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内容提示：PI染色法,pi,染色,法
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【求助】拟南芥根部PI染色问题~求解答
【求助】拟南芥根部PI染色问题~求解答
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大家好~我最近在做拟南芥根部PI染色，我的伸长区很正常染料进去的也很好，分生区是一片红，与染色时间关。并且奇怪的是 全部是MS对照组这样，我的处理组正常。重复三次都是这样。help这个是对照组这个是我的实验组
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引用一下dongwp管理员的回答：PI为排斥性染料（膜不通透性），不能进入活细胞，与死亡或正在死亡（膜通透性改变）的细胞的核酸结合，发出红色荧光[BankH: Rapid assess ment of Islet viabilitywith A cridine orange and Propidium Iodide In vitro Cellular & Developmental Biology 6-273.]。处理组根部细胞处在死亡或正在死亡的状态，而MS对照组是正常的，因此PI不能进入活细胞。是这个原因吗？文献里有做的对照组的成功染色的例子吗？
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是对照组就是MS未处理的应该是正常细胞进不去那么多红色的，处理组是正常的样子，理论上ms对照组也荧光和我处理组一样的。所以不知道我哪里出现了问题
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从染色结果来看，是不是对照组的组织内部有很多死细胞？这个应该是很确定的吧。是不是对照组和处理组的根龄有差别？或者根的状态有差别？再就是切片的质量有没有差别呢？没做过这方面的实验，求助一下管理员吧，
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跟着学习了下，在网上找到的手册：Propidium iodide (PI) staining of live Arabidopsis seedlings/rootsStock solution 1 mg/ml in water. (P-4170 from Sigma)Propidium iodide is a cationic dye that does not readily cross intact membranesbut it penetrates throughout the meristem and binds to cell walls, forming anoutline of living cells.1. Dilute stock solution, 5 ml in 1 ml water. Aliquot the staining solution into aplastic Petri dish or a multiwell dish (24-well).2. Remove seedling from plate and dip in diluted propidium iodide solution for1.5-2 minutes. (It can be stained longer if necessary).3. Remove excess staining by rinsing seedling in water.4. Mount seedling on slide in water and place coverslip on top for confocalmicroscopy.5. The excitation wavelength is 536 nm and the emission maximum forpropidium iodide is 617 nm so you can use either the 488 or the 514 laser.6. Since the dye does not penetrate living cells, an outline of these cells will beseen clearly, whereas the dye will enter a dead cell, leading to staining withinthe cell and it will eventually bind to the nucleus. 最后说，染料能进入死亡了的细胞。如果对照组出现那种情况，是不是说的确死亡了呢？ 而处理没出现，是因为处理过的原因？
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hugang 引用一下dongwp管理员的回答：PI为排斥性染料（膜不通透性），不能进入活细胞，与死亡或正在死亡（膜通透性改变）的细胞的核酸结合，发出红色荧光[BankH: Rapid assess ment of Islet viabilitywith A cridine orange and Propidium Iodide In vitro Cellular & Developmental Biology 6-273.]。处理组根部细胞处在死亡或正在死亡的状态，而MS对照组是正常的，因此PI不能进入活细胞。是这个原因吗？文献里有做的对照组的成功染色的例子吗？ 第100个积分终于得到了
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优优行医 [图片]第100个积分终于得到了[图片]哈哈，果然啊！高兴高兴！也谢谢优优的关注。呵呵。五一快乐！
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hugang 哈哈，果然啊！高兴高兴！也谢谢优优的关注。呵呵。五一快乐！ 还真没留意。不过很荣幸，我是给你加这第100个积分的人。五一快乐！
hugang edited on
关于丁香园& [求助]关于Hoechst/PI双染的疑惑
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[求助]关于Hoechst/PI双染的疑惑
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[求助]关于Hoechst/PI双染的疑惑
各位大侠好：最近我在做诱导细胞（贴壁）后的Hoechst/PI双染的检测，有很多疑问，在此想请教大家：
1.诱导凋亡后用hoechst染色，发现出现如图片出现的现象，没有很典型的apoptosis body，亦没有核的边集，我想 请教大家的第一个问题是：从图像上来看，到底我的细胞有没发生apoptosis？
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我觉得这样不大看的出来凋亡与否，Hoechst/PI双染一般用流式的方法来检测凋亡是否发生。
Hoechst 33342染色通常与细胞膜通透性变化相关。凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变，但细胞膜的通透性已有增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多。此外，还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关。既然Hoechst 33342进入凋亡细胞中比正常细胞更容易，而PI等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是拒染，坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被这些染料染色。根据这些特性，用Hoechst 33342结合PI等染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst 33342++/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI++）。通过这种方法对凋亡进行检测。
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第二个问题：我同时也做了PI染色，目的是想区分apoptosis和necrosis，但是问题又出来了：PI染色发现坏死很多，通过不同的荧光激发，发现hoechst深染皱缩的核（应该是凋亡吧）在绿光激发下，看到也是发红光！即同一个细胞核在hoechst染时是深染的，但亦被PI染成红色，这说明我的细胞既发生了坏死也发生了凋亡么？即是说发生的晚期凋亡然后再坏死的，可以这样理解么？下面是同一个视野下不同荧光激发的图片，衷心感谢大家的指导！~
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这是同一个视野下的PI图片
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我觉得这样不大看的出来凋亡与否，Hoechst/PI双染一般用流式的方法来检测凋亡是否发生。
Hoechst 33342染色通常与细胞膜通透性变化相关。凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变，但细胞膜的通透性已有增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多。此外，还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关。既然Hoechst 33342进入凋亡细胞中比正常细胞更容易，而PI等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是拒染，坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被这些染料染色。根据这些特性，用Hoechst 33342结合PI等染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst 33342++/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI++）。通过这种方法对凋亡进行检测。
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没有其他人回答了么，自己顶下，否则很快就沉了~哎
顺便再问大家一下：如果我是固定后再染色，那么此时的细胞不是都死了么，那PI染色岂不是很多都是红色？事实上我做的结果也是这样，被染上红色的核很多，而且是正常做~~~
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为什么不用AnnexinV染？很明显的啊
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凋亡检测有很多种方法，常用的有Annexin V-FITC双染，DNA ladder，TUNEL，PI单染等等。TUNEL的图片很PP。
还有，你说的没错，如果用Hoechst/PI双染，细胞是不能固定的，否则所有细胞都会结合PI。因为这种方法就是基于细胞膜对不同DNA染料的通透性差别，如果进行细胞固定，所有的差别就都消失了，这种方法也就失去了意义。
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能不能传授一下染色的具体步骤，直接配好染色剂依次染色检测就好了吗？
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我之前做了1个多月的关于细胞凋亡和坏死的鉴别方面的工作，有下面这些体会，大家交流一下：
1、判断的最终标准是细胞形态学改变，尤其是电镜下的。当然，特异性的DNA ladder和TUNEl也可以说明问题。TUNEL阴性不代表没有凋亡，加做DNA ladder。
2、PI+Hoechst染色结果除非跑流式，否则这样荧光显微镜下数细胞缺乏判断的依据，到最后连自己都会犯糊涂。
第2点我感受很深。我从荧光下细胞的大小和荧光强度谈谈。
首先，细胞大小养的细胞种类有关。我不知道lz养的是什么细胞，但我感觉正常的细胞应该是像图1中8点位置那个肾形细胞，hoechst淡染均匀。其他有些圆形的细胞怎么回事我就搞不懂了。对于那些缩小亮染的细胞，首先要搞清楚它们是不是粘附在正常细胞上面的坏死细胞，没有看到lz光镜下的图片不好判断。如果是的话，那么在处理后出现的这种情况就不能说明问题了。我一般的拍照习惯是先照PI（红色，判断有无坏死），然后hoechst（蓝色），最后一张光镜。这样就能判断那些荧光下核缩小细胞究竟是不是凋亡细胞。lz第一张图我估计中间那团细胞里面肯定有坏死细胞黏在上面，做个PI也会是不少红色的。第2、3张图打圈的细胞照理论上来说应该是坏死。周围的看起来像正常细胞。其实坏死细胞和晚期凋亡细胞都会出现这种情况，我觉得就不好区分了。
其次，荧光的强度可以通过改变曝光的时间获得自己想要的结果。
总之，要想通过观察判断荧光下凋亡细胞确实有难度。理论上说的是一套套，自己做起来又不是那么回事。如果有条件，最好最好是流式算了。
在非单一造模条件下（比如缺氧复氧），其实细胞凋亡应该不是群体细胞的死亡行为，如果确实观察到大部分细胞出现hoechst+++/PI--疑似凋亡的细胞，我觉得应该慎重判断。
自己做的是心肌方面的，不知道对不对，各位大侠指正。
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这种染色方法不进行多次试验、摸索是很难出阳性结果的PI染色后细胞量减少我做细胞分散后PI染色荧光显微镜观察,细胞分散后细胞的量还可以,但是经过固定,洗,PI染色,再洗之后只有极少的细胞,激发后还没有荧光.请问有经验的高手,PI染色过程需要_百度作业帮
PI染色后细胞量减少我做细胞分散后PI染色荧光显微镜观察,细胞分散后细胞的量还可以,但是经过固定,洗,PI染色,再洗之后只有极少的细胞,激发后还没有荧光.请问有经验的高手,PI染色过程需要
PI染色后细胞量减少我做细胞分散后PI染色荧光显微镜观察,细胞分散后细胞的量还可以,但是经过固定,洗,PI染色,再洗之后只有极少的细胞,激发后还没有荧光.请问有经验的高手,PI染色过程需要注意哪些问题?
博凌科为 主要是离心,去液的问题.我以前做的本科毕业设计就是比较三种荧光探针的性能,PI是个标准的对照. 细胞分散后放入离心管,我做的时候是1200r/min,然后倒掉再加PBS洗.这个倒液很重要,一定要一次到干净,而且要快,千万不要因为管底有一点液体而再到一次,这样会损失大量细胞.剩余的一点培养基会在之后再洗两遍的时候洗掉的.有时细胞数量不太多时也是同样的操作,不用怀疑,细胞肯定有. 之后的乙醇固定后细胞死亡,到的时候要缓一点,但同样不要回流后再倒.死细胞间的结合能力弱,太快倒掉会全流出去的. 我当时是在加了PI后洗一遍,一个小时后去做的流式,效果基本都很好的. 楼主,这个实验主要是离心,倒液,动作大胆一些,快一些效果会更好,否则时间太久了影响效果.对了,还有就是若剩的液体太多,就多离一次心,一般损失是可以接受的.PI染色后要在30min内去检荧光,要不会衰减的. 希望我的回答对你有帮助,祝实验顺利!PI染色检测细胞周期_中华文本库
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PI染色检测细胞周期
1) 细胞样品的准备：
（1） 对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
（2） 对于悬浮细胞：1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
2) 细胞固定：将细胞加入到1毫升冰浴预冷70%乙醇中，快速轻轻吹打混匀，4℃固定2小时或更长时间。固定12-24小时可能效果更佳。1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50微升左右的70%乙醇，以避免吸走细胞。加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
3) 碘化丙啶染色液的配制
4) 染色：每管细胞样品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀， 37℃避光温浴30分钟。随后可以4℃或冰浴避光存放。染色完成后宜在24小时内完成流式检测，最好能在当日完成流式检测。
5) 流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同
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