&&欢迎您来到论文网！网站客服QQ： 电话： 联系人：邱编辑
特异性抗细胞表面分子单链抗体的分离和鉴定
作者：&&&&更新于：&&&&来源：&&&&阅读量：
作者：许静 吴立华 徐洁 刘俊霞 孟磊 何一心 宋增璇 【摘要】
目的：从抗KG1a细胞的噬菌体展示文库中分离和鉴定抗造血干/祖细胞表面分子单链抗体（scFv），克隆其基因并研究其对应抗原在不同细胞表面的分布。方法：用完整的K
　　2.2& KG1a+ phagescFv单克隆对其他细胞系的识别&　　64个阳性单克隆分别与8个造血祖细胞阶段细胞系做间接免疫荧光反应，其中41个单克隆与8个细胞系均呈阳性反应，15个单克隆识别7个细胞系而不识别BJAB细胞系，8个单克隆与8个细胞系均呈阴性反应（表1）。结果显示有3种类型scFv，它们的细胞结合谱为9（+）、8（+）1（-）和1（+）8（-）。表1& phagescFv的细胞结合谱（略）　　2.3& phagescFv单克隆的DNA序列分析&　　从与细胞结合谱不同的phagescFv中分别挑取2个克隆作DNA序列测定。测序结果按Kabat编号标明scFv核苷酸排列顺序及其演绎的氨基酸残基排列顺序，比较各个scFv的互补决定区（CDR）[6]。结果3个克隆的DNA序列与以前报导的C4、C131和C193相同；1个克隆的互补决定区与以前报导的C194相差2个氨基酸残基；2个克隆C95、H1的DNA序列完全不同于以前报导（表2，3）[4]。表2& scFv克隆的重链互补决定区氨基酸残基序列（略）表3& scFv克隆的轻链互补决定区氨基酸残基序列（略）　　2.4& 免疫印迹结果分析&　　免疫印迹结果显示scFvSAC95 和scFvSAH1融合蛋白能识别和结合KG1a细胞膜蛋白中的抗原带，它们的表观分子量分别约为34、22 kD（图2）。　　3& 讨论&&& 细胞表面分子是鉴别细胞种类及其发育阶段的标志，也有一些是调控细胞行为的信号途径端口。近年来，在细胞表面分子的发现及其信号途径和调控分子应用方面都有长足的进展，尤其在干细胞领域，细胞表面分子已逐渐成为预测细胞分化潜力的依据。但是由于细胞表面分子的多样性，遗传和突变造成的疾病相关分子的瞬时表达等原因，使细胞表面分子领域的研究存在很大的探索空间。人们期待新的细胞表面分子标志来鉴别各种不同发育阶段的干/祖细胞用于移植，也期待新的调控细胞行为的生物分子或药物用于临床治疗。&&& 发现细胞表面分子的经典方法依赖抗体，30年来用杂交瘤技术制备的单克隆抗体在细胞表面分子的研究中发挥了巨大作用，至今仍在使用。但是一些表达水平很低的细胞表面分子，在细胞表面的浓度很低，很难用杂交瘤技术获得其相应的单克隆抗体，但它引发的抗体基因存在于免疫的脾细胞中，可以用基因重组和噬菌体表面展示技术获得其单克隆单链抗体。我们已采用这项技术成功构建了抗KG1a细胞单链抗体库[3]。KG1a细胞分化程度很低，具有造血干细胞特征，其表面具有造血细胞发育、分化早期阶段相关的多种标志分子及细胞因子受体或与干细胞迁移和归巢有关的粘附分子，本研究用KG1a细胞吸附富集抗KG1a细胞表面分子噬菌体库后再用CD44单抗作引导选择，使KG1a+phagescFv达到44.4%，与我们以前报道的结果近似，说明这种分离方法高效且稳定[4]。本文分出的6个特异性phagescFv单克隆中有3个克隆的DNA序列与以前报道的完全相同，1个克隆仅在CDR中有2个氨基酸残基不同，2个克隆的DNA序列完全不同于以前报道，结果提示CD44和CD34分子在KG1a细胞表面的定位距离不远。DNA序列测定，结果显示C95和H1两个克隆的CDR都很独特，推测它们可能识别不同的抗原，免疫印迹结果证实了我们的推断。&&& 从phagescFv文库中筛选特异性scFv单克隆是制备单克隆抗体的新途径，从中可以筛选出许多具有不同特异性phagescFv单克隆，用此方法获得的单克隆scFv一级结构明确，利于基因重组制备双功能抗体用于临床治疗[7,8]。我们已筛选鉴定7个单克隆scFv，其中6个克隆通过基因重组技术构建成具有碱性磷酸酶（scFvAP）或链霉亲和素（scFvSA）标记的双特异性抗体[9]，这为分离和鉴别新的细胞表面分子，深入研究它们的生物学特性和功能奠定了坚实的基础。【参考文献】& 　　1 Colcher D, Pavlinkova C, Beresford G et al. Singlechain antibodies in pancreatic cancer.\[J\]. Ann N Y Acad Sci,280.　　2 Bakker A B, Oudenrijn S,Bakker A Q et al.Ctype lectinlike molecule1:a novel myeloid cell surface marker associated with acute myeloid leukemia\[J\].Cancer Res,):.　　3 隋建华,宋增璇,佘 鸣 et al. KG1a细胞免疫小鼠脾细胞scFv噬菌体展示文库的构建及其表达\[J\].中国免疫学杂志,）：318321.　　4 刘俊霞,孟 磊,许 静 et al. 引导选择抗细胞表面分子单链抗体\[J\].中国科学院学报,）:405409.　　5 许 静,李文平,隋建华 et al. 单链抗体分子与链亲和素融合蛋白的制备\[J\].中国实验血液学杂志, ）：120122.　　6 Johnson G, Wu T T. Kabat database and its applications :30 years after the first variability plot\[J\]. Nucleic Acids Res,218.　　7 Yoshida S,Kobayashi T,Matsuoka H et al. Tcell activation and cytokine production via a bispecific single-chain antibody fragment targeted to bloodstage malaria parasites\[J\].Blood,02305.　　8 Loffler A, Kufer P，Lutterbuse R et al. A recombinant bispecific singlechain antibody, CD19
CD3,induces rapid and high lymphomadirected cytotoxicity by unstimulated T lymphocytes\[J\]. Blood,82121.　　9 许 静,刘俊霞,李 侠 et al. 单链抗体碱性磷酸酶融合蛋白的制备\[J\].中国免疫学杂志,）：8688.
版权声明：
1.[论文网：]资料来自互联网，出于非商业性学习目的全部免费阅览。
2.本文归原作者所有，仅供学习参考，请勿拷贝使用。
3.如果本网所专转载内容不慎侵犯了您的权益，请与我们联系客服QQ：，我们将会即时删除。
　　杂志简介：　　《俪人》教师杂志是经国家新闻出版总署正式批准，由青海省文学艺术
　　《建筑遗产》(半月刊)是由中华人民共和国新闻出版总署批准，由中国科学院 主管 中
　　一、【杂志概况】　　主管单位 ：河北省卫生厅　　主办单位 ：河北省医疗气功医院
　　改革开放推动中国一步步进入经济时代;社会发展，历史演进，也推动中国一步步进入法
　　《中国文艺家》杂志系中国文学艺术界联合会主管、中国文联出版社主办的国家一级艺
《新课程学习》杂志是国家新闻出版署批准, 山西省新闻出版局主管,由山西省期刊协会主办
　　《东方企业文化》 杂志 主管单位：中国纺织工业联合会，主办单位：中国纺织职工思
　　《课程教育研究》杂志是由中华人民共和国新闻出版总署批准，国内外公开出版发行的
　　《房地产导刊》定位于主流产业经济杂志，保持客观、独立的立场;具有权威性、主流性
　　《门窗》杂志是经国家新闻出版总署批准公开出版发行，是目前国内门窗幕墙行业唯一抗人P185-&erbB2-scFv-Fc-IL-2融合蛋白抗肿瘤..
扫扫二维码，随身浏览文档
手机或平板扫扫即可继续访问
抗人P185-&erbB2-scFv-Fc-IL-2融合蛋白抗肿瘤作用和机制的实验研究
举报该文档为侵权文档。
举报该文档含有违规或不良信息。
反馈该文档无法正常浏览。
举报该文档为重复文档。
推荐理由：
将文档分享至：
分享完整地址
文档地址：
粘贴到BBS或博客
flash地址：
支持嵌入FLASH地址的网站使用
html代码：
&embed src='/DocinViewer-4.swf' width='100%' height='600' type=application/x-shockwave-flash ALLOWFULLSCREEN='true' ALLOWSCRIPTACCESS='always'&&/embed&
450px*300px480px*400px650px*490px
支持嵌入HTML代码的网站使用
您的内容已经提交成功
您所提交的内容需要审核后才能发布，请您等待！
3秒自动关闭窗口抗莪术醇单链抗体的构建及其在大肠杆菌中的表达--《桂林医学院》2014年硕士论文
抗莪术醇单链抗体的构建及其在大肠杆菌中的表达
【摘要】：目的：利用抗体基因工程的方法得到高亲和力的抗莪术醇单链抗体蛋白。
方法：利用RT-PCR及分子克隆的技术，从分泌抗莪术醇单克隆抗体的杂交瘤细胞中克隆编码抗体重链及轻链的基因；利用重叠延伸PCR的方法构建抗莪术醇单链抗体基因，并将该基因克隆到大肠杆菌表达载体中；在细菌中诱导表达抗莪术醇单链抗体，并利用ELISA的方法测定抗莪术醇单链抗体与莪术醇的结合能力。
结果：利用RT-PCR的方法获得了抗体轻链及重链Fab片段基因，并克隆在了T载体中，长度为620bp左右；测序后序列分析表明我们获得的抗体基因为全新的抗体基因，在GeneBank中没有报道。利用重叠延伸PCR的方法将轻链和重链基因的可变区通过多聚甘氨酸接头连接为单链抗体，所得单链抗体基因长度为750bp左右。利用PCR克隆的方法将单链抗体基因３末端加入Flag标签序列，并克隆到细菌表达载体pET21a中得到质粒pET21a ScFvFlag６XHis（pET21ScFvFH），测序结果表明基因表达框正确，没有发生突变。将质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3），利用IPTG诱导2小时后，Westernblot检测到ScFv的表达，大约有95%的ScFv蛋白存在于包涵体，5%的ScFv蛋白为有活力的可溶性蛋白，分子量为34KD。利用ELISA检测到ScFv蛋白高特异性抗莪术醇活力。
结论：此项研究工作利用基因工程的系列方法，从分泌抗莪术醇的杂交瘤细胞株中成功地构建了抗莪术醇单链抗体基因，并且在细菌中表达出了可溶性单链抗体蛋白，所表达的单链抗体具有高特异性抗莪术醇化合物活力。
【关键词】：
【学位授予单位】：桂林医学院【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：R392【目录】：
中文摘要5-7ABSTRACT7-9英汉缩略词对照表9-11前言11-141 材料与方法14-32 1.1 实验材料14 1.2 主要实验试剂14-15 1.3 主要实验仪器15-16 1.4 主要溶液的配制16-17 1.5 引物17-19 1.6 实验方法19-322 结果32-39 2.1 杂交瘤细胞总 RNA 的提取32 2.2 RT-PCR 法扩增编码抗莪术醇抗体基因片段32-33 2.3 抗莪术醇抗体轻链及重链基因克隆，测序，序列分析33-34 2.4 抗莪术醇 ScFv 的构建34-37 2.5 抗莪术醇 ScFv 基因的序列分析37 2.6 抗莪术醇 ScFv 在大肠杆菌中表达37-38 2.7 抗莪术醇 ScFv 免疫活性检测38-39讨论39-40结论40-41参考文献41-46综述46-58 参考文献53-58攻读硕士期间发表的学术论文目录58-59致谢59
欢迎：、、)
支持CAJ、PDF文件格式
【参考文献】
中国期刊全文数据库
罗萍;[J];第三军医大学学报;2004年05期
崔银珠;[J];国外医药(合成药 生化药 制剂分册);2001年01期
何云燕;夏云;;[J];国际检验医学杂志;2006年09期
孔念华;[J];荆门职业技术学院学报;2000年06期
马颖;邹全明;;[J];免疫学杂志;2006年S1期
【共引文献】
中国期刊全文数据库
翟书华;岑晓江;郭庆;王定康;张光飞;;[J];安徽农业科学;2010年09期
胡春艳;刘全忠;;[J];安徽预防医学杂志;2008年02期
梁广;李校堃;刘敏;黄志锋;;[J];安徽医药;2006年12期
程娜娜;陆兔林;陈军;薛瑾;毛春芹;;[J];安徽医药;2010年04期
方瑾,宋今丹;[J];癌症;2002年07期
赵宝华,张莉;[J];保定师专学报;2001年02期
路小龙,张凤英,郭振泉,黄仪秀,朱圣庚;[J];北京大学学报(自然科学版);2002年02期
李淼;李铭;赵泽华;;[J];北京中医药;2009年02期
刘勇,崔丽,庄俊英,马雁冰,袁力勇,戴长柏,孙茂盛;[J];白求恩医科大学学报;2000年04期
王娟;陈旭;林家逊;曾建红;王晓华;杜泽乡;;[J];中华中医药杂志;2010年08期
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库
何凤田,李蓉芬,张艳,吉清,陈宝军,乔太东,樊代明;[J];癌症;2002年06期
沈倍奋;[J];第二军医大学学报;2002年10期
施广霞，于丽华，刘金友，郭连英，邢嵘，马学真，钱振超;[J];大连医学院学报;1994年02期
王思功,李予蓉,王瑞宁,冯莉;[J];第四军医大学学报;1998年06期
杨冬华,毕向军,农玉新;[J];第一军医大学学报;2001年12期
郑少珠,朱维华;[J];广东药学院学报;1997年02期
汤正好;[J];国外医学(流行病学传染病学分册);2002年03期
史久华;[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;2002年01期
周欣,梁光义,沈万雁,柴立;[J];华西药学杂志;2002年03期
汤敏燕,孙凌峰,汪洪武;[J];林产化学与工业;2000年03期
【相似文献】
中国期刊全文数据库
刘志敏,徐立春;[J];中国基层医药;2005年07期
朱亚尔;朱晓平;;[J];中国中药杂志;2006年05期
娄月芬;陆锦芳;张健;;[J];药学服务与研究;2007年01期
曾建红;陈旭;潘艳薇;舒丽清;;[J];中药材;2008年01期
王婷;李铁福;林绍强;姚崇舜;李校堃;;[J];中华中医药学刊;2008年05期
王耀霞;徐立春;;[J];医学综述;2009年22期
杨新平;陈旭;李芳耀;阮方;林家逊;钟海雁;;[J];时珍国医国药;2010年05期
钟章锋;陈修平;吴铁;王一涛;;[J];中国药房;2010年31期
曹雪;李悦青;刘季红;赵伟杰;;[J];波谱学杂志;2011年03期
赵晓;刘玉玲;;[J];中国新药杂志;2008年19期
中国重要会议论文全文数据库
袁文娟;田颂九;张启明;;[A];2008年《药物分析杂志》第三届普析通用杯论文集[C];2008年
楼燕;张卉;何昊;彭开锋;魏星川;李雪改;陈丽霞;邱峰;;[A];中国化学会第八届天然有机化学学术研讨会论文集[C];2010年
韩凤娟;汤欣;李威;王龙;蔡冬燕;吴效科;;[A];第八届全国中西医结合妇产科学术大会论文及摘要集[C];2012年
中国博士学位论文全文数据库
陈旭;[D];中南林业科技大学;2012年
张卉;[D];沈阳药科大学;2005年
梁大伟;[D];沈阳药科大学;2014年
李文杰;[D];广州中医药大学;2014年
楼燕;[D];沈阳药科大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库
王耀霞;[D];扬州大学;2011年
马旭;[D];大连理工大学;2010年
赵晓;[D];中国协和医科大学;2008年
曹雪;[D];大连理工大学;2011年
唐渊;[D];第三军医大学;2004年
陈海燕;[D];扬州大学;2012年
贾冰;[D];南京中医药大学;2013年
刘志敏;[D];扬州大学;2006年
周娟;[D];扬州大学;2007年
王恒;[D];第三军医大学;2013年
&快捷付款方式
&订购知网充值卡
400-819-9993
《中国学术期刊（光盘版）》电子杂志社有限公司
同方知网数字出版技术股份有限公司
地址：北京清华大学 84-48信箱 知识超市公司
出版物经营许可证 新出发京批字第直0595号
订购热线：400-819-82499
服务热线：010--
在线咨询：
传真：010-
京公网安备74号}