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总RNA的提取与RT、Realtime-PCR
来源:生物谷
浏览人数: 826
&一、实验原理
RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。
由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。
1．RNA提取的最大影响因素-RNA酶
但是由于RNA酶（RNase）广泛存在且稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压等。RNase催化的反应一般不需要辅助因子，因而RNA制剂中只要存在少量的RNase就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，所以RNA的制备过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。
外源性的RNase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNase也会造成污染。这些外源性的RNase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNase。
2．常用的RNA酶抑制剂
*焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNase抑制剂。它通过和RNase的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
*异硫*酸胍：目前被认为是最有效的RNase抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNase失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNase有强烈的变性作用。
*氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNase结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNase的活性。
*RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNase的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNase结合，使其失活。
*其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNase也有一定抑制作用。
3．防止RNase污染的措施、RNA提取之前需要注意和准备的工作
*尽可能在实验室专门辟出RNA操作区，离心机、移液器、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行除菌。
*操作过程中应始终戴一次性橡胶手套和口罩，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNase带入各种容器内或污染用具。
尽量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不仅常常给操作带来不便，而且塑料手套的多出部分常常将器具有RNase处传递到RNase-free处，扩大污染。
*尽量使用一次性的塑料制品，避免共用器具如滤纸、tips、tubes等，以防交叉污染。例如，从事RNA探针工作的研究者经常使用RNase H、T1等，在操作过程中极有可能造成移液器、离心机等的污染。而这些污染了的器具是RNA操作的大敌。
*关于一次性塑料制品，建议使用厂家供应的出厂前已经灭菌的tips和tubes等。多数厂家供应的无菌塑料制品很少有RNase污染，买来后可直接用于RNA操作。用DEPC等处理的塑料制品，往往由于二次污染而带有RNase，从而导致实验失败。
*所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
*无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNase的活性。
*配制溶液用的乙醇、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶装试剂。
*塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗
（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
*有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。（Northern Blot）
*配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22&m滤膜过滤除菌。
二、仪器和试剂
1．仪器与器皿
超净工作台、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、移液器、电泳仪、凝胶成像系统、振荡器、各种吸头、EP管、研钵（或玻璃匀浆器）、镊子、剪刀、金属小勺、保温罐、液氮、乳胶手套。
研钵（或玻璃匀浆器）、剪刀、镊子、小勺等洗净后，锡箔纸包好200℃干烤6h；不耐高温的器皿（如各种吸头、EP管等）用0.1% DEPC水浸泡过夜（至少10hr以上），120℃高压20min灭菌和除去残留的DEPC，再烘干使用。
（1）无RNase纯水：0.1% DEPC处理过夜，高压灭菌。
（2）TRIzol RNA抽提试剂
（3）氯仿、异丙醇、70%酒精（RNase Free用无RNase水配制）
（4）10X凝胶缓冲液
吗啉代丙磺酸（MOPS）（pH7.0）200mM， NaAc 100mM， EDTA（pH8.0）10mM，过滤除菌后避光保存。
（5）5X变性上样缓冲液：
水饱和的溴酚蓝16&L，500mM EDTA（pH8.0）80&L，甲醛（37%）720&L，甘油2mL，甲酰胺3mL，10X凝胶缓冲液4mL，加无RNase水至10mL，4℃可保持3个月。
三、Trizol试剂提取RNA操作步骤
1．准备工作
提取RNA前先打开冷冻离心机预冷，制好冰，用70%的酒精擦拭加样枪、离心管架和桌面，一次性手套，研钵，DEPC处理的tip、EP管等。
取新鲜动物组织，立即置于冻存管投入液氮中速冻，在液氮中可保存一年左右，-80℃可保存三个月。
3．组织样品的处理
研磨法：戴好厚手套和口罩，取约0.1~0.2g冻存组织，于液氮充分预冷的研钵中用力研磨，期间不断加入液氮，充分研碎组织，小心别把组织洒到外面。将组织粉末用小勺移入1.5mL的EP管中，立即加入1mL Trizol（或预先加入），剧烈摇匀15s，室温静置5min。组织或细胞可适当延长在Trizol中裂解的时间，能获得较多的RNA。
注意：样本体积不能超过Trizol体积的1/10。
匀浆法：取新鲜动物组织（或冷冻组织）0.1～0.2g迅速倒入匀浆器中，加入1mL预冷的Trizol，在冰浴中迅速匀浆20~30s然后将细胞悬液吸入另一EP管，室温静置5min。
细胞样品处理：贴壁细胞，完全除去培养液后直接向培养皿中加入1mL Trizol反复吹打几次，转入EP管，静置5min。
样本在Trizol中，-20℃至少可保存3天，-80℃可长久保存。
4．氯仿抽提
加入400&L氯仿，剧烈振摇15s混匀后，室温静置3min，4℃，12000r/min离心15min，RNA分布于水相中。将上层无色水相转移到另一Ep管中，防止吸到中间层蛋白。若抽提不彻底，可加200&L氯仿重复抽提一次。
注意：EP管要作好标记，防止漏出的氯仿洗去标记；取上清遵循宁少勿烂的原则，保证RNA的纯度。
5．异丙醇沉淀RNA
加入800&L异丙醇，充分混匀，室温静置10min（细胞RNA -20℃静置20min），4℃，12000r/min离心10min，即可观察到管底的RNA沉淀，小心倾去上清液，将EP管倒扣在RNase Free的吸水纸上2~3min除去残留的异丙醇。
注意：尽量吸净残余的液体，残余的异丙醇会影响后续的反转录和PCR扩增效率。
6．酒精洗涤RNA
加入0.7mL 无水乙醇+200&L DEPC水洗涤RNA沉淀物，4℃，8000r/min离心5min，弃上清液，将EP管倒扣在RNase Free的吸水纸上室温干燥3~5min。
RNA在75%的RNase Free酒精中，-20℃可保存两个月，-80℃可保存一年。
7．RNA溶解
向干燥过的沉淀物中加入20&L DEPC处理水（RNase Free水）50℃溶解10min，于-80℃保存备用。
RNA溶解前，尽可能除尽残余酒精，但也要防止过干，使RNA很难溶解。
溶解后的RNA容易被RNase降解，应尽量低温保存。为了防止痕量的RNase污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏等）中分离得到的RNA应贮存在甲醛中，以保存高质量的RNA。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中保存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA在水中保存三年仍保持稳定。
四、RNA的检测
1．在紫外分光光度计上检测RNA浓度及纯度。
准备：DEPC水、RNase Free枪头、石英比色杯、冰盒、记录本，仪器（紫外分光光度计）提前预热30min。
用DEPC处理水校正零点；RNA样品提前按一定比例（如1:100）与DEPC水稀释好，充分混匀备用；读取稀释样品OD260、OD280值及OD260/OD280的比值。每测定一个样品后用DEPC水清洗比色杯两次，再测定下一个样品。
RNA浓度的计算：单链RNA[ssRNA]=OD260&样品稀释倍数&40&g/mL
纯度较高的RNA样品OD260/OD280的比值通常在1.7~2.0，OD260/OD230的比值应高于2.0。OD260/OD280的比值若比值低于1.7说明有蛋白污染（Trizol处理时间过短，可用氯仿再次抽提）或RNA未完全溶解；若比值高于2.0表明有异戊醇或乙醇残留（羟基具有吸光度）。
2. 琼脂糖凝胶甲醛变性电泳检测
（1）制备凝胶（1.2%琼脂糖）：称1.2g琼脂糖，用DEPC水70mL加10&凝胶缓冲液10mL加热溶化，冷却至60℃后+甲醛18mL+5&L EB混匀后，制胶。
（2）RNA样品4&L+1&L 5&上样缓冲液混匀。
（3）换上新鲜电泳液，上样前凝胶预电泳5min，随后将样品点入胶孔。以6-10V/cm的电压，跑30min左右，凝胶成像仪照相。
也可用普通新鲜电泳缓冲液配制凝胶，250V高压电泳5min，迅速照相。
（4）在凝胶成像系统中分析
动物RNA样品电泳后，可见28S、18S及5S（某些试剂盒提取的RNA看不到5S条带）RNA条带，则说明完整性好，各条带清晰无拖带且28S和18S的亮度比约为2:1，表明RNA无降解，反之则表明RNA样品有较严重的降解。如果在28S后边还有条带，表明基因组DNA污染，可用DNase处理后再进行纯化。
注意：为了防止RNase污染，提RNA操作宜快，动作轻，尽量避免空气流动，不可大声喧闹，手套勤换，避免汗液。
五、RT &PCR
1. RNA反转录（RT）
一般以25&L体系加入0.5~2&g总RNA进行RT。推荐使用1&g总RNA进行RT。
（1）去RNA模板二级结构
依次加入10&M Oligo dT 1&L +总RNA 1&g（1-2&L）+DEPC水8&L，混匀，70℃水浴5min（使模板二级结构解开），迅速至冰上骤冷2min（防止重新形成二级结构）。
（2）再按顺序加入各试剂（针对Promage M-MLV M531A反转录酶）
5&M-MLV Reaction Buffer 5&L + RNAsafe(30U/&L) 1&L + M-MLV RT(200U/&L) 1&L + dNTP(2.5mM each) 5&L + DEPC水补足25&L 混匀。
混匀RT体系，离心数秒，42℃（延伸37-42℃均可）水浴60min合成cDNA。
（4）灭活反转录酶
80℃ 5min灭活，-80℃保存RT产物，防止多次冻融。
较多样品RT时推荐方法：
10&M Oligo dT
混合后，每管分装12&L&Oligo dT + DEPC水混合液，然后分别加入1&g RNA模板（约1-2&L），70水浴5min
（针对Promage M-MLV M531A反转录酶）
5&M-MLV Reaction Buffer
RNAsafe(30U/&L)
M-MLV RT(200U/&L)
dNTP(2.5mM each)
以上试剂混匀后，每管加入12&L混合试剂，吹打混匀，RT体系总体积达到25&L，42℃水浴60min合成cDNA。
推荐RT前留一部分RNA做为基因组污染对照，即，不加cDNA，直接以总RNA为模板PCR，如果能扩出条带，说明有基因组污染，且影响到目的基因表达量的检测；另外一种对照是用超水作为模板PCR，目的是检测所使用的各种PCR试剂是否有污染。
在NCBI中找到目标基因mRNA序列，利用Oligo 6.0 或 Primer 5.0软件设计引物，也可直接利用NCBI提供的Primer-Blast软件（）设计引物。
普通RT-PCR引物扩增产物应控制在150-500bp，RealTIme PCR引物扩增产物应控制在80~300bp，较容易检测。引物序列设计完成，通过E-mail发送到上海生工序列合成邮箱（上海合成部：&北京合成部：天即可合成送达。
新合成的引物，先离心（12000rpm 5min使管壁上的核酸粉末沉到管底），按照说明书推荐的溶解体积（一般1OD引物需加水50&L左右）加入灭菌超纯水（或TE），溶解到100&M，涡旋混合数秒使引物充分溶解，再次离心，-20℃保存。PCR时一般使用的引物浓度为10&M，因此，使用前须稀释十倍。
RT-PCR对基因表达进行相对定量分析需要跟一个表达稳定的内参基因进行比较，除了要设计目的基因引物还需要一个内参基因引物（一般选择Gapdh或&-actin作为内参）。
（2）半定量PCR体系
PCR buffer （10&）
dNTP (2.5mM each)
Taq &(2.5U/&L)
RT cDNA模板
PCR Primer mix (5&M)
PCR循环数：根据基因表达丰度而定，一般在初次做时先设置较高的循环数（35-40cycles），然后逐步减少循环数（一般每次减少2个循环）筛选基因扩增的对数期和平台期循环数。一般选择基因PCR对数期范围内的扩增循环数（促进基因表达的处理处于PCR平台期前的循环数最好）进行基因相对表达差异的比较。
电泳检测：将不同处理的样品RNA的RT-PCR产物进行琼脂糖电泳检测，比较条带灰度值（目的基因比内参基因条带，得到基因表达的相对值），不同处理间基因相对表达量差异即可得出。
（3）RealTime PCR
针对TakRa SYBR Green Realtime PCR Kit&（SYBR& Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)
SYBR Green Premix Ex Taq（2&）
Rox Reference Dye II（50&）
PCR Primer mix (5&M)
加样方法：根据实验设计（试验处理数和检测基因数）确定所加样的管数。一般每个处理做两管平行。
需加样数= 处理数&检测基因数&2
提前准备好冰盒、96孔管架2个。
先按照加样数计算出SYBR Green Premix Ex Taq、Rox Reference Dye II 和dd H2O的量（最好多预算出1~3份试剂的量，否则到最后就不够分装），并按照相应的量在1.5mL 的EP管中混好。& 然后按照试验的处理数平均分成若干份（几个处理就分几份）分装到0.5mL的EP管。& 然后，分别添加各处理的cDNA并做好标记防止互相混淆。& 样品混匀后，再将每管按照所需检测的基因数平均分成若干份于0.2mL的EP管中，分别添加相应的引物，并做好标记。& 每管样品按两个平行（20&L/管）分装到ABI公司生产的RealTime专用八连管或96孔板
（一定记住每个处理、检测的基因位于96孔板的位置，Realtime检测管不能做标记，最好提前在实验本上设计好每个检测管的位置，防止混乱）
预混合试剂&
分装到Realtime八连管
SYBR Green Premix Ex Taq + Rox Reference
Dye II + dd H2O
平均分装至0.5mL 管分别加cDNA& &
Treatment 1
平均分装至0.2 EP管分别加引物& &
分装2管平行
分装2管平行
Treatment 2
平均分装至0.2 EP管分别加引物& &
分装2管平行
分装2管平行
Treatment 3
平均分装至0.2 EP管分别加引物&&&
分装2管平行
分装2管平行
样品加完后装入Realtime PCR仪样品台（记住每个处理和基因的位置），打开电脑，设置如下（以AB7500为例）：运行Realtime PCR仪控制软件
Instrument 选项卡设置
保存后点击 Start 按钮开始运行。运行时间约2h，结束后点击，命令栏的播放按钮，然后点保存按钮即可。 此时可以点击Results选项卡查看，Realtime运行数据，包括扩增曲线、引物溶解曲线等。
结果分析：
点击新建按钮&在Assay选项列表中选择ddCt(Relative Quantitation) Study命令，Next & 点击Add Plate按钮，选择已保存的ddCt(Relative Quantitation) Plate文件（.sds文件）Finish。
点击运行按钮，然后选择左侧窗口所列的基因，点击Gene Express选项窗口，即可查看基因相对表达量的柱形图。
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配制提RNA用的各种溶液，直接用购买的DEPC处理水配置可以吗？
打算自己配置溶液提取RNA，配制溶液，
1）直接用购买的DEPC处理水配制可以吗？配好后还需要灭菌或者其他处理吗？
2）还是说必须用DEPC水配制，放置后，高压灭菌？
不想接触DEPC这个东西，又怕会影响实验，请有提RNA经验的老师帮忙解答一下，感谢！
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扫描下载送金币RNA提取过程中异丙醇和DEPC水的作用(异丙醇) - PCR实验 - 生物秀
标题: RNA提取过程中异丙醇和DEPC水的作用(异丙醇)
摘要: [RNA提取过程中异丙醇和DEPC水的作用(异丙醇)] 我刚开始做总RNA 提取,但我不清楚异丙醇和DEPC水在这提取过程中的作用是什么,请指教 谢谢 关键词:[异丙醇]……
我刚开始做总RNA 提取,但我不清楚异丙醇和DEPC水在这提取过程中的作用是什么,请指教.谢谢
回复1.异丙醇可以和RNA上清中的RNA反应，使rna沉淀下来，进而高速离心可以得到RNA.2.DEPC为高活性烷化，能对蛋白质进行共价修饰，使其组胺基团的乙氧基甲酸化，而RNase A 活性位点有两个组氨酸，故能被灭活。rnase极易降解rna，所以DEPC水可以灭活rna酶。回复1.RNA提取过程中的异丙醇是为了沉淀RNA的作用，在帖子里看到很多人说其实是可以用乙醇的 但是沉淀相同量的RNA所需的乙醇太多因此使用了异丙醇。2.DEPC为一种高致癌物质，主要是消灭RNase(RNA酶）。
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【求助】提RNA一定要DEPC么？
楼层直达：
这个帖子发布于9年零33天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
在下是新手,想问一下提RNA是否一定要用DEPC。有的人说高温灭菌就可以得。有人比较过了么？
不知道邀请谁？试试他们
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我提RNA时是这样处理灭火RNA酶的：1)
将研钵、玻璃瓶、量筒、烧杯、三角瓶、玻璃棒等放入烘箱中，180℃干热灭菌6小时以上。2)
将离心管、枪头、药勺等装入已干热灭菌的试剂瓶中，加入配好的0.1%DEPC水充分浸泡，瓶口用封口膜和锡箔纸封好，37℃保温12小时以上，然后将DEPC水倒出，高压灭菌30分钟。再将离心管、枪头、药勺等放入烘箱中烘干备用。
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也可以用蛋白酶K
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去除RNA酶现在最有效的办法就是DEPC，但是他最大的缺点就是有毒！
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hlhua0525 去除RNA酶现在最有效的办法就是DEPC，但是他最大的缺点就是有毒！
DEPC在高温下会随水蒸汽挥发掉，ms？
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转.cn/topic/004/technique/technique01.asp?filename=meihuo.htm
RNA酶活性的控制　　为了获得高质量的真核细胞mRNA，必须使用RNA酶的抑制剂或采用下述的破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法，最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的RNA酶的活性。同时，避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量RNA酶也很重要。下面列举避免RNA酶法染问题的一些注意事项。大多数有经验的研究者并不拘泥于这些注意事项，只是在遇到问题时可能采用其中的一种或几种方法加以解决。 实验程序RNA酶的抑制剂破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法（一）实验程序　　如不谨慎操作，外源性RNA酶可以通过下述途径污染RNA制品：（１）玻璃制品、塑料制品和电泳槽灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染，使用前必须于180 ℃干烤８小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的（Fedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃干烤15分钟（Kumar和Lindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。　　羧甲基化的RNA在无细胞体系中翻译效率很低，然而，除非其中大部分嘌呤碱基均被修饰，否则其形成DNA：RNA或RNA：RNA杂交休的能力并不明显降低。用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1 ％DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。（２）研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时，主有涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触 “胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此进行RNA实验时应勤换手套。（３）污染的溶液用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1％DEPC于 37℃至少处理12小时，然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。注：DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因些不能用来处理含有Tris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。（二）RNA酶的抑制剂下面介绍３种广泛应用的特异性RNA酶抑制剂。（１）RNA酶的蛋白质抑制剂是从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种RNA酶紧密结合（KI≈3x1010）形成非共价结合的等摩尔复合物，使RNA酶失活。此蛋白质体内可能是血管生成素的抑制剂，血管生成素是氨基酸序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子，几个厂家以不同的商品名出售这种抑制剂，该蛋白质应置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DTT）的50％甘油中，贮存于－20℃。抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用，因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的RNA酶。因此，在使用变性剂裂解哺乳动物细胞这一提取RNA的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。然而职用更温和的裂解方法时应使用这种抑制剂，并且在后续的所有RNA纯化步骤中均应有此蛋白质存在。由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂，故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大活性的发挥要求巯基试剂，而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。（２）氧钒核糖核苷复合物这种由氧钒（1V）离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，是量种过渡态类似物，它能与多种RNA酶结合并几科能百分之百地抑制RNA酶的活性。这４种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中，在RNA提取和纯化的所有过程中，其使用浓度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母细胞中进行翻译， 并能作为某些外酶促反应（如mRNA反转录）的模板。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译，因此必须用含0.1 ％羟基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有几家公司出售氧钒核糖核苷复合物。（３）Macaloid（硅藻上）Macaloid是一咱粘土，很多年前就发现它能吸附RNA酶，用缓冲液将其制成浆液，以0.015％（W/V）的终浓度溶解细胞。 这种粘土随同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中（如酚抽提后）经离心去除。 (三）破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法　　用强烈变性如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来。RNA酶可耐受多种处理等，因此可联用上述试剂，从组织中，如富含RNA酶的胰腺中，提取完整无损的RNA。下述实验程序系列利用RNA酶抑制剂和（或）能迅速灭活RNA酶的有关方法从组织或细胞培养物中分离总RNA、核内RNA和胞质内 RNA。
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挥汗如雨 我提RNA时是这样处理灭火RNA酶的：1)
将研钵、玻璃瓶、量筒、烧杯、三角瓶、玻璃棒等放入烘箱中，180℃干热灭菌6小时以上。2)
将离心管、枪头、药勺等装入已干热灭菌的试剂瓶中，加入配好的0.1%DEPC水充分浸泡，瓶口用封口膜和锡箔纸封好，37℃保温12小时以上，然后将DEPC水倒出，高压灭菌30分钟。再将离心管、枪头、药勺等放入烘箱中烘干备用。就如 挥汗如雨 说的：研钵等物品用高温灭菌就可以了EP管、枪头等则用depc水浸泡灭火RNasedepc接下来的高压灭菌中会被灭活，因此用的时候可以完全放心，没有毒的!
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