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质粒DNA提取溶液I是什么颜色?
震哥刷粉团402
无色透明的.如果你加了lyseblue,可能会有乳白色的沉淀.而lyseblue在碱性pH下,也就是加入P2后,会呈现蓝色.
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质粒DNA提取原理
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1.75亿学生的选择
质粒提取各溶液组分的作用
傻慧慧≠9711
solution 1就是提供一个裂解菌体的溶液～有一些蛋白质变性剂去垢剂葡萄糖做调解渗透压的作用～solution2就是碱性的致使核酸（基因组DNA加质粒DNA）发生变性的溶液～solution3就是用来中和2的碱性的溶液～使得质粒可以复性而基因组DNA则不能～所以经离心就可以把质粒分离开来了～
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溶液1的作用是裂菌，其中的葡萄糖的作用是使溶液的黏度增加，减少剧烈摇晃时对DNA的机械剪切力。溶液2的作用是使基因组DNA以及质粒DNA变性。溶液3是使核酸复性，由于基因组DNA较大较松散，在加入复性溶液后不能充分复性，而质粒DNA比较紧密，加入复性溶液后可以充分复性，从而导致两者的沉降系数不同，经过后续的离心可以将两者分离开。...
扫描下载二维码质粒的提取中常出现的问题 - 实验交流 - 生物秀
标题: 质粒的提取中常出现的问题
摘要: [质粒的提取中常出现的问题]
1、 质粒提取不成功的原因
（1） 裂解时间太长。加入溶液P2后裂解时间不应超过5分钟。
（2） 吸附时间不够
（3） 溶解时间不够
（4） 大肠杆菌(Escherichia coli)老化。建议涂布平板培养后。
重新挑选新菌落进行液体培养。
（5） 质粒拷贝数低。由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具体相同功能的高拷贝数载体。
（6） 菌体中无质粒。有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造…… [关键词:质粒 洗脱 电泳 洗脱液 拷贝数 条带]……
1、 质粒提取不成功的原因
（1） 裂解时间太长。加入溶液P2后裂解时间不应超过5分钟。
（2） 吸附时间不够
（3） 溶解时间不够
（4） 大肠杆菌(Escherichia coli)老化。建议涂布平板培养后。
重新挑选新菌落进行液体培养。
（5） 质粒拷贝数低。由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具体相同功能的高拷贝数载体。
（6） 菌体中无质粒。有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如。
柯斯质粒在大肠杆菌(Escherichia coli)中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素(antibiotic)使用浓度是否正确。碱裂解不充分。使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。对低拷贝数质粒。
提取时，可加倍使用溶液P1、P2和P3，可能有助于增加质粒提取量和质料质量。
（7） 溶液使用不当。溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。
吸附柱过载。不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或者&YT，菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率，则需调整LB培养液体积。
（9） 质粒未全部溶解。洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
（10） 乙醇残留。漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。
（11） 洗脱液加入位置不正确。洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。
（12） 洗脱液不合适。DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB（10 mM Tris&Cl，
pH8.5）或水。洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH7.0～8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能性导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加暖至60℃后使用有利于提高洗脱效率。
洗脱体积太小。洗脱体积对来回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。
混有蛋白。不要使用过多菌体。溶液P1、P2、P3处理并离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物，可再次离心去除后再进行下一步骤。
DNA电泳中常出现的问题
1、 提大肠杆菌(Escherichia coli)质粒后跑琼脂糖凝胶电泳无条带出现
在确定琼脂糖凝胶电泳无问题的前提下，那应该就是质粒提取有问题。首先观质粒是高拷贝还是低拷贝的质粒。
一般低拷贝的质粒5ml的。
高拷贝的质粒2-3ml小剂量提取。量不能过大，否则影响提取。第二点，加入裂解液如SDS-NaOH后，时间不宜超过5min，因为此步骤的目的是使细胞内物质释放，蛋白质，染色体DNA和质粒DNA变性，时间过长，会导致加入中和裂解液如酸性醋酸钾后，仍无法使质粒DNA复性。导致提取失败。
2、 电泳无条带的原因
（1） 上样量太小。解决方案是增加上样量。
（2） 样品分子量不在胶允许范围内。建议另外配置合适的胶。
（3） 提取不干净或缓冲液有问题。
（4） 菌的问题，菌种是否正确。
有没有确信加了抗生素(antibiotic)，质粒拷贝数高不高，菌量够不够然后提取的时候，盒牌子质量过不过硬，有没有过期，裂解是不是完全，会不会SDS或者高盐都结晶沉淀了。
所有溶液有没有加错，比如说柱分离，漂洗液里面有没有确信加了酒精，洗脱时候洗脱液假如用的是纯水，有没有调过pH值，加的量够不够。
有没有完全浸润硅胶膜。
（5） 最后跑电泳的时候，有没有确信加了EB。
加的样品量有多少，有没有增加样品量看观。
3、 marker条带非常模糊，无法辨别具体条带的原因
（1）marker条带出现了降解。请确保在使用过程中避免污染；
（２）电泳缓冲液陈旧。电泳缓冲液多次使用后，离子浓度降低，ph值上升。
缓冲能力减弱，从而影响电泳效果，建议经常更换电泳缓冲液；
（3）电泳条件不合适。电泳时电压应不超过20v/cm。
温度应低于30℃；
（４） marker上样量过多。请根据说明书选用合适上样量；
（5）凝胶质量不好。建议使用质量较好的糖；此外，凝胶凝固不均匀也会导致条带模糊。
ＤＮＡ回收中常出现的问题
1、 没有回收到 DNA片段
如在洗脱后,发现洗脱液中没有DNA 片段,请检查是否按瓶身标签,在洗涤液中加
入了无水乙醇.
2、提取率低
（1) 融胶液为酸性缓冲液,如融胶后,其 pH 值升高将影响提取得率.请加渗透 0.1 倍体积
的 3M 乙酸钾(pH5.0).
（2) 长时间使用后没有更换的电泳缓冲液,其 pH 值较高,将影响DNA 的吸附.请更换新
的电泳缓冲液后,再入行电泳,然后切胶.
（3) 在洗脱前,将洗脱液于 30～60℃温浴,可提高提取效率.
3、来回收得片段为什么电泳上样会漂起来？
主要问题是纯化过程中的乙醇没有除干净。
4、 胶很难融如何处理？
将融胶问题提高到60度；可能是胶的浓度太高，需要提高融胶液的体积；融胶过程中每隔一段时间就震荡几下帮助融胶。
5、如果胶在后续过程发生胶没有彻底融化，如何补救？
补加融胶液，将胶悬起来。
50-60度继续保温至彻底融化。
6、如果DNA纯化的得率非常低或根本没有。
估计是什么问题？
一点都不能得到产物的回收情况很少见，有些情况是判定回收效率的方式不对。如对，请检查一下Wash中有没有加入酒精；检查加入的DNA结合剂（Solution
S或Solution
SN）的量对不对；洗脱前有没有将残留得酒精去彻底；洗脱液有没有使吸附材料充分接触（洗脱），接触的时间是否充分。
7、用Ez-Resin如果凉干过头，如何处理？
答：加TE, 50-60度处理10分钟，间或振荡，离心收集上清。
外源质粒对大肠杆菌(Escherichia coli)的转化中常出现的问题
1、大肠杆菌(Escherichia coli)经质粒转化后铺板生长菌落大小不一
转入空载质粒、含有插入的DNA片断、以及少量具有抗性的菌落在选择培养基上受到的选择压不同，生长速率不一。
2、 没有或极少量菌落
（1） 感受态细胞效率低：使用转化效率高于 107 cfu/mg 的感受态
（2）PCR产物量不足：电泳定量，浓缩PCR产物
（3） (antibiotic)用错或浓度过高
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电话：021-请问，提DNA或质粒时，为何要用70％的酒精来洗(质粒) - DNA技术 - 生物秀
标题: 请问，提DNA或质粒时，为何要用70％的酒精来洗(质粒)
摘要: [请问，提DNA或质粒时，为何要用70％的酒精来洗(质粒)] 请问各位。提DNA或质粒时为什么要用75％的酒精洗呢？别的浓度的酒精不可以吗？ 关键词:[质粒]……
请问各位。提DNA或质粒时为什么要用75％的酒精洗呢？别的浓度的酒精不可以吗？
回复我觉得用70%的酒精洗过DNA后，酒精能快速蒸发；剩下少量水可以使DNA保持湿润，不至于干结成块，方便下一步的TE缓冲液溶解。之所以用70%的酒精，我想可能是经验总结的吧，酒精浓度大一点或小一点应该没什么大问题回复用70%的酒精是因为这个浓度对沉淀DNA效果最好，并且异丙醇能溶于酒精，去除异丙醇，然后挥发酒精，好像还能除盐。个人见解.回复呵呵，我每次异丙醇沉淀完后，就偷懒省掉了用70%的酒精再洗，直接拿去烘干，再溶解到TE溶液里，也都挺好的，不会有什么问题。而且我们实验室好多人都是这样做的，都没事回复异丙醇沉淀以后不必用70%乙醇洗。只有醋酸钠+乙醇沉淀之后才需要70%乙醇洗，目的是洗去加入的盐，乙醇浓度太高达不到脱盐效果，浓度太低DNA会溶掉异丙醇沉淀以后有人用无水乙醇洗一遍，目的是加速DNA的干燥，因为异丙醇的挥发性没有乙醇好回复主要目的还是为了除盐，前面沉淀DNA时加入的盐会影响你后续的克隆操作，如酶切和PCR。回复首先，绝对不是必需用指定浓度的乙醇洗涤；其次，使用指定浓度的乙醇洗涤绝对没有问题。核酸抽提过程中的所有操作，提供的都只是“满意”的结果，并不是“最好”的结果。你按照操作要求做，结果不会有错；如果你希望结果更好，完全可以对操作步骤进行微调。比方说，DNA 洗涤，可以先用 70% 乙醇洗一次，再加入
95% 乙醇洗一次，干燥就非常快。回复But some one told me that the Plasmid DNA could be dissolved in ddH2O. IS that right?I do not know. Hope someone can help me.(sorry, I can not input Chinese now)回复That is right回复en, 应该是这样的回复en, 应该是这样的回复能不能不用异丙醇洗用无水乙醇回复因为这个浓度的酒精不会使DNA溶解，但又含有一定的水分，可以洗掉DNA中的一些离子回复呵呵
为什么我用同样的方法提相同的质粒， 却有很大的差异？有时我觉得不必要再用乙醇洗了回复我觉得不管是乙醇还是异丙醇都可以洗涤，都是醇类物质嘛．但是用乙醇挥发的更快，除去盐类杂质的效果也不错．这样节省时间．回复我是提家蚕基因组DNA的，但是很多时候提取的DNA含量很高，但是A260/A280的比值只有0.5左右，有谁知道这是什么原因啊？
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