secrete specific anit-CD4 Human／murine chimeric antibody stably．Chimeric antibody has the same relative affinity as murine McAb．Both the anti-CD4 chimeric antibody and murine McAb could inhibit PBMC proliferation induced by TCR approach，and chimeric antibody has better inhibitory effects than murine McAb．Conclusion Most important inhibitory effects of the anti-CD4 antibody appeared to direct at TCR-induced activation signals．
　　［Key words］ Human／murine chimeric antibody； relative affinity； inhibitory effects on proliferation
　　CD4＋T细胞在免疫应答过程中起着重要作用［1］，抗CD4抗体可通过不同途径阻断CD4＋T细胞的功能，调控机体的免疫应答。抗CD4抗体在自身免疫性疾病治疗和抗移植排斥反应中具有极大的潜力［2，3］。目前国内抗CD4抗体均为鼠源性，用基因工程技术对鼠源性单抗进行改造，构建人-鼠嵌合抗体，既可保持鼠源性单抗的特异性，又降低了对人体的免疫原性。因此，将治疗性鼠源性单抗转变成人-鼠嵌合抗体具有很大的临床应用价值。为此我们对已构建表达的抗CD4人-鼠嵌合抗体的生物学特性进一步进行了鉴定，并比较嵌合抗体与鼠源性单抗对刺激原诱导的PBMC增殖抑制作用。
　　1　材料与方法
　　1.1　细胞株和细胞系　分泌鼠源性抗人CD4单克隆抗体（MCA3）及抗人CD3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，均从ATCC公司引进；分泌抗人CD4人-鼠嵌合抗体D4.9的转染瘤细胞株由本室构建［4］；EBV转化的B细胞由本教研室吴雄文副教授课题组制备；T细胞淋巴瘤细胞系（CEM），由德国埃尔兰根大学临床免疫研究所引进。
　　1.2　主要试剂　MTT为Sigma产品；丝裂霉素C为Kgowa　Hakko　Kogyo　Co，Ltd产品；FITC标记羊抗人IgG为上海生物制品研究所产品；鼠抗人κ链单克隆抗体为Sigma产品；羊抗人IgG、羊抗小鼠IgG、HRP标记羊抗小鼠IgG为华美公司产品。
　　1.3　腹水型抗体的制备及纯化［5］　采用辛酸提取法对两种腹水型抗CD4抗体进行纯化，用U-200型紫外分光光度仪分别测其OD260和OD280值，根据公试计算IgG浓度［6］：
　　IgG浓度（mg／ml）＝（1．45×OD280－0.74×OD260）×稀释倍数
　　1.4　抗CD4人-鼠嵌合抗体的鉴定　采用交叉夹心ELISA法鉴定转染瘤细胞分泌抗体的Ig类型；以PBMC或CEM细胞为靶细胞，采用间接免疫荧光法鉴定抗体的特异性。
　　1.5　相对亲和力的测定　用间接免疫荧光法，经流式细胞仪计数检测CEM细胞表达CD4抗原的阳性率，分别检测纯化的抗CD4嵌合抗体或鼠源性单抗与CEM细胞结合的饱和抗体浓度。用间接免疫荧光竞争抑制实验检测抗CD4嵌合抗体和鼠源性单抗对CD4抗原的相互竞争抑制作用。
　　1.6　PBMC增殖实验　取一个单位健康人除红细胞的抗凝血（200　ml），通过密度梯度离心常规分离获得PBMC。96孔细胞培养板中每孔加入100　μl　2×106　／ml　PBMC悬液，然后分别加入不同浓度的抗CD4嵌合抗体或鼠源性单抗（终浓度为0.1、1、10、100　μg／ml），均设3复孔，设加入非特异性人IgG作为阴性对照，振荡混合后，置4　°C孵育1　h，分别加入抗CD3 McAb（杂交瘤细胞培养上清液）或丝裂霉素C（终浓度为25 μg／ml）处理后的EBV转化的B淋巴细胞（1×106　／ml），置37　°C、5％　CO2培养箱中培养5 d。培养结束后每孔加10　μl　MTT（5　mg／ml），继续培养4　h后，2 000　r／min离心5　min，去上清，每孔加入100　μl DMSO，振荡5　min后，用酶标仪测570　nm的OD值，记录结果。根据公式计算各实验组抗CD4抗体的增殖抑制率：
　　1.7　数据处理　各组实验数据以均数±标准差（
　　2　结果
　　2.1　抗CD4嵌合抗体的特异性　ELISA试验表明，转染瘤细胞分泌的抗体能与抗人γ抗体和抗人κ轻链抗体反应，不与抗鼠γ抗体反应，从而证明此转染瘤细胞株分泌的抗体为含有人的γ恒定区和人κ轻链恒定区的抗体。采用间接免疫荧光法证明，转染瘤细胞分泌的抗体，与人PBMC反应的阳性率为35％～40％，与CEM细胞均呈阳性免疫荧光反应。其荧光强度与鼠源性CD4单抗相似，而与CD4抗原阴性的Raji细胞呈阴性反应。
　　2.2　抗体相对亲和力的测定　CEM细胞为CD4抗原表达阳性细胞，流式细胞仪检测证明阳性率为96.49％，纯化的抗CD4嵌合抗体和鼠源性抗CD4单抗与2×105　CEM细胞结合的饱和抗体浓度均为10　μg／ml。采用间接免疫荧光竞争抑制实验证明，当将抗CD4嵌合抗体以每毫升0、0.1、1、10和100　μg分别与2×105　CEM细胞作用后，鼠源性抗CD4单抗荧光染色细胞的荧光强度逐渐减弱，且荧光染色阳性细胞数也逐渐减少，分别为95.43％、89.93％、51.20％、17.87％、11.93％。当将鼠源性CD4单抗以每毫升0、0.1、1、10和100　μg分别与2×105　CEM细胞作用后，抗CD4人-鼠嵌合抗体荧光染色细胞的荧光强度逐渐减弱，且荧光染色阳性细胞数也逐渐减少，分别为96.49％、90.92％、49.98％、16.92％、6.54％。
　　2.3　抗CD4抗体的增殖抑制效应　抗CD4嵌合抗体或鼠源性单抗对抗CD3 McAb（见表1）或EBV转化的B细胞（见表2）诱导的PBMC增殖均有抑制作用。当抗CD4嵌合抗体浓度为0.1　μg／ml时对PBMC增殖已有抑制作用。当抗体浓度达10　μg／ml时，抑制作用明显增强。当继续增加抗体浓度时，未见抑制效应随着抗体浓度的增加而增强。表明当抗体浓度达10　μg／ml时即达最大抑制效应浓度。抗CD4嵌合抗体对几种刺激物诱导的增殖抑制作用明显强于鼠源性单抗。
表1　抗CD4嵌合抗体及鼠源性单抗对抗CD3 McAb诱导PBMC增殖反应的抑制作用
　　Tab　1　The　inhibitory　effects　of　the　anti-CD4　chimeric　antibody　and　murine　McAb　on　anti-CD3　induced　PBMC　proliferation
concentration　of
　　antibody（μg／ml）
chimeric　antibody
murine　McAb
10.5±7．3*
6．30±3．7
29．9±9．9*　*
10.3±6．7*
52．0±13．8*　*
30.5±8．7*　*
58．0±10.7*　*
32．1±9．8*　*
　　*P＜0.05，*　*P＜0.01，compared　with　control　group表2　　抗CD4嵌合抗体及鼠源性单抗对单向混合淋巴细胞反应的抑制作用
　　Tab　2　The　inhibitory　effects　of　the　anti-CD4　chimeric　antibody　and　murine　McAb　on　one-way　mixed　lymphocyte　reaction（MLR）
concentration　of
　　antibody（μg／ml）
chimeric　antibody
murine　McAb
23．0±15．6*　*
12．1±9．80*
48．4±13．2*　*
33．4±11．2*　*
65．5±14．3*　*
46．0±7．60*　*
66．4±12．6*　*
51．2±9．60*　*
　　*P＜0.05，*　*P＜0.01，compared　with　control　group3　讨论
　　通过基因工程技术，建立了稳定分泌抗CD4人-鼠嵌合抗体的转染瘤细胞［4］，且所保存的转染瘤细胞经多次冻存和复苏后仍具有稳定表达和分泌抗CD4人-鼠嵌合抗体的能力。相对亲和力测定结果表明，嵌合抗体能与鼠源性单抗竞争结合CD4分子。随着先加入嵌合抗体浓度的增加，能结合到CEM细胞表面的CD4嵌合抗体减少，故荧光阳性细胞亦随之减少。当固定检测抗体浓度，将竞争抗体稀释成不同浓度时，两种抗体不同稀释度的竞争抑制率基本相同。说明抗CD4　人-鼠嵌合抗体与鼠源性单抗对CD4抗原具有相同亲和力，且结合位点一致。在相对亲和力相同的情况下对嵌合抗体的生物学效应进行研究，为其在临床上的应用提供科学实验依据。
　　抗CD3 McAb是T细胞多克隆刺激剂［7］，在低浓度时能通过TCR途径刺激T细胞活化增殖。混合淋巴细胞培养实验通常使用同种PBMC或分离的T、B细胞作为刺激细胞，但这些细胞不易标准化。EBV转化的B细胞可高表达MHC-Ⅱ类分子和B7-1、B7-2［8］，因此具有较强的刺激效应T细胞增殖的能力，且易标准化，故本实验所用的同种细胞性抗原为EBV转化的B细胞。
　　抗CD3 McAb及同种异体细胞性抗原均是经TCR途径刺激诱导T细胞活化增殖的。本实验结果表明，抗CD4嵌合抗体和鼠源性单抗对由抗CD3　McAb及同种异体细胞性抗原诱导的PBMC增殖均有抑制作用，其增殖抑制效应是剂量依赖性的，在抗体浓度为10　μg／ml时达最大抑制效应。抗CD4抗体对IL-2诱导的PBMC增殖的抑制作用较弱［9］。提示，抗CD4抗体的抑制作用很大程度上直接作用于TCR诱导的活化信号，CD4分子的交联干扰了TCR刺激后组成的多功能传导复合体的形成。由于抗CD4抗体封闭了细胞表面CD4分子，使T细胞不能与MHC-Ⅱ类分子结合，从而使T细胞缺乏活化必需的信号而变成无能（anergy）［10］。抗CD4抗体对由IL-2诱导的增殖抑制作用较弱，而对由TCR途径刺激的PBMC增殖抑制作用较强，从而提示抗CD4抗体的抑制作用机制可能是：①阻断与MHC-Ⅱ类分子非多态区相互作用的位点；②从空间排列上阻止CD3和CD4的共聚集；③通过CD4分子介导T细胞传递阴性信号；④经CD4使P56lck募集到TCR复合物上，对于最有效的TCRζ链磷酸化和Zap70的活化很重要，Zap70的活化是导致T细胞增殖的关键环节，抗CD4抗体可能是通过阻止P56lck的募集使CD4与TCR复合体隔离开来，从而使T细胞不能被活化。
　　［基金项目］　国家自然科学基金资助项目（）
　　［作者简介］　张智红（1971－），女，湖北武汉市人，助理讲师，硕士，主要从事分子免疫学的研究，现在工作单位：华中理工大学生命科学与技术学院生物医学光子学研究所，武汉　430074。
［参考文献］
　　［1］ PANAVI GS，LANCHSTRY JS，KINOSKEY GH．The importance of the T cell in initiating and maintaining the chronic synovitis of rheumatoid arthritis［J］．Arthritis Rheum，）：729－735．
　　［2］ WALDMANN H．Manipulation of T Cell responses with monoclonal antibodies ［J］．Annu Rev Immunol，7－444．
　　［3］ QIN S，COBBOLD SP，PIPEH et al．Infectious transplantation tolerance ［J］．Science，（5 097）：974－977．
　　［4］ SHEN GX，ZHU ZG，ZHU HF，et al． Expression of anti-CD4 human／murine chimeric antibody and their killer tumor activity ［J］．J Tongji Med Univ，）：1－4．
　　［5］ 苏 娜，沈关心．抗体工程［M］．北京：科学出版社，．
　　［6］ 吴健民．临床化学自动化免疫分析［M］．北京：科学出版社，1999．15．
　　［7］ 黄志勇，吴在德，陈孝平，等.肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及抗CD3单抗对其增殖及细胞毒的影响［J］．中华实验外科杂志，）：8－10.
　　［8］ WILSON JL，CUNNINGHAM AC， et al． Alloantigen Presentation by B cells：analysis of the requirement for B-cell activation ［J］．Immunol，）：325－330．
　　［9］ SHEN GX，ZHU HF，WANG XI，et al．Anti-proliferative effects induced by anti-CD4 human／murine chimeric antibody and murine anti-CD4 monoclonal antibody ［J］．J Tongji Med Univ，）：6－9．
　　［10］ SCHWARTZ RH．A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy ［J］．Science，（4 961）：1 349－1 356．
［收稿日期］　；［修回日期］
日期：日 - 来自[]栏目
IL-12对狼疮肾炎PBMC中信号传递分子STAT3、STAT4的作用
中国免疫学杂志 2000年第4期第16卷 临床免疫学
作者：李清刚　李幼姬　李志坚　叶任高　许韩师
单位：李清刚（中山医科大学附属第一医 院肾脏病研究所，广州 510080）；李幼姬（中山医科大学附属第一医 院肾脏病研究所，广州 510080）；李志坚（中山医科大学附属第一医 院肾脏病研究所，广州 510080）
关键词：信号传递；狼疮肾炎；白细胞介素-12；外周血单个核细胞
　　摘　要　目的：为了探讨IL-12对狼疮肾炎PBMC发挥生物学作用的细 胞 内信号传递机制。方法：采用MTT、免疫沉淀、免疫印迹等方法，检测I L-12对PBMC增殖及STAT3、STAT4的作用 ，并比较在狼疮肾炎活动期、静止期的差别。结果：发现与正常人对照 及静止期相比，IL-12对活动期PBMC不需要IL-2的预诱导，可促进PBMC增殖并在短时间内 激活 STAT3、STAT4，而IL-2对STAT4无作用。结论：表明IL-12对PB M C的作用可通过STAT3、STAT4途径发挥，活动期PBMC存在异常活化，这可能是IL-12促 进狼疮肾炎PBMC参与发病的细胞内机制之一。
　　中国图书分类号　R392.12
Effects of IL-12 on signal transduction molecules STAT3 and STAT4 in PBMC i n lupus nephritis
LI Qing-Gang　LI You-Ji　LI Zhi-Jian
　　（Department of Nephrology and Ins titute of Nephrology, The First Affiliated Hospital, San Yat-Sen University of Medica l Sciences, Guangzhou 510080）
　　Abstract　Objective：To investigate the mechanism of signa l transduction of IL-12 on periph eral blood mononuclear cell (PBMC) in lupus nephritis (LN).Methods：The authors measured proliferation of PBMC by MTT. STAT3 and STAT4 were detected by immunoprecipa tion and Western Blot Technique. Results:In contrast to norma l group and the static stage of LN, IL-12 alone stimulated DNA synthesis and activated STAT3 and ST AT4 in absence of IL-2 in short time in PBMC in the active stage of LN, wherease I L-2 had no effect on STAT4 but STAT3.Conclusion：The e ffe ct of IL-12 in PBMC may be mediated through the activation of STAT3 and STAT4, PBMC may have been abbe rant ly activated in the active stage of LN, which may be a mechanism of IL-12 to ta ke part in the pathogenesis of LN.
　　Key words　Signal transduction　Lupus nephritis　Interl eukin-12　PBMC
　　狼疮肾炎外周血单个核淋巴细胞(PBMC)的异常增生、分化，产生多种活性物质、分泌过多自 身抗体是其致病的重要环节。最近国外报道，IL-12可对正常人B、T淋巴细胞在IL-2、SA 等诱导作用下发挥重要作用［1，2］。然而，对狼疮肾炎PBMC异常生物学行为的细胞 内信号传递 机制至今未见报道。信号的转录子和活化子(signal transducers and activators of tran scription, STAT)中STAT3、STAT4是IL-12的信号传递途径［3］，故在 本研究中，我们对IL-2 诱导或未诱导的正常人、LN活动期、静止期是否发生异常活化进行测定，试图对IL-12在狼 疮肾炎PBMC中作用的细胞内信号传递机制进行探讨，以期深化对LN发病过程中IL-12作用机 制的认识。
　　1　材料与方法
　　1.1　试剂　IL-12购自Pepro Tech公司，IL-2、PHA购自北京中山生物 技术公司。STAT3、STAT4及其他蛋白测定试剂均购自Santa Cruz公司。MTT、蛋白酶抑制剂均购自Sigma公司，电泳分子量标准 品购自New England公司，化学发光试剂购自北京医科大学引航医学生物技术研究所。
　　1.2　方法
　　1.2.1　PBMC分离培养　选取LN活动期、静止期患者各10例、正常人对照5 例 ，按常规方法抽取10 ml静脉血，肝素抗凝分离PBMC作培养，0.2%台盼蓝计数存活＞95%。
　　1.2.2　 细胞因子对PBMC的刺激　在STAT3、STAT4测定实验中，对LN 活动期、静止期、正常对照组PBMC分别给予0，100 U/ml IL-2预诱导24 h。然后分组 给 予10　ng/ml IL-12于37℃刺激30 min。另一组给未用IL-2预诱导的LN活动期PBMC以2，5 ，10 ng /ml IL-2刺激5，15，30，60，120 min。
　　1.2.3　 STAT3、STAT4的测定　将培养的细胞，用含蛋白酶抑制剂的 RIPA细胞裂解液(1×PBS，10%NP40，0.5%脱氧胆酸钠，1 μg/ml PMSF，30 μl/ml抑 肽酶，0.1 mmol/L钒酸钠)裂解2 h，离心，将上清液测定蛋白含量。然后用抗STAT3、抗S TAT4(抗C-末端)免疫沉淀，过夜，最后离心提取蛋白沉淀经100℃ 2 min变性，贮存于-2 0℃冰箱备用。经SDS-PAGE电泳、转膜，用化学发光方法检测磷酸化信号 传递蛋白，可在92,94 kD处各出现一条带。然后将膜置于洗膜中60℃，洗膜30 min，再 利用抗STAT3、STAT4(N-末端)对膜进行孵育。每组实验重复3次。
　　1.2.4　 PBMC增殖测定　采用MTT法检测PBMC增殖，按上述分LN活动期、 静止期及正常对照分组分别加入IL-2(100 U/ml)，IL-12(10 ng/ml)，IL-2(100 U/ml)+I L-12(10 ng/ml)刺激4 d，同时设阴性空白对照，加入MTT培养4 h后，用20%SDS，50%二甲 基酰胺 ，pH5.0溶解液终止反应，在2400酶标仪测570～630 nm吸光光度值，以空白对照为标准， 评价各组的PBMC增殖。
　　1.2.5　统计学方法　结果以
　　2　结果
　　2.1　PBMC增殖　正常人对照，狼疮肾炎PBMC对IL-2都有反应，而IL- 12 只对LN活动期增殖反应显著，IL-2+IL-12对三者皆有明显促增殖作用，尤以活动期显著( 图1)。
图1　IL-12、IL-2、IL-12+IL-2对LN、正常对照PBMC增殖
　　Fig.1　IL-12,IL-2 and IL-12+IL-2 stimulated PBMC
　　proliferation in LN and normal group
　　2.2　PBMC的STAT3，STAT4酪氨酸磷酸化　于0～120 min单独用IL - 12(5～10 ng/ml)刺激活动期PBMC的结果见图2。单独用IL-12可使LN活动期STAT3、STAT4 在30 min时合成最强，并且以10 ng/ml浓度刺激的带型最强，120 min后带型消失，从图3 看出单独IL-12对静止期相对作用较弱，正常人无作用。联合应用IL-2+IL-12，正常对 照、LN活动期、静止期在30 min仍最强。
图2　不同浓度的IL-12刺激LN活动期PBMC中STAT4 、STAT3的酪氨酸磷酸化
　　Fig.2　Different concentration of IL-12 induces tyrosine
　　phosphorylatio n of STAT4 and STAT3 in PBMC in the active stage of LN
图3　IL-2、IL-12、IL-2+IL-12对LN、正常对照PBMC刺激30min
　　诱导STAT4和STAT3酪氨酸磷酸化
　　Fig.3　IL-2, IL-12 and IL-2+IL-12 induce tyrosine phosphorylation
　　of S TAT4 and STAT3 in PBMC in LN and normal control for 30 min
　　3　讨论
　　IL-12主要是由T、B淋巴细胞和单核-巨噬细胞产生的，具有多种炎症作用，包括促进IFN -γ的产生，抑制IL-10、IL-11等的合成［4，5］，其对Th前体细胞向Th1分化不 可缺少 ，通过调节Th1/Th2平衡，发挥免疫调节作用［6］，此外，有报道IL-12 对SA、IL-2诱导的正常T、B淋巴细胞有促增殖、分化作用［1，2］。然而，尽管IL -12在体外对正常T、B等淋巴细胞的免疫炎症过程的重要作用已有些研究，但在狼疮患者IL -12作用的内在机制尚未有报道。
　　我们在实验中发现，单独IL-12对正常人PBMC无增殖作用，而与IL-2可共同刺激增殖，这 提示其生物学作用需IL-2诱导才能发挥。Gately等认为：在低浓度IL-2诱 导下，介导促进IL-2受体表达，导致IL-12诱导PBMC等亚群的增殖，另外，IL-12还可通 过诱导细胞因子如INF-γ、IL-2等的释放，促进静止PBMC对IL-2反应［6］。而L N患者PBMC，尤其是活动期，可能由 于PBMC已经在体内被多种炎症因子预刺激促进了IL-12R受体表达，或其本身存在异常，故 可直接对IL-12发生增殖反应。
　　许多的研究证实，在正常细胞，IL-12发挥生物学作用可通过STAT3，STAT4途径实现 ，并且STAT4只有IL-12才能激活［3］。IL-12与受体结合，后者二聚体化， 促使JAK激酶活化酪氨酸激 酶，导致受体发生酪氨酸磷酸化；再通过JAK活化STAT3、STAT4，使后者与受体解离， 转位到核内，结合于特异基因的启动子序列上［7，8］，促进基因表达，发挥生 物学作用。
　　在本研究中，单独应用IL-12只对LN活动期STAT3、STAT4磷酸化最显著，并在30min时，带型最强，静止期很弱，这表明，LN活动期PBMC上的IL-12受体可能已被多种炎症因子刺激表达，或处于异常状态，IL-12可直接促使STAT3、STAT4活化静止期PBMC处于稳 定 状态，对IL-12反应弱。而正常对照需在IL-2协同刺激下，才能活化STAT3、 STAT4 ，提 示IL-2可能诱导了IL-12R的表达后，IL-12才能激活信号传递分子STAT3, STAT4。 单独I L-2刺激有STAT3带，而无STAT4带，单独IL-12刺激STAT3，带型较弱，协同刺激ST AT3带型明显增强，这一方面说 明IL-2亦能促进STAT3活化，另一方面说明IL-12除STAT3外主要是通过STAT4发挥 作用，这与Cheng-Rong Yu［9］等的报道相一致。
　　我们发现STAT3，STAT4在活动期PBMC受IL-12刺激5 min时，即可出现磷酸化，30 min 时 最强，在120 min后消失，这说明STAT3、STAT4的磷酸化是一个短暂过程，但磷酸化的STAT转位到某些基因启动子序列上就促其特异基因转录，国外最近有报道，STAT4的一结合 位点(T/A)TTCC(C/G)GGAA(T/A)，与INF-γ的GAS位点极相似，IL-12能直接促进PBMC产生I FN-γ，就是通过STAT4结合到IFN-γ的位点上发挥的［10］。
　　最近，亦有报道，JAK-STAT途径与ras-MAPK（细胞分裂原活化蛋白酶）有联系。Stancat o等证明MAPK能使STAT3的Ser727磷酸化而激活，JAK还能激活其它的分子(Grb 2、Raf-1、PI-(3)K的P85亚基)［11］；Livio Azzoni等学者发现IL-12 可促进C-myc的基因表达，而C-myc是MAPK作用的下游分子［12］，可见，IL-12除通过JAK-STAT发 挥作用外，尚有可能通过其他的途径。因此，对其信号传递途径的研究有待进一步深入，IL -12可通过异常的信号传递途径参与LN的发生。
　　本课题为卫生部科研基金资助项目(编号15)
　　作者简介：李清刚，男，29岁，博士，主要研究狼疮肾炎的发病机制；
　　李幼姬，女，64岁，博士导师，教授，主要从事狼疮肾炎的发病机制及细胞因子研究
　　叶任高（中山医科大学附属第一医 院肾脏病研究所，广州 510080）
　　许韩师（中山医科大学附属第一医 院肾脏病研究所，广州 510080）
　　4　参考文献
　　1，Daiane F, Julie K. Role of IL-12 in human B lymphocyte proliferati on and differentiation. J Immunol, 06
　　2，Hsich C S, Macatonia C S, Tripp S F et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeica-induced macrophages. Scienc e, 7
　　3，Jacobson N G, Szabo S J, Weber Wordt R M et al. Interlukin 12 signaling i n T hel per type1 (Th1) cells involves tyrosine phosphorylation of signal transducer and activator of transcription STAT3 and STAT4. J Exp Med,55
　　4，Aste Aniezaga M, Max, Sartorl A et al. Molecular mechanisms of the induct ion of IL-12 and its inhibition by IL-10. J Immunol, ):5936
　　5，Marshallo J D, Rebertson S E, Trinchieri G et al. Priming with IL-4 and IL-13 d uring HIV-1 infection restores in vitro IL-12 production by mononulear cells of HIV-infected patients. J Immunol, ):5705
　　6，Nakajima A, Hirose S, Yagita H et al. Roles of IL-4 and IL-12 in the d evelopment of lupus in NZB/W F mice. J Immunol, ):1466
　　7，James E, Darnell Jr. STATs and gene regulation. Science, 30
　　8，Xiang Xu, Ya Lin Sun, Timothy Hoey. Cooperatine DNA binding and sequence set ec tine recognition conferind by the STAT amino-termal domain. Science, 1996； 273:794
　　9，Yu C R,Lin J X, Donald W et al. Differential utilization o f Janus Kinase-signal transducer and activator of transcription signaling pathways in t he stimulation of human natural killer cells by IL-2, IL-12, and IFN-γ. J I mmunol, 6
　　10，Koh Yamamoto, Osamw Miura, Shinsaka Hirosawa et al. Binding sequ ence of STAT 4: STAT4 complex recognizes the IFN-γ activation site (GAS)-like sequence (T/A) TTCC(C/G) GGAA(T/A). Biochem Hioph Res Com，
　　11，Stancato I F, Yu C R, Petvico in E F et al. Activation of Rat-1 by int eferon gamma and oncostatin M requires expression of the STAT transcription factor. J Bio l Chem， 1998； 273(30):18701
　　12，Livio Azzoni, Palanisamy Kanakaraj, Olga Zatsepina et al. IL-12 induce d acti vation of NK and T cells occurs in the absence of immediate early activation gen e expression. J Immunol, 5
［收稿，二次修回］
日期：日 - 来自[]栏目【 摘要 】　目的　了解皮质激素对哮喘患者TH1/TH2功能失衡的调节作用，探讨其治疗哮喘的机制。方法　将临床30例哮喘患儿随机分为甲基强的松龙(MP)治疗组和对照组，用ELISA法测外周血单个核细胞(PBMC)细胞因子及血清IgE水平，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定细胞因子mRNA表达。结果　MP组临床症状和体征消失时间明显缩短；MP对T辅助细胞(TH)源性细胞因子和血清IgE均有抑制作用，但对IL-4、IL-10的抑制作用强于对IFN-γ、IL-2的抑制作用；MP抑制IL-4 mRNA表达程度强于对IFN-γ表达抑制。结论　皮质激素可能部分通过调节哮喘患者TH亚群分泌细胞因子而在治疗中起作用。
Methylprednisolone regulates the dysfunctional TH subsets observed in children with asthma
FU Zhou, YANG Xiqiang, LI Chengrong, et al.
　　(Children′s Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400014, P.R.China)
　　【 Abstract 】　Objective　In order to observe the clinical effects of a new type of glucocorticoids-methylprednisolone (MP) in the treatment of asthma, and explore the mechanism of MP in the treatment of this disease.Methods　30 asthmatic children were divided into two groups, one as MP-treated group, and the other as control group. All blood samples were collected before and after treatment with MP. The serum IgE, cytokine production in the cultured supernatants of PBMC, and the cytokine mRNA expression were determined by ELISA and RT-PCR methods respectively.Results　(1) There were obvious clinical effects observed in the MP-treated patients compar (2) MP inhibited both TH1-and TH2- (3) MP inhibited both IFN-γ and IL-4 mRNA expression.Conclusion　The anti-inflammatory action of MP in asthma may be associated with its immunomodulatory function, which influences the production of TH1-and TH2-type cytokines and blocks the cascade of inflammation.
　　【 Subject words 】　A C I G Immunoglobulin E
　　T辅助细胞亚群功能失衡在哮喘发病机理中起重要作用。免疫调节治疗哮喘愈来愈受重视。作为免疫调节剂的皮质激素已广泛用于哮喘防治中，并认为是迄今为止最有效的药物〔1〕。为探讨皮质激素在哮喘治疗中的免疫调节机制，我们系统观察了甲基强的松龙(MP)对哮喘发生中细胞因子网络的作用，现报告如下。
　　对象与方法
　　研究对象：30例哮喘发作期住院患儿，均符合婴幼儿哮喘诊断标准〔2〕，随机分为2组，MP治疗组15例，年龄9个月～3岁，平均2.1岁。对照组15例，年龄11个月～2.9岁，平均2岁。2组患儿病情轻重及院外病程无明显差异，均未曾用过皮质激素。两组治疗前和治疗后4 d采血，即刻分离外周血单个核细胞(PBMC)。
　　方法和临床观察：对照组用抗感染和β2受体兴奋剂(0.5%沙丁氨醇溶液0.25ml加生理盐水至2ml)氧气雾化治疗；治疗组在此基础上每天加用MP 3mg/kg，用5%葡萄糖水20ml稀释后静脉滴注，每天2次，共4 d。观察治疗后咳嗽、喘息、肺部哮喘鸣音消退时间。
　　细胞培养及细胞因子检测：清晨静脉采血3ml，1ml血清测IgE，2ml肝素抗凝，常规分离PBMC，用含10%小牛血清的RPMI 1640调细胞浓度至106/ml，设自身对照组、植物血凝素组(PHA 100μg/ml)，在37℃ 5%CO2温箱中培养12 h，用于提取总RNA；培养48 h收上清液，于-20℃备测。采用ELISA法测细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10及IgE，操作步骤按说明书进行。IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10检测试剂盒由深圳晶美生物工程有限公司提供；IgE试剂盒由上海医科大学华山医院提供。
表2　实验组和对照组患儿治疗前后细胞因子及IgE水平比较(
　　Table 2. The comparison of cytokine levels of PHA-stimulated PBMC in patients pre-and post-treated with MP(
Pre-treated
918.7±342.3
767.2±245.6
118.3±57.2
88.2±44.1
806.4±334.6
Post-treated
948.7±358.2
811.6±274.9
116.6±53.8
86.5±40.3
782.5±327.2
MP-treated
Pre-treated
968.4±367.4
845.5±298.2
136.9±64.7
96.7±48.6
816.4±347.3
Post-treated
708.6±283.6
616.3±226.6
　80.6±43.9
58.3±32.5
421.7±165.6
　　逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)：采用改良异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法〔3〕，用试剂盒(Gibco, USA)提取培养细胞总RNA。参照文献〔4〕分别测定IFN-γ和IL-4 mRNA逆转录后的扩增产物量。产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在紫外光下观察并照相。
　　统计学方法：实验结果以±s表示，组间比较用t检验，组内治疗前后比较用配对t检验。
　　1.临床疗效观察：MP组咳嗽、喘息、肺部哮鸣音消退及住院时间较对照组明显缩短，见表1。
表1　实验组和对照组患儿治疗后症状、体征消失及住院时间比较(
　　Table 1. The comparison of remission time of clinical symptom of patients with asthma after treatment(
Hospitalized
MP-treated
　　2.治疗前后血清IgE及细胞因子水平：(1) 组内比较：MP组用药后血清IgE及TH产生IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平均下降，但IL-4和IL-10下降程度更大，见表2。
　　以细胞因子(治疗前浓度-治疗后浓度)/(治疗前浓度)×100%作为激素对某些细胞因子的抑制率，则MP对IL-4、IL-10的抑制率分别为41%、37%，对IFN-γ、IL-2的抑制率分别为27%、29%，即MP对前两者的抑制程度明显大于对后两者的抑制程度(P＜0.05)。(2) 组间比较：治疗前两组血清IgE及各细胞因子水平差异无显著性(P＞0.05)。治疗后，MP组血清IgE、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平均显著低于对照组(P＜0.05)，见表2。
　　3.MP治疗前后对细胞因子的抑制作用：对IFN-γ、IL-4 mRNA表达均有一定抑制作用，但对IL-4 mRNA表达的抑制更明显(图1、图2)。
　　图1　PHA刺激PBMC后IFN-γ mRNA表达(RT-PCR)
　　Fig 1. IFN-γ mRNA expression of PBMC stimulated with PHA(RT-PCR)
　　Lane 1: self- line 2: PHA lane 3: standard ΦX174HaeⅢ
　　图2　PHA刺激PBMC后IL-4 mRNA表达(RT-PCR)
　　Fig 2. IL-4 mRNA expression of PBMC stimulated with PHA(RT-PCR)
　　Lane 1,2,3 as Fig. 1
　　皮质激素治疗哮喘，不论是全身给药或局部吸入，其效果都非常显著。根据哮喘患儿体内存在的TH1类细胞因子(IFN-γ、IL-2)水平低下、TH2类细胞因子(IL-4、IL-10)增多，推测皮质激素的治疗作用可能包括抑制与哮喘有关的细胞因子基因转录和蛋白合成〔5，6〕。Bently等〔7〕用强的松龙治疗哮喘病人，2周后发现支气管肺泡灌洗液(BALF)中表达IL-4、IL-5 mRNA的细胞数下降，而表达IFN-γ mRNA的细胞数增多，同时BALF中嗜酸性粒细胞数减少，临床症状及肺功能明显改善。但也有学者报道地塞米松体外可促进大鼠TH2类细胞因子产生〔8〕。我们从基因转录和蛋白合成两水平观察MP对TH分泌细胞因子的影响，以阐明皮质激素在调节哮喘TH1/TH2细胞功能失衡中的作用。
　　哮喘治疗组静脉用药后，MP在基因转录和蛋白合成两水平对TH1类因子IFN-γ、IL-2和TH2类因子IL-4、IL-10均产生抑制作用，但对TH2类因子的抑制作用比对TH1类因子强，即IL-4、IL-10下降幅度比IFN-γ和IL-2下降更明显，故使TH1/TH2失衡得到部分恢复。MP治疗后患儿血清IgE浓度显著下降，与临床所见皮质激素抑制Ⅰ型变态反应结果一致。其机制可能与MP抑制IL-4产生有关，IL-4对B细胞生成IgE的促进作用减弱，故血清IgE水平降低。
　　临床观察发现，MP能迅速改善哮喘患儿的症状和体征，缩短住院天数。因此对发作期患儿应早期应用，以迅速缓解病情。
　　本文从MP对TH源性部分细胞因子的影响，探讨了皮质激素在哮喘治疗中的作用机理。由于哮喘发病机理复杂，参与的炎症细胞和因子种类众多，因此皮质激素的治疗作用可能还表现在其他方面。进一步研究激素对哮喘等变态反应性疾病的作用机理，对开发新药防治哮喘将有积极的促进作用。
　　基金项目：阿斯特拉儿童哮喘研究基金资助项目
　　参考文献
　　1，Barnes PJ. Immunomodulation as asthma therapy: where do we stand Eur Respir J, 1996, 9(suppl 22):154s-159s.
　　2，全国儿科哮喘协作组. 儿童哮喘诊断标准和治疗常规. 中华儿科杂志， 1993， 31：222-224.
　　3，Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium tiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 6-164.
　　4，Sandhya LD, Lagoo AS. A standardized approach to PCR-based semiquantitation of multiple cytokine gene transcripts from small cell samples. Lymphokine Cytokine Research, -65.
　　5，Barnes PJ, Adcock IM, Anti-inflammatory actions of steroids: molecular mechanisms. Trends Pharmacol Sci, -441.
　　6，Paliogianni F, Raptis A, Ahuja SS, et al. Negative transcriptional regulation of human interleukin-2(IL-2) gene by glucocorticoids through interference with nuclear transcription factor AP-1 and NF-AT. J Clin Invest, ): .
　　7，Bently AM, Hamid Q, Robinson DS, et al. Prednisolone treatment in asthma: reduction in the numbers of eosinophils, T cells, tryptase-only positive mast cells, and modulation of IL-4, IL-5, and interferon-gamma cytokine gene expression within the bronchial mucosa. Am J Rcspir Crit Med, :S51-S56.
　　8，Ramirez F, Fowell DJ, Puklavec M, et al. Glucocorticoids promote a TH2 cytokine response by CD4+ T cells in vitro. J Immunol, ):.日期：日 - 来自[]栏目
急性期过敏性紫癜PBMC凋亡及其相关因素研究
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第5期第20卷 临床免疫学
作者：李秋　杨锡强　刘恩梅　李欣　李永柏　王莉佳　张远维
单位：400014，重庆医科大学附属儿童医院
关键词：过敏性紫癜；细胞凋亡；Bcl-2；CD40L
　　【 摘要 】　目的　了解急性期过敏性紫癜（HSP）患儿是否存在淋巴细胞延迟凋亡及Bcl-2和CD40L对它们的影响。 方法　分别用琼脂糖凝胶电泳及流式细胞技术（FACS）分析经CD3单克隆抗体刺激培养的外周血单个核细胞（PBMC）产生的凋亡片段DNA及凋亡细胞计数；FACS检测PBMC Bcl-2的产生及CD40L表达。 结果　与正常儿童比较，急性期HSP患儿的PBMC出现延迟凋亡现象，Bcl-2产生及CD40L表达增高，且Anti-CD40L能明显纠正延迟凋亡。 结论　HSP患儿的淋巴细胞及单核细胞存在延迟凋亡，可能与Bcl-2的异常产生及CD40L过度表达有关，推测可能为HSP的发病机制之一。
Lymphocytes apoptosis and the related factors of Henoch-Schinlein's purpura in acute phase
LI Qiu, YANG Xiqiang, LIU Enmei, et al.
　　（Children's Hospital, Chongqing University of Medical Science, Chongqing 400014, P.R.China）
　　【 Abstract 】　Objective　To observe whether lymphocytes apoptosis delays in children with Henoch-Schinlein's purpura (HSP) in the acute phase and investigate the effects of Bcl-2 and CD40L on it. Methods　DNA fragmentation and apoptosis cell count of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) stimulated with anti-CD3 McAb were detected by both agarose gel electrophoresis and flow cytometry. Analyses of Bcl-2 production and CD40L expression on PBMC were also conducted by flow cytometry. Results　The results showed the apoptosis delay and significant increases of Bcl-2 production and CD40L expression of PBMC. This apoptosis delay condition of PBMC could be corrected when anti-CD40L McAb was added in vitro. Conclusions　CD40L and Bcl-2 might involve in regulating apoptosis of PBMC of the patients. High expression of CD40L and Bcl-2 might result in delayed apoptosis of lymphcytes, which might play a very important role in setup of HSP.
　　【 Subject words 】　Henoch-Schinlein' A Bcl-2; CD40L
　　细胞凋亡(apoptosis)是多细胞生物体正常的细胞生理死亡过程，赖以维持自身的稳定，细胞凋亡不足或过剩均可以导致疾病。已知川崎病存在急性期外周血单个核细胞（PBMC）延迟凋亡现象，且随病情缓解PBMC凋亡恢复正常水平。也有关于系统性红斑狼疮伴淋巴细胞凋亡减少的报告〔1-3〕。本研究企图通过对过敏性紫癜（HSP）患儿外周血单个核细胞的研究，证实HSP也存在的淋巴细胞凋亡异常及其相关调控因素。
　　研究对象及方法
　　病例选择
　　1.HSP组：HSP急性期32例，均为本院住院患儿，男17例、女15例，平均年龄7.5岁。
　　2.对照组：本院门诊体检的健康同龄儿童30例作为正常对照，男14例，女16例，平均年龄6.7岁。
　　实验方法
　　1.细胞培养：采血（肝素抗凝）后，立即用淋巴细胞分离液分离PBMC，含10%小牛血清的RPMI 1640（GIBCO）调细胞浓度为106/ml。分设以下各管：①留1ml备检Bcl-2；②加CD3单克隆抗体（Anti-CD3，北京邦定公司，终浓度5μg/ml）；③加Anti-CD3及Anti-CD40L（Pharmingen，终浓度5μg/ml）。从②③管各取1ml加入24孔培养板中，置37℃、5%CO2孵箱培养0、24、48及72h，备检片段DNA。
　　另取106细胞加佛波醇（PMA，Sigma，终浓度10ng/ml）及钙离子载体蛋白（A23187，Sigma，终浓度2μg/ml）37℃、5%CO2孵箱培养6h，备检CD40L。
　　2.片段DNA分析：酚、氯仿抽提及电泳法根据刘氏改良〔4〕的方法，按实验设计的时间收集细胞，经PBS洗涤后，加0.5ml低渗缓冲液，10000r/min 10min离心，取上清加等体积酚、氯仿、异戊醇抽提蛋白质。上清中加1/20体积乙酸钠，2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀过夜并离心弃上清。用70%乙醇洗涤、干燥，将片段DNA溶于EDTA*Tris液中，加RNA酶20μg/ml，37℃水浴30min以降解RNA。加3μl溴酚蓝混匀，1%琼脂糖凝胶电泳，100V，1h，紫外灯下观察结果并照相。
　　3.凋亡细胞计数：按实验设计的时间收集细胞，PBS洗涤2次，用碘化丙啶(PI)染色30min后，流式细胞仪(FACS, Calibur BD公司)检测。采用DNA分析软件ModFit LT-Unititled 2.0版定量分析30000细胞中凋亡细胞百分率。
　　4.FACS检测Bcl-2表达：根据Yano等〔5〕提供的细胞内蛋白质检测方法改良。将新鲜分离的PBMC用PBS洗涤1次，0.25%多聚甲醛固定15min，洗涤缓冲液(含PBS/0.2%牛血清白蛋白/0.1%叠氮钠)洗涤1次；加70%甲醇1ml，4℃，1h；洗涤2次，加鼠抗人Bcl-2单抗（北京华美，终浓度5μg/ml），0～4℃，1h；洗涤2次，加羊抗鼠IgG1-FITC(1∶50)40μl（北京华美），4℃，30min，将细胞重悬于400μl PBS，FACS检测15000个细胞中Bcl-2阳性细胞率，以未加荧光抗体及Bcl-2单抗为空白对照。
　　5.FACS检测CD40L表达：将培养的PBMC用PBS洗涤2次，加鼠抗人CD40L-PE单抗(Pharmingen，浓度20μl/106细胞)染色(直接染色法)，阴性对照用鼠抗人IgG1-PE，4℃，30min，将细胞重悬于400μl PBS，FACS检测15000个细胞中CD40L阳性细胞率。
　　1.凋亡细胞片段DNA分析：片段DNA电泳结果（图1）可见正常对照组的PBMC在Anti-CD3刺激下，24h已有少许片段DNA出现，48h尤为明显；而HSP患儿的PBMC在48h开始出现片段DNA，当加入Anti-CD40L后，HSP的片段DNA增加，与正常对照组接近。
　　2.流式细胞仪（FACS）计数凋亡细胞：见表1。
　　3.流式细胞仪检测Bcl-2及CD40L：结果见表2、图2、图3。
　　图1　过敏性紫癜PBMC片段DNA电泳图
　　Fig 1. DNA ladder of PBMC from children in the HSP by 1% agarose gel electrophoresis in various culture conditions and times
　　Lane 1: Marker(EcoRⅠ/Hind Ⅲ); Lane 2，6: CD40L McAb were added in PBMC from HSP patient cultured for 24h and 48h; Lane 3，7: PBMC from normal subject cultured for 24h and 48h; Lane 4,5,8: PBMC from HSP patient cultured for 24, 0 and 48h
　　表1　HSP患儿PBMC凋亡百分率（
　　Table 1. Percentage of apoptosis positive cell of PBMC from HSP patients and controls（
Controls(1)
14.71±4.96（8）
26.23±12.05(7)
32.79±11.69(7)
3.13±3.21（9）
12.26±　7.33(9)
17.15±　4.26(8)
HSP+CD40L McAb(3)
12.57±8.48(6)
18.98±11.62(6)
4.667/＜0.001
2.685/＜0.05
2.79/＜0.015
2.451/＜0.05
1.161/＞0.05
0.471/＞0.05
0.89/＞0.05
　　*:(1) Compared with (2); **: (2) Compared with (3); ***: (1) Compared with (3)表2　急性期HSP患儿PBMC中Bcl-2和CD40L阳性细胞率（
　　Table 2. Percentage of Bcl-2 and CD40L positive cells of PBMC from HSP patients and controls（
27.96±17.92(11)
0.54±0.58(11)
59.15±13.75(11)
8.26±4.15(13)
　　讨论　　淋巴细胞凋亡是免疫系统维持自身免疫耐受的重要机制。在免疫反应过程中，淋巴细胞增殖、分化、清除外来抗原的同时，免疫系统也通过凋亡机理清除过多的和具有潜在自身免疫反应的淋巴细胞，以维持其数量和功能的平衡，凋亡过甚或不足均可产生疾病〔1〕。凋亡过多可导致免疫缺陷病。本室曾证实新生儿T淋巴细胞暂时性功能低下与淋巴细胞凋亡过甚有关〔4〕。当凋亡减少，淋巴细胞过度生长，免疫反应过度则会发生淋巴细胞增殖性疾病、恶性淋巴瘤及自身免疫性疾病等。已有资料表明，自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮（SLE）、川崎病就存在有淋巴细胞延迟凋亡现象〔2，3，6〕。我们采用CD3单抗诱导HSP急性期患儿PBMC中淋巴细胞凋亡的研究，发现HSP患儿急性期有明显淋巴细胞延迟凋亡。
　　图2　HSP患儿PBMC表达CD40L的FACS图
　　Fig 2. Expression of CD40L by PBMC from HSP patients were assayed by flow cytometry
　　CD40L are shown by a continuous line,and relevant isotype controls are shown by a dotted line
　　A: CD40L was expressed by (8.26±4.15)% in the PBMC of the HSP patients
　　B: Normal controls expressed (0.54±0.58)%
　　图3　HSP患儿PBMC表达Bcl-2的FACS图
　　Fig 3. Expression of Bcl-2 by PBMC from HSP patients were assayed by flow cytometry
　　Bcl-2 are shown by a continuous line, and relevant isotype controls are shown by a dotted line
　　A: Bcl-2 was expressed by (59.15±13.75)% in the PBMC of the HSP patients
　　B: Normal controls expressed (27.96 ±17.92)%
　　细胞凋亡与增殖、分化一样，受细胞内外多种因素的正常调节，包括抗原因素，细胞表面分子如CD40-CD40配体（CD40L）、Fas-FasL和细胞因子如IL-2、IL-4、肿瘤坏死因子（TNF）等协同刺激因子及凋亡基因（如p53）和抗凋亡基因（如bcl-2家族）〔7-9〕。本研究发现HSP急性期PBMC的Bcl-2表达增强，提示HSP的淋巴细胞凋亡可能为Bcl-2依赖途径，其延迟凋亡可能与Bcl-2过度产生有关。
　　CD40L主要表达于活化的CD4+T细胞膜上，通过与B淋巴细胞及单核细胞膜CD40交联，可以分别活化T、B淋巴细胞及单核细胞并拮抗其凋亡〔10，11〕。本组HSP患儿淋巴细胞延迟凋亡的同时伴有淋巴细胞CD40L表达增高，体外实验Anti-CD40L有明显逆转淋巴细胞延迟凋亡的作用。
　　上述现象可能与免疫反应细胞过度活化。免疫反应物质异常增多，导致HSP的全身性血管炎密切相关。而CD40L与Bcl-2及淋巴细胞延迟凋亡之间的关系尚待进一步研究。
　　1，Boise LH, Thompson CB. Hierarchical control of lymphocyte survival. Science, -68.
　　2，Takahashi T, Tanaka M, Braunan CI, et al. Generalized lymphoprolifrerative disease in mice, caused by a point mutation in the Fas ligand. Cell, -975.
　　3，易岂健，李成荣，杨锡强，等. 静脉注射丙种球蛋白对急性期川崎病患儿淋巴细胞凋亡的影响. 中华儿科杂志，-648.
　　4，刘恩梅，杨锡强，李成荣，等. 脐血淋巴细胞凋亡及其影响因素. 中华儿科杂志, -36.
　　5，Yano H, Fukuda K, Haramaki M, et al. Expression of Fas and-Fas-mediated apoptosis in human hepatocellular carcinoma cell lines. J Hepatol, -464.
　　6，Cheng J, Zhou T, Liu C, et al. Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule. Science, 59-1762.
　　7，Kroemer G, Zamzami N, Susin SA. Mitochondrial control of apoptosis. Immunol Today, -51.
　　8，Strasser A. Death of a cell. Nature, 5.
　　9，Marengere LEM, Waterhouse P, Duncan GS, et al. Regulation of cell receptor signaling by tyrosine phosphatase SYP association with CTLA-4. Science, 70-1173.
　　10，Suttles J, Evans M, Miller RW, et al. T cell rescue of monocytes from apoptosis: role of the CD40-CD40L interaction and requirement for CD40-mediated induction of protein tyrosine kinase activity. J Leak Bio, -658.
　　11，Greiner A, Knorr C, Qin Y, et al. Low-grade B cell lymphomas of mucosa associated lymphoid tissue (malt-type) require CD40-mediated signaling and Th2-type cytokines for vitro growth and differentiation. Am J Pathol, 83-1594.
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<font color="#06年09月07日 中华风湿病学杂志 2006 Vol.10 No.3 P.149-153
（长沙）为了探讨类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMC)内丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径的活化状况，及99Tc-亚甲基二膦酸盐(99Tc-MDP，商品名：云克)对其的影响。研究者RA患者及正常对照各20例，Western blot检测PBMC中磷酸化MAPK(p-MAPK)的表达；不同剂量99Tc-MDP干预PBMC，Western blot检测不同时间点p-MAPK表达的变化。另行反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及酶联免疫吸附试验(ELISA)，分别从mRNA及蛋白质水平检测该途径下游白细胞介素(IL)-1β及IL-6表达的变化。结果RA患者PBMC中磷酸化p38(p-p38)及磷酸化JNK(p-JNK)(C-Jun氨基末端激酶)表达较正常对照显著增高，p-ERK1/2表达无明显增高；99Tc-MDP能够剂量依赖性下调PBMC中p-p38表达，以20 mg/L组最为明显(P＜0.05)，药物作用30 min即有明显抑制效应；99Tc-MDP对p-JNK表达无明显影响；99Tc-MDP能够剂量依赖性抑制PBMC中IL-1β及IL-6 mRNA表达(P＜0.05)，培养液上清中上述两种炎症介质的水平亦相应降低(P＜0.05)。可见RA患者PBMC中存在p38和JNK的明显活化，99Tc-MDP能够抑制p38激酶磷酸化，并下调其下游炎症因子IL-1β和IL-6的表达。
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<font color="#06年05月16日 中华风湿病学杂志2005 Vol.9 No.12 P.733-737
（南京）为了研究胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis，CIA)大鼠不同时期外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)基因表达谱，寻找与疾病炎症相关的特异表达基因，初步探讨类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)的发病机制。研究者以含有96个基因的功能基因组芯片研究CIA大鼠发病早期、高峰期和后期及正常大鼠的PBMC基因表达谱。结果 cDNA微阵列检测结果显示，CIA早期差异表达基因(＞2或＜0.5)有19个，高峰期25个，后期17个以及三个时期持续表达的上调基因有10个。差异表达基因主要涉及白细胞介素及其受体、趋化因子及其受体、转化生长因子配体及受体等。可见 CIA不同时期基因的差异表达可能与RA病情的持续进展有关，为进一步探讨细胞因子在RA的作用提供理论依据。
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<font color="#05年10月08日 中华儿科杂志 2005 Vol.43 No.6 P.434-437
（西安）为了探讨HBsAg阳性产妇新生儿外周血单个核细胞(PBMC)乙型肝炎病毒(HBV)感染率、影响因素及检测的临床意义，研究者 50例HBsAg阳性产妇和其新生儿为研究组，另18例血清乙肝标志物均阴性者为对照组。采用套式聚合酶链反应(n-PCR)法分别检测产妇、新生儿血清及PBMC HBV- DNA。结果 HBsAg阳性母亲血清及PBMC HBV-DNA检出率分别为60.0%和40.0%；其新生儿血清及PBMC HBV-DNA 阳性率分别为46.0%及30.0%；其中仅血清阳性10例，仅PBMC阳性2例，血清和PBMC均阳性13例。对照组母儿血清及PBMC 中未检出HBV-DNA。新生儿PBMC HBV-DNA阳性率在母血清HBeAg、HBV-DNA阳性组高于阴性组；母PBMC HBV-DNA阳性组高于阴性组；母血清和PBMC HBV-DNA均阳性组高于仅血清阳性组；新生儿血清HBV-DNA阳性组高于阴性组。可见 HBsAg阳性母亲新生儿HBV-DNA感染率为30.0%；其感染率与母、儿血清病毒血症水平及孕妇PBMC HBV-DNA状态有关，检测出新生儿PBMC HBV-DNA具有重要临床意义。
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