DNA与蛋白质互作及定点突变_百度文库
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DNA与蛋白质互作及定点突变|
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哺乳动物单杂交系统原理
哺乳动物单杂交原理是否跟酵母单杂交原理一致呢??
08-12-22 &匿名提问 发布
一、酵母双杂交系统 (一) 基本原理 　　酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中 建立 i 。典型的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，　并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，　转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，　启动 它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开， 仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载 体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时， 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达， 其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad没有。因此， 在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。 　　双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因 (reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一 个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd， LexA-bd)； 另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad， VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中， 蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)， 从而可分析蛋白间的结合作用。 　　酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用， 具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行， 而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强， 后者又与启动子DNA结合， 此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。 同时， 酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 (二) 酵母双杂交系统的应用 1特点与优点 　　酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及 分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点: ⑴ 作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。⑵ 检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。⑶ 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。⑷ 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库， 能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。例如已报道成功分析了RAP1与RIF1ii、P21cip1与CDK2iii、 p16与CDK4iv等之间的相互作用。 2结构组成 　　酵母双杂交系统可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构 域。利用此系统已分析和测定了多种重要结构域， 如p85三磷酸肌醇激酶和p110亚单位作用的结构域v， p21cip1蛋白与增殖细胞膜抗原(proliferating-cell nuclear antigen， PCNA) 的结合序列vi等。
　　此外酵母双杂交系统还应用于阐明蛋白质相互作用的结构域，绘制蛋白质联系图谱，在药物设计等许多方面。 (三) 酵母双杂交系统局限性和存在的问题 　　酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法， 有多方面的应用， 但仍存在一些局限性。⑴ 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行。 另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。⑵ 酵母双杂交系统的一个重要的问题是&假阳性&。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生&假阳性&结果。 　　许多研究者对双杂交系统进行了改进和发展，。例如采用假阳性显示分析法和 双筛选系统以减少&假阳性&的发生；发展哺乳动物双杂交系统更好地研究蛋白将的相互作用。其中双筛选系统用二种不同的报告基因(常用lacZ和HIS3) 有以下优势vii:⑴ 用不同的启动子表达位于酵母二个染色体上的报告基因， 可明显减少假阳性。⑵ 通过营养型筛选增强了筛选能力， 尤其适用于对较大的库容量而被选蛋白较少情况下的筛选。
　　哺乳动物双杂交系统viii也是一种基因水平上以重建转录因子功能为基础 的体内分析方法。在此系统中，一种感性趣的蛋白与Gal4--DNA结合结构域构成融合蛋白，另一种蛋白与单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域以融合蛋 白表达。表达这些融合蛋白的载体与一个报道载体（CAT）共同转染哺乳动物细胞系。报道质粒含一个Gal4结合位点下游的cat基因。假如两个融合蛋白相 互作用则cat报道基因表达水平明显增高。用此系统证实了P53蛋白与大T抗原的相互作用， 得到了酵母双杂交系统相同的结果。且较酵母双杂交系统更为快速，在转染48h内得到结果。并且在哺乳动物细胞能更好模仿体内的蛋白-蛋白相互作用。因而， 哺乳动物双杂交系统可作为酵母双杂交系统的辅助手段 二、反向酵母双杂交系统 　　确定了蛋白之间的相互作用后， 更重要的工作是研究其功能、结构及其作用的条件调节。鉴定在相互作用的一对蛋白中的任一蛋白突变对其相互作用的抑制作用， 不仅有助于探索相互作用的结构单位， 而且可作为研究体内功能的遗传学方法。这对于多个作用分子的蛋白就更为重要。 　　1996年Vidalix x等建立了反向酵母双杂交系统(reverse two-hybrid system)， 提供了简便的鉴定阻断蛋白间相互作用的方法。反向酵母双杂交系统的关键是掺入一种表达产物对细胞生长有毒的报导基因， 用于监测蛋白间的相互作用。例如酵母URA3基因表达产物是尿嘧啶合成所必需的， 同时它又可催化5-氟乳清酸(5-FOA)转化为有毒物质。Vidal等构建了一酵母细胞株， 其URA3的表达由含GAL4结合位点的启动子严密控制。此细胞株在缺乏尿嘧啶的培养基中培育需要GAL4激活结构域(GAD)和GAL4 DNA结合结构域(GBD)的融合蛋白的相互作用的表达。而在含5-FOA的完全培养基中则受GAD和GBD融合蛋白相互作用的抑制。因此可通过筛选5- FOA抗性克隆从随机突变库中鉴定阻断蛋白相互作用的突变体。 　　反向双杂交系统可更有效地蛋白间作用的关键位点或起决定作用的个别氨基酸， 进而分析蛋白结构和功能的关系。此外此系统还可筛选能阻止某些蛋白间相互作用的肽或小分子物质用作临床治疗制剂。 三、酵母三双杂交系统 　　三杂交系统(three-binding hybrid system)用于分析蛋白和RNA间的相互作用。Senguptaxi等首先报道了应用三杂技系统分析金属调节蛋白(iron regulatory protein-1，IRP1)与金属反应元件(iron response element，IRE)RNA序列，以及HIV转录激活蛋白(trans-activator protein， Tat)与HIV转录激活反应元件(HIV trans-activation response element，TAR)RNA序列间的作用。 　　三杂交系统的基本原理是将一个已知的RNA结合蛋白与转录因子的DNA结 合domain(如LexA)构建第一个融合蛋白，第二种蛋白(待选的RNA结合蛋白)与转录激活结构域构建融合蛋白。此外构建和表达一杂合RNA，含有 二个不同的结合位点。当RNA与二个RNA结合蛋白的结合位点相互作用时可激活报道基因的转录和表达。如Dhruba等在IRP1与IRE的RNA相互作 用的研究中，第一个RNA结合蛋白选用噬菌体MS2被壳蛋白(MS2 coat protein)，MS2 coat protein可识别RNA中的21nt的茎环序列，并与之有较高的亲和力。将其与LexA融合构建杂合蛋白。IRP1与Gal4的激活结构域 (activation domain)融合构建另一个杂合蛋白。IRE mRNA在非编码区有21nt的茎环区序列，编码区编码与IRP1特异性结合的蛋白序列。在实验中他们用一质粒表达杂交RNA，含2个MS2 coat protein结合位点和1个IRE。 　　三杂交系统提供了快速、多用的体内检测RNA-蛋白间相互作用的新方法。 与双杂交系统相比，杂交RNA与杂交蛋白有些不同：首先，杂交RNA分子可能不是生理结构，杂交的不同RNA组分对正常结构会有一定影响。但Dhruba 的研究表明，局部、相对稳定的结构区如MS2 coat protein，IRP1识别位点等可在体内共存于同一杂交RNA分子中。其次，这些RNA中的茎环区结构相当稳定，RNA只要形成部分正确结构，则足以 介导转录激活作用。 　　象双杂交系统一样，三杂交系统具有广泛的应用。〈1〉应用此系统可分析确 定RNA--蛋白作用的精确结构域，甚至单个核苷酸或氨基酸残基。〈2〉用于鉴定和克隆识别结合有重要生理功能RNA(如转录、定位、RNA病毒包装和感 染等)的蛋白质，可用于调控的机理研究、疾病的防治以及抗病毒药物的研制开发。〈3〉通过构建杂交RNA库，可筛选与特定蛋白结合的RNA。〈4〉有可能 在此基础上发展四杂交系统研究RNA-RNA间的相互作用。
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酵母双杂交系统 (一) 基本原理 　　酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立 i 。典型的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，　并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，　转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，　启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时， 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。 　　双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因 (reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd， LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad， VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)， 从而可分析蛋白间的结合作用。 　　酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合， 此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。 同时， 酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 (二) 酵母双杂交系统的应用 1特点与优点 　　酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点: ⑴ 作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。⑵ 检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。⑶ 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。⑷ 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。例如已报道成功分析了RAP1与RIF1ii、P21cip1与CDK2iii、 p16与CDK4iv等之间的相互作用。 2结构组成 　　酵母双杂交系统可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。利用此系统已分析和测定了多种重要结构域， 如p85三磷酸肌醇激酶和p110亚单位作用的结构域v， p21cip1蛋白与增殖细胞膜抗原(proliferating-cell nuclear antigen， PCNA) 的结合序列vi等。
　　此外酵母双杂交系统还应用于阐明蛋白质相互作用的结构域，绘制蛋白质联系图谱，在药物设计等许多方面。 (三) 酵母双杂交系统局限性和存在的问题 　　酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用， 但仍存在一些局限性。⑴ 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。⑵ 酵母双杂交系统的一个重要的问题是&假阳性&。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生&假阳性&结果。 　　许多研究者对双杂交系统进行了改进和发展，。例如采用假阳性显示分析法和双筛选系统以减少&假阳性&的发生；发展哺乳动物双杂交系统更好地研究蛋白将的相互作用。其中双筛选系统用二种不同的报告基因(常用lacZ和HIS3) 有以下优势vii:⑴ 用不同的启动子表达位于酵母二个染色体上的报告基因， 可明显减少假阳性。⑵ 通过营养型筛选增强了筛选能力，尤其适用于对较大的库容量而被选蛋白较少情况下的筛选。
　　哺乳动物双杂交系统viii也是一种基因水平上以重建转录因子功能为基础的体内分析方法。在此系统中，一种感性趣的蛋白与Gal4--DNA结合结构域构成融合蛋白，另一种蛋白与单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域以融合蛋白表达。表达这些融合蛋白的载体与一个报道载体（CAT）共同转染哺乳动物细胞系。报道质粒含一个Gal4结合位点下游的cat基因。假如两个融合蛋白相互作用则cat报道基因表达水平明显增高。用此系统证实了P53蛋白与大T抗原的相互作用，得到了酵母双杂交系统相同的结果。且较酵母双杂交系统更为快速，在转染48h内得到结果。并且在哺乳动物细胞能更好模仿体内的蛋白-蛋白相互作用。因而，哺乳动物双杂交系统可作为酵母双杂交系统的辅助手段 二、反向酵母双杂交系统 　　确定了蛋白之间的相互作用后，更重要的工作是研究其功能、结构及其作用的条件调节。鉴定在相互作用的一对蛋白中的任一蛋白突变对其相互作用的抑制作用，不仅有助于探索相互作用的结构单位， 而且可作为研究体内功能的遗传学方法。这对于多个作用分子的蛋白就更为重要。 　　1996年Vidalix x等建立了反向酵母双杂交系统(reverse two-hybrid system)，提供了简便的鉴定阻断蛋白间相互作用的方法。反向酵母双杂交系统的关键是掺入一种表达产物对细胞生长有毒的报导基因，用于监测蛋白间的相互作用。例如酵母URA3基因表达产物是尿嘧啶合成所必需的，同时它又可催化5-氟乳清酸(5-FOA)转化为有毒物质。Vidal等构建了一酵母细胞株，其URA3的表达由含GAL4结合位点的启动子严密控制。此细胞株在缺乏尿嘧啶的培养基中培育需要GAL4激活结构域(GAD)和GAL4 DNA结合结构域(GBD)的融合蛋白的相互作用的表达。而在含5-FOA的完全培养基中则受GAD和GBD融合蛋白相互作用的抑制。因此可通过筛选5- FOA抗性克隆从随机突变库中鉴定阻断蛋白相互作用的突变体。 　　反向双杂交系统可更有效地蛋白间作用的关键位点或起决定作用的个别氨基酸， 进而分析蛋白结构和功能的关系。此外此系统还可筛选能阻止某些蛋白间相互作用的肽或小分子物质用作临床治疗制剂。 三、酵母三双杂交系统 　　三杂交系统(three-binding hybrid system)用于分析蛋白和RNA间的相互作用。Senguptaxi等首先报道了应用三杂技系统分析金属调节蛋白(iron regulatory protein-1，IRP1)与金属反应元件(iron response element，IRE)RNA序列，以及HIV转录激活蛋白(trans-activator protein， Tat)与HIV转录激活反应元件(HIV trans-activation response element，TAR)RNA序列间的作用。 　　三杂交系统的基本原理是将一个已知的RNA结合蛋白与转录因子的DNA结合domain(如LexA)构建第一个融合蛋白，第二种蛋白(待选的RNA结合蛋白)与转录激活结构域构建融合蛋白。此外构建和表达一杂合RNA，含有二个不同的结合位点。当RNA与二个RNA结合蛋白的结合位点相互作用时可激活报道基因的转录和表达。如Dhruba等在IRP1与IRE的RNA相互作用的研究中，第一个RNA结合蛋白选用噬菌体MS2被壳蛋白(MS2 coat protein)，MS2 coat protein可识别RNA中的21nt的茎环序列，并与之有较高的亲和力。将其与LexA融合构建杂合蛋白。IRP1与Gal4的激活结构域 (activation domain)融合构建另一个杂合蛋白。IRE mRNA在非编码区有21nt的茎环区序列，编码区编码与IRP1特异性结合的蛋白序列。在实验中他们用一质粒表达杂交RNA，含2个MS2 coat protein结合位点和1个IRE。 　　三杂交系统提供了快速、多用的体内检测RNA-蛋白间相互作用的新方法。与双杂交系统相比，杂交RNA与杂交蛋白有些不同：首先，杂交RNA分子可能不是生理结构，杂交的不同RNA组分对正常结构会有一定影响。但Dhruba 的研究表明，局部、相对稳定的结构区如MS2 coat protein，IRP1识别位点等可在体内共存于同一杂交RNA分子中。其次，这些RNA中的茎环区结构相当稳定，RNA只要形成部分正确结构，则足以介导转录激活作用。 　　象双杂交系统一样，三杂交系统具有广泛的应用。〈1〉应用此系统可分析确定RNA--蛋白作用的精确结构域，甚至单个核苷酸或氨基酸残基。〈2〉用于鉴定和克隆识别结合有重要生理功能RNA(如转录、定位、RNA病毒包装和感染等)的蛋白质，可用于调控的机理研究、疾病的防治以及抗病毒药物的研制开发。〈3〉通过构建杂交RNA库，可筛选与特定蛋白结合的RNA。〈4〉有可能在此基础上发展四杂交系统研究RNA-RNA间的相互作用
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水稻WRKY10基因的功能研究
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