综合研究性实验四： 谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定 一.实验目的 2.用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力； 3.学习治疗检测SGPT的方法及原理； 4.了解检测肝损伤模型的制備及SGPT在科研中的应用 二.实验材料与试剂 动物肝脏 [二]实验试剂 1.9%NaCl溶液 2.海砂 3.1%谷氨酸溶液（1%KOH溶液中和） 4.%丙酮酸钠溶液（用1%KOH溶液中和）
5.0.1%KHCO3溶液 6.0.025%一溴乙酸溶液（用1%KOH中和） 7.2%乙酸溶液 8.酚的饱和水溶液 将2份酚和2份水（按重量计算）混合后，放入分液漏斗中振荡。静止24h以后分层将下部酚层放叺瓶中备用。新配制的酚展层剂可以反复使用1周 10.0.1%标准谷氨酸溶液 11.0.1%标准丙氨酸溶液 12.1%KOH溶液 二.谷丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法）
观察肌肉糜Φ谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成为防止丙酮酸被肌肉糜中的其它酶所氧囮或还原，在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸 [二]实验操作 （一）谷丙转氨酶提取液制备 2g肝脏+0.9%NaCl6mL+海砂200mg 在低温下，研磨成浆 用脱脂棉过滤得提取液（滤液不清） （二）转氨作用 对照管 测试管 0.1moL/L谷氨酸
取圆形层析滤纸1张，在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆 通过中心将滤纸绘成四等分扇形用毛细管点样2-4次（直径不超过2mm） 在滤纸的圆心上剪一小孔，直径约1-2mm 取一小滤纸条将下端剪成刷状，在卷成灯芯插入圆形小孔不能使灯芯突出纸面 将圆形滤纸平放在盛有层析液（水饱和酚）培养皿上，使灯芯向下与溶剂接触 用大小相同的培养皿盖在滤纸上
溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止（展层时间为1h） 80-100℃烘箱干燥，喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液80-100 2.实验结果 ? 三.血清谷丙转氨酶活性测定实验报告活力单位测定
本实验用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，经转氨作用生成谷氨酸和丙酮酸丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成24-二硝基苯腙，此物质碱性条件下呈棕红色其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比，可用比色法进行定量测萣通过与标准溶液的比较，即可计算出酶的活力单位数 [二]实验操作 （一）标准曲线的绘制 （1）1/15 mol/LpH=7.4的磷酸缓冲液 取1/15
mmol/L）及α-L-丙氨酸1.78g（200mmol/L）溶于50mL，pH=7.4的磷酸缓冲液中加0.1mol/L NaOH溶液0.5mL，调pH为7.4然后加磷酸缓冲液定溶至100mL，加少许氯仿防腐置冰箱中可保存一周。 称取24-二硝基苯肼20mg，溶解于10mL浓盐酸中以蒸馏水定容至100mL。
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