第32卷第2期；Vol.32,No.2海洋与湖沼；OCEANOLOGIAETLIMNOLOGIAS；赤潮叉角藻18SrDNA和ITS区；序列测定与分析；??；庄丽陈月琴1李钦亮??屈良鹄(中山大学生物工程中；提要采用PCR及克隆测序的方法,对1998年引发；rDNAITS区(InternalTranscr；国际分子生物学数据库中获取甲藻另外15个种的18；板
第32卷　第2期Vol.32,No.2海　洋　与　湖　沼　　　　　　　　　　OCEANOLOGIAETLIMNOLOGIASINICA2001年3月Mar.,2001赤潮叉角藻18SrDNA和ITS区序列测定与分析)??3庄　丽　陈月琴1　李钦亮??　屈良鹄(中山大学生物工程中心　广州　510275)(国家海洋局北海监测中心　青岛　266033)提要　　采用PCR及克隆测序的方法,对1998年引发渤海赤潮的叉角藻18SrRNA基因及rDNAITS区(InternalTranscribedSpacerRegions)进行了序列测定与分析。并通过因特网从国际分子生物学数据库中获取甲藻另外15个种的18SrDNA序列,以Tetrahymenacorlissi作为外类群,分别采用Neighbor2Joining和Fitch方法构建了甲藻较为一致和可靠的进化树图,探讨具有高度多样性和在分类上争议较多的甲藻各类群之间的形态与分子进化关系。结果表明,Prorocentrum(有2个简单的壳板)出现得较早,而大多数多甲藻目(覆盖着多个壳板)、裸甲藻目(大多数不具壳板)和膝沟藻目的成员较晚出现。另外,对叉角藻ITS区的分析表明,ITS区为高变区,是良好的分子标记,可用于叉角藻快速鉴定的专一性核酸分子探针的研制。关键词　　叉角藻,18SrDNA,ITS区,形态演化,分子进化中图分类号　　Q75甲藻(dinoflagellate)是重要的浮游植物类群,是形成海洋灾害―――赤潮的主要门类。甲藻中有120多种能形成赤潮,近60种为有毒种类(齐雨藻,1999)。叉角藻(Ceratiumfurca)为其中一种,是诱发1998年渤海赤潮的原因种之一。面对日益恶化的海洋环境,赤潮发生频率不断增加,因此,对沿海海域诱发赤潮发生的海洋甲藻进行快速准确的检测、鉴定及监控是目前赤潮生物学和环境学研究的热点之一(洪君超等,1994;黄奕华等,1997;何家菀等,1999;黄长江等,2001)。甲藻具有很高的形态多样性,同时某些形态特征具有可变性,其野生种和实验室培养种有较大差异,加上有关甲藻分类方法缺乏较为完整、系统的指导性标准,因此目前对甲藻分类存在较大的争议。如分类学中探讨甲藻各大类群演化关系的主要依据是鞭毛的着生位置及壳板的数目和形状,但是,这些性状具有可变性,当涉及到各类之间的演化关系时,存在较多问题。例如:无细胞壁或细胞壁很薄的裸甲藻(大多数不具壳板)和多甲藻(覆盖着多个壳板)相比,哪一种更为原始?等等。　　20世纪90年代以来,分子生物学技术的迅速发展,为探讨甲藻分子进化问题及分类3国家自然科学基金资助项目,号。庄　丽,女,出生于1972年4月,硕士生,E-mail:lsbrc04@1)通讯作者收稿日期:,收修改稿日期:?
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ki.net2期　　　　　　　　庄　丽等:赤潮叉角藻18SrDNA和ITS区序列测定与分析149鉴定提供了新的手段(Inagakietal,1997;Zardoyaetal,1995)。目前,被广泛应用于甲藻系统发育研究的分子指标有大分子rDNA及其基因间隔区ITS区(InternalTranscribedSpacer)等。本研究对我国海区分离到的赤潮叉角藻18SrDNA及ITS区进行序列测定及分析,拟找出其特征性核苷酸序列,为研制快速鉴定赤潮叉角藻的核酸分子探针奠定基础。同时应用距离矩阵方法,对属于甲藻纲多甲藻目(Peridiniales)等各大目的16个代表种的18SrDNA进行序列比较分析,探讨其形态与分子进化之间的关系以及进化模式。1　材料与方法1.1　材料本研究所用的藻种为赤潮叉角藻(Ceratiumfurca),采自辽宁省葫芦岛市港内,由国家海洋局北海监测中心生物室李钦亮工程师鉴定。另外16个种的rDNA序列来自基因库,见表1。表1　本研究所用材料的种名、缩写、所属目及在基因库中的注册号码Tab.1　Listoftheinvestigateddinoflagellatespecies,theirabbreviation,order,andGenbankaccesstionnumber种名CeratiumfurcaProrocentrumpanamensisGymnodiniumcatenatumGymnodiniummikimotoiGymnodiniumsp.LepidodiniumvirideCryptoperidiniopsisbrodyiHeterocapsatriguetraPentapharsodiniumtyrrhenicumPeridinidiumsp.CachoninahalliiGloeodiniumviscumCeratiumfususAlexandriumtamarenseCeratiumtenueAlexandriumminutumTetrahymenacorlissi缩写C.fr.P.p.G.c.G.m.G.sp.L.v.C.b.H.t.P.t.P.sp.C.h.G.v.C.fs.Al.t.C.t.Al.m.T.c.所属目GonyaulacalesProrocentraleGymnodinialesGymnodinialesGymnodinialesGymnodinialesCryotoperidioialesPeridinialesPeridinialesPeridinialesPeridinialesPhytodinialesGonyaulacalesGonyaulacalesGonyaulacalesGonyaulacalesHymenostomatida注册号码AJ276699PSPY1AFAF0AFGDIRGSSAFAMU27499TCU173561.2　DNA的制备、18SrDNA和ITS区的PCR扩增反应1.2.1　DNA的制备　　从显微镜下挑取数个藻细胞(经福尔马林固定)于0.5ml的离心μ管中,加入25l提取缓冲液(1%SDS,10mmol/LEDTA,pH=810,10mmol/LTris-HCl,pH=715,10mmol/LNaCl),采用本实验室研制的DPS纯化系统直接从提取缓冲液中获取微量DNA,用于PCR扩增(陈月琴等,1997)。1.2.2　18SrDNA和ITS区的PCR扩增反应　　18SrDNAPCR引物为:Dino18N1:5’TGTCTCAAAGATTAAGCCATG3’,Gym18(-):5’ACTTCTCCTTCCTCTAAGTGA3’,分别对应于18SrDNA的5’末端和3’末端区域,为甲藻的专一性引物;rDNAITS区扩增?
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ki.net150海　　洋　　与　　湖　　沼　　　　　　　　　　　　32卷引物为LH2:5’AGGTGAACCTGCGGAAGGATC3’,Dlam(甲藻专一性引物):5’CCT2GCAGTCGACA(TG)ATGCTTAA(AG)TTCAGC(AG)GG3’,分别对应于18SrDNA3’末μ端和24SrDNA5’末端区域;在中国科学院上海生物化学研究所合成。扩增完成后,取2l于1%的琼脂糖凝胶电泳检查,其余在-20℃保存备用。1.3　rDNAPCR扩增产物的序列测定、比较分析与数据处理PCR扩增产物经QIAquickspincolumn系统纯化后,与质粒PTZ19连接、克隆(萨姆布鲁克等,1992)。使用377型自动测序仪(ABIPRISM)测定重组质粒的DNA序列。按照最大同源性的原则将所测得Dlam分别扩增赤潮叉角藻18SrDNA及ITS区示意图序列进行排列,序列中引入适当数量的Fig.1　DiagramofPCRamplificationof18SrDNAandITSregionsofCeratiumfurcabyusingDino空位(Gap),以便达到最大可能的同源18N1(+)/Gym18(-)andLH2/Dlam,respectively性。采用计算机分析软件包Phylip35(Felsenstein,1993)1)中的DNAdist程序进行序列核苷酸差异值(Knucvalues)的计算,再图1　引物Dino18N1(+)和Gym18(-)、LH2和以Neighbor2Jioning和Fitch方法构建甲藻分子系统进化树。2　结果与讨论2.1　甲藻18SrDNA及ITS区的PCR扩增由于所采集的样品为赤潮发生时自然水体,除含有叉角藻外,显微镜下观察还有链状亚历山大藻和鳍甲藻及原生动物等。为了避免其它藻类和原生动物的影响,直接在显微镜下挑取单个叉角藻,采用单个细胞法进行DNA提取和PCR扩增,具有较好的重复性,且该方法不依赖微藻培养技术的完善。同时,为了避免18SrDNA5’端的“假结”结构,设计了甲藻专一性引物图2　赤潮叉角藻18SrDNA及ITSDino18N1(+)、Cym18(-)和D1am,分别为甲藻属区扩增18SrDNA5’末端(32-52)和3’末端,24SrDNA5’末Fig.2　18SrDNAandITSregionsPCR端保守序列。PCR结果见图2。18SrDNAPCR产物约为1700rDNAITS区则约为500bp(包括18S3’末端和24S5’末端rDNA部分序列)。2.2　叉角藻18SrDNA的序列测定与分析1841碱基对核苷酸序列,其G+C含量为4411%。amplificationofredtide-relatedCeratiumfurcaM.21.18SrDNA;2.rDNAITS叉角藻18SrDNAPCR产物经纯化、克隆后于自动测序仪进行序列测定,共测得将所测得序列输入国际分子生物学数据库(Genbank),并通过因特网从国际分子生　　1)FelsensteinJ,1993.Phylip-PhylogenyInferencePackage,Version3.5.Distributedbytheauthor,DepartmentofGenetics,UniversityofWashington,Seattle?
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ki.net2期　　　　　　　　庄　丽等:赤潮叉角藻18SrDNA和ITS区序列测定与分析151物学数据库中获取甲藻另外15个种的18SrDNA序列。序列分析比较结果表明,角藻属的3个种:Ceratiumfurca、C.tenue和C.fusus的18SrDNA具有很高的保守性。如在611位点,此3个种皆为A,而其余13个甲藻为G。又如在461位点,此3个种皆为T,而其余13个甲藻皆为C。2.3　叉角藻ITS区序列测定与分析共测得叉角藻ITS区序列438bp。其中,ITS1为149bp,518S为157bp,ITS2为132bp。通过因特网从国际分子生物学数据库中获取甲藻另外6个种的ITS区序列进行分析比较。结果表明,所测定的叉角藻ITS区长度与同一个目的另外一个种Alexandriumpseudogonyaulax较为相似。同时也发现,甲藻四大目之间518SrDNA非常接近,都在160bp左右,表明518SrDNA是一个非常保守的区域。该结果还表明,无细胞壁或细胞壁较薄的裸甲藻类ITS区较长;有2个简单壳板的原甲藻类次之;膝沟藻目较短;而细胞壁覆盖着较多壳板的多甲藻目ITS区最短。ITS区长度从裸甲藻?原甲藻?膝沟藻?多甲藻呈现规律性的递减,这是否预示着甲藻这四大目之间在分子进化方面存在某种趋势?此问题有待进一步研究。另外,对叉角藻ITS区的分析表明,ITS区为高变区,是良好的分子标记,可用于快速鉴定叉角藻的专一性核酸分子探针的研制。这些结果为赤潮叉角藻的鉴定及系统学研究提供了分子基础。表2　甲藻5.8SrDNAandITS区长度的比较Tab.2　Lengthofthe5.8SrDNAandITSregionsamongseveralITStypes种名CeratiumfurcaCooliamonotisOstreopsislenticularisAlexandriumpseudogonyaulaxProrocentrummicansGymnodiniumsanguineumGyrodiniumimpudicum所属目GonyaulacalesPeridinialesPeridinialesGonyaulacalesProrocentralesGymnodinialesGymnodinialesITS5.8SITS2总长度(bp)132>27>68438>355>607注册号码AJAboo6997PMIRG17SAF10742.4　甲藻形态与分子进化目前,世界上现存甲藻约4000多种,包含两大类:Dinophyceae和Syndinophyceae。Syndinophyceae仅为少数的寄生种类,约40个种,而通常所指的甲藻主要为前者―――Dinophyceae。鞭毛的着生位置及壳板的数目和形状是Dinophyceae目间分类的主要依据,据此划分出多甲藻(Peridiniales)、原甲藻(Prorocentrales)、膝沟藻(Gonyaulacales)、鳍藻(Dino2physiales)和裸甲藻(Gymnodiniales)等目,为现存甲藻主要代表,也是海洋甲藻的常见类群。目前,根据壳板的数目和排列方式,存在三种解释甲藻各目间系统关系的假说。(1)壳板递增模型　　从生物学角度推断有壳板的原甲藻目和多甲藻目代表较原始的类群,而裸甲藻目是分化或更先进的类群。?
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ki.net152海　　洋　　与　　湖　　沼　　　　　　　　　　　　32卷(2)壳板递减模型　　根据中生代的化石记录,认为大量的薄壁发展成较少数目的壳板,因而裸甲藻目是最原始的,原甲藻目较为先进。(3)壳板断裂模型　　结合生物学和古生物学证据,认为原甲藻目代表最古老的一支,其细胞壁由两块壳板组成,通过壳板分化成膝沟藻和多甲藻;而另有一支通过壳板减少演化成不被壳的裸甲藻(Bujaketal,1981;Goodman,1987)。由于缺乏足够的证据,这些假说未能得到进一步的证实和发展。在测定和分析叉角藻18SrRNA基因的基础上,从国际分子生物学数据库(Genbank)中获取甲藻另外15个种的18SrDNA序列。采用Phylip35计算机分析软件中的Seqboot程序生成100个自展数据集;以Tetrahymenacorlissi作为外类群,应用Neighbor-Jionig)method和Fitch方法1,经Consen2sus程序计算多数一致树,构建了较为一致的甲藻分子系统树(图3)。从图3可以看出,甲藻的演化图3　以Fitch方法构建的甲藻分子系统树Fig.3　DinoflagellatephylogenytreebasedonthedistancematrixusingtheFitchmethod大致可以分为两大分支,一支为膝沟藻目的甲藻株系;另外一支中,属于多甲藻目的Peridinidiumsp.先出现,接着是原甲藻目的Proro2centrumpanamensis和Phyto2注:以Tetrahymenacorlissi作为外类群,根据核苷酸差异值(Knucvalues)计算diniales目的Gloeodiniumviscum,再接着分为两支,分别为多甲藻目和裸甲藻目的成员。传统的鉴定裸甲藻方法是按照其很不明显的形态学特征(即不披壳)来决定的,这远远不足以建立可靠的分类系统,因此,分子生物学方法可能是对其一个很好的补充。这也解释了为什么按照形态学特征鉴定为裸甲藻的Gymnodiniummikimotoi在系统树中与多甲藻目的成员较为接近,而与裸甲藻目的其它株系相隔较远。从系统树上还可以看出,Prorocentrumpanamensis(有2个简单的壳板)的出现相对较早,而大多数多甲藻目(覆盖着多个壳板)、裸甲藻目(大多数不被壳)和膝沟藻目(覆盖着多个壳板)的成员较晚出现,且出现的时间比较接近,表明甲藻各大目之间是平行演化的。同时还表明裸甲藻细胞裸露可能是次生演化的结果。这些结论与Lenaers等()根据24SrRNA序列分析得到的结果大部分一致。Lenaers等()通过分析甲藻7个目13个种的24SrRNA高变区D1和D8序列,以Tetrahymenathermophila为外类群构建系统树,发现原甲藻、多甲藻和裸甲藻都不是最原始的类群,而是较晚出现的平行发展的较为先进的类群。Zardoya等(1995)对原甲藻、多甲藻和裸甲藻3个目10　　1)同第153页脚注?
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　由于高等植物 rRNA 基因上的 18SrDNA、 ITS 及 5SrDNA 片段常具有变异位 点[1],通过 DNA 序列测定核基因组的 rDNA ITS 序列,根据测序结果进行比较 就可以鉴定... 　以上四种稻的 rDNA 内 IT S(ITS1+ITS2)以及 5.8s rDNA 序列进行测定和分析...编码 18S、5.8S 和 26S 的序列为高度保守区,ITS 序列为进化速度较快的中度... 　广玉兰 rDNA ITS 区序列分析潘云飞 (盐城师范学院生命科学与技术学院 07(19)班,江苏盐城,224002) 指导老师 :刘忠权【摘要】 目的 分析广玉兰核糖体DNA(rDNA) ... 上传我的文档
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艾滋病患者马尔尼菲青霉菌rDNA转录间隔区序列分析
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&&&&&& 真菌rDNA上的5.8s，18s和28srDNA序列高度保守，而ITS序列由于选择压力小，在自然中变异较快，在绝大多数真菌中表现出序列多态性，表现为种内相对一致，种间差异比较明显，非常适合真菌鉴定以及系统发育分析。由于ITS鉴定快速，分析准确，有效弥补了传统鉴定方法的不足，得到了广泛应用。
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梨果棒曲霉毒素产生菌的分离鉴定及其生长规律的研究
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梨果棒曲霉毒素产生菌的分离鉴定及其生长规律的研究
官方公共微信<meta name="dc.description" content="分别以18SrDNA的V4区和V9区为目标基因，采用高通量测序平台和生物信息学方法，分析海水样品中微型和微微型浮游植物多样性。利用在线分析软件对V4（F/R）、V9（F/R）和C4（F/R）3对引物的敏感性、特异性进行了评估和比较，发现自行设计的引物V4（F/R）对真核藻类的扩增特异性高于V9（F/R）和C4（F/R）。高通量测序结果显示，检测样品平均获得68834条原始序列，高质量数据占99%以上，获得基因注释的序列数达94%以上。3对引物V4（F/R）、V9（F/R）、C4（F/R）鉴定的平均微型/微微型浮游植物OTUs数分别为78、42、58，引物V4（F/R）鉴定效率相对较高，同时对细小微胞藻（Micromonas pusilla）、（金牛微球藻Ostreococcus tauri）、密球藻（Pycnococcus provasolii）、抑食金球藻（Aureococcus anophagefferens）、赤潮异弯藻（Heterosigma akashiwo）等优势种检出频率高于引物V9（F/R）。相对已发表的2对引物，设计的引物V4（F/R）对海洋微型和微微型藻类多样性检测更为高效。" />
<meta name="dc.description" xml:lang="en" content="In this study, nanophytoplankton and picophytoplankton diversity in seawater samples was analyzed using a high-throughput sequencing platform and a series of bioinformatics tools, based on the V4 and V9 region of 18S rDNA as the target gene. High-throughput sequencing, which is considered as one of the most important tools in genomics research, is widely applied in the field of marine nanophytoplankton and picophytoplankton diversity studies. We successfully obtained a pair of nanophytoplankton and picophytoplankton PCR primers V4(F/R)by analyzing the nucleic acid database and using a series of bioinformatics tools. Two pairs of universal primers were also selected for comparative analysis, which amplified variable region V4 and V9 of the small subunit nuclear ribosomal DNA (SSU nrDNA).The sensitivity and specificity of PCR primers V4(F/R), V9(F/R), and C4(F/R) were also evaluated and compared using online bioinformatics software. The results showed that the amplification specificity of primer pair V4(F/R) was better than that of V9(F/R) and C4(F/R) in eukaryotic algae. High-throughput sequencing results showed that 68834 raw tags were amplified by the primers, 99% of which were effective tags. Sequences of more than 94% of the effective tags were identified by Ribosomal Database ProjectClassifier, among which 308 operational taxonomic units (OTUs) of one sample were used for further analysis. The average numbers of nanophytoplankton and picophytoplankton OTUs amplified by V4(F/R), V9(F/R), and C4(F/R), were 78, 42, 58, respectively. The primer pair V4(F/R) was found to have higher sensitivity and specificity for amplifying nanophytoplankton and picophytoplankton, including Micromonas pusilla, Ostreococcus tauri, Pycnococcus provasolii, Aureococcus anophagefferens, and Heterosigma akashiwo. The V4 region from the environmental eukaryotic 18S rDNA gene could be suitable for high-throughput sequencing technology, and it was also a good target gene formarine nanophytoplankton and picophytoplankton identification. This study demonstrates the use of a simple, rapid, high sensitivity, and low-cost technology to explore marine nanophytoplankton and picophytoplankton diversity. Moreover, it also provides a reference for the early warning and control of brown tide disasters." />
环境样本中微型和微微型浮游植物高通量测序的引物优化
&&&&2017, Vol. 37 Issue (12):
LIU Weidong,
环境样本中微型和微微型浮游植物高通量测序的引物优化
Optimization of high-throughput sequencing primers for nanophytoplankton and picophytoplankton in environmental samples
吴景. 环境样本中微型和微微型浮游植物高通量测序的引物优化. 生态学报, ): .
Wu J. Optimization of high-throughput sequencing primers for nanophytoplankton and picophytoplankton in environmental samples. Acta Ecologica Sinica, ): .
环境样本中微型和微微型浮游植物高通量测序的引物优化
辽宁省海洋水产科学研究院, 大连 116023;
辽宁省海洋环境监测总站, 大连 116023
基金项目: 辽宁省自然科学基金资助项目（）；中国海洋发展研究会重大项目资助（CAMAZDA201605）；辽宁省海洋与渔业科研项目（201611）；辽宁省科学技术计划项目（）；海洋公益性行业科研专项（）
*通讯作者Corresponding author.
刘卫东, E-mail:
分别以18SrDNA的V4区和V9区为目标基因，采用高通量测序平台和生物信息学方法，分析海水样品中微型和微微型浮游植物多样性。利用在线分析软件对V4（F/R）、V9（F/R）和C4（F/R）3对引物的敏感性、特异性进行了评估和比较，发现自行设计的引物V4（F/R）对真核藻类的扩增特异性高于V9（F/R）和C4（F/R）。高通量测序结果显示，检测样品平均获得68834条原始序列，高质量数据占99%以上，获得基因注释的序列数达94%以上。3对引物V4（F/R）、V9（F/R）、C4（F/R）鉴定的平均微型/微微型浮游植物OTUs数分别为78、42、58，引物V4（F/R）鉴定效率相对较高，同时对细小微胞藻（Micromonas pusilla）、（金牛微球藻Ostreococcus tauri）、密球藻（Pycnococcus provasolii）、抑食金球藻（Aureococcus anophagefferens）、赤潮异弯藻（Heterosigma akashiwo）等优势种检出频率高于引物V9（F/R）。相对已发表的2对引物，设计的引物V4（F/R）对海洋微型和微微型藻类多样性检测更为高效。
微型浮游植物&&&&
微微型浮游植物&&&&
高通量测序&&&&
18S rDNA可变区V4&&&&
可变区V9&&&&
Optimization of high-throughput sequencing primers for nanophytoplankton and picophytoplankton in environmental samples
LIU Weidong
Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116023, C
Liaoning Ocean Environment Monitoring Station, Dalian 116023, China
In this study, nanophytoplankton and picophytoplankton diversity in seawater samples was analyzed using a high-throughput sequencing platform and a series of bioinformatics tools, based on the V4 and V9 region of 18S rDNA as the target gene. High-throughput sequencing, which is considered as one of the most important tools in genomics research, is widely applied in the field of marine nanophytoplankton and picophytoplankton diversity studies. We successfully obtained a pair of nanophytoplankton and picophytoplankton PCR primers V4(F/R)by analyzing the nucleic acid database and using a series of bioinformatics tools. Two pairs of universal primers were also selected for comparative analysis, which amplified variable region V4 and V9 of the small subunit nuclear ribosomal DNA (SSU nrDNA).The sensitivity and specificity of PCR primers V4(F/R), V9(F/R), and C4(F/R) were also evaluated and compared using online bioinformatics software. The results showed that the amplification specificity of primer pair V4(F/R) was better than that of V9(F/R) and C4(F/R) in eukaryotic algae. High-throughput sequencing results showed that 68834 raw tags were amplified by the primers, 99% of which were effective tags. Sequences of more than 94% of the effective tags were identified by Ribosomal Database ProjectClassifier, among which 308 operational taxonomic units (OTUs) of one sample were used for further analysis. The average numbers of nanophytoplankton and picophytoplankton OTUs amplified by V4(F/R), V9(F/R), and C4(F/R), were 78, 42, 58, respectively. The primer pair V4(F/R) was found to have higher sensitivity and specificity for amplifying nanophytoplankton and picophytoplankton, including Micromonas pusilla, Ostreococcus tauri, Pycnococcus provasolii, Aureococcus anophagefferens, and Heterosigma akashiwo. The V4 region from the environmental eukaryotic 18S rDNA gene could be suitable for high-throughput sequencing technology, and it was also a good target gene formarine nanophytoplankton and picophytoplankton identification. This study demonstrates the use of a simple, rapid, high sensitivity, and low-cost technology to explore marine nanophytoplankton and picophytoplankton diversity. Moreover, it also provides a reference for the early warning and control of brown tide disasters.
Key words:
nanophytoplankton&&&&
picophytoplankton&&&&
high-throughput sequencing&&&&
variable region V4 of 18S rDNA&&&&
variable region V9&&&&
海洋微型和微微型浮游真核藻类具有生长快、密度高、分布广等特点, 是海洋初级生产力的重要贡献者, 同时也是赤潮、褐潮暴发的致灾种[]。由于微型和微微型藻类个体微小、缺乏形态学分类指标、多数难以分离培养、无法大量单纯富集, 所以传统的分类学方法鉴定较为困难。分子生物学的快速发展, 为微型和微微型藻类的多样性研究带来了新突破[-]。Handelsman等[]于1998年正式提出了宏基因组学, 主要以环境样品中的微生物群基因组为研究对象；以功能基因筛选、测序分析为研究手段；以微生物多样性、种群结构、系统进化及与环境之间的关系为研究目的。其研究对象已从最初的土壤微生物发展到水体微生物和海样浮游生物[]。宏基因学主要的研究手段之一是根据核糖体基因rDNA数据库进行引物设计, 通过系统发生学分析得到该环境中生物的遗传多样性和分子生态学信息[]。核糖体基因rDNA序列进化变异频率缓慢, 是生物群落系统进化分类研究主要基因之一, 它包括糖体小亚基基因18S rDNA、5.8S rDNA、大亚基基因28S rDNA和转录间隔区ITS。其中核糖体小亚基基因18S rDNA存在于所有真核生物中, 是同时具有信息和功能两种作用的核糖体编码基因[], 其数据库丰富、基因序列种类广泛, 对引物设计、构建物种亲缘关系等方面都具有不可替代的优势。18S rDNA由保守区和可变区交替排列组成, 具有9个可变区[], 可作为种属鉴定的分子标记。
Moon-van der Staay和LópezGarcía通过构建18S rDNA克隆文库和分子系统树, 分别研究了太平洋近赤道海域表层海水和南极深海中微微型真核浮游生物的多样性[-]。在我国邵鹏、袁杰等人分别对厦门西海域和南沙群岛海域微型和微微型浮游藻类建立了18S rDNA克隆文库, 分析了该水域浮游藻类的多样性[-]。自2005年起, 高通量测序技术发展飞速, 由于该技术具有简单快速、测序通量高、错误率低和成本低廉等特点, 加速了宏基因组学的发展[]。Stoeck和Behnke等人对18s rDNA的可变区在真核生物多样性研究中的作用进行了分析, 为基因标记的选择提供了参考[-]。V4区和V9区是目前广泛应用于真核生物多样性研究的目标基因。Amaral-Zettler通过以18s rDNA可变区V9为目标基因设计引物, 利用高通量测序技术研究了海洋浮游生物多样性[]。Stoeck等对以18s rDNA的V4和V9区为目标基因, 结合高通量技术获得了挪威峡湾中真核浮游生物的多样性[]。
由于不同引物对环境中生物多样性的检测效率差异较大, 针对微型和微微型浮游植物, 本研究分别以18SrDNA的V4区和V9区为目标基因设计和选择引物进行扩增, 对引物的敏感性和特异性进行评估和比较分析, 采用高通量测序平台和生物信息学方法, 应用于辽东湾海域进行微型和微微型浮游植物检测验证, 筛选高效检测引物。
1 材料和方法
1.1 引物设计
本文针对目前已知的微型/微微型真核藻类以及黄渤海近岸赤潮生物种类设计了两对引物。首先于NCBI数据库调取相关序列, 其中包括微微型真核藻类45种、中国近岸赤潮生物71种及常见真核藻类73种, 涵盖8个门、18个纲、179条序列。利用软件MEGA4对序列进行多重序列比对, 找到对应的V4区, 同时结合Hiseq2500 PE250测序技术要求进行引物设计, 片段长度为300—450bp, 为增加测序结果的准确性, 充分利用测序技术, 以V4区为核心区及两侧的保守区设计引物, 获得两对引物V4(F/R), 使用FPCR软件检测引物对的退火温度Tm、CG含量, 以及是否会产生二聚体, 利用OligoCalc软件检测引物自身的互补性, 包括潜在的发夹结构、3′端的互补性、自身退火位点的个数等基本参数。
1.2 引物敏感性、特异性评估
采用在线软件TaxMan, 根据核糖体基因数据库, 以多来源的rDNA为模板, 通过多序列全局比对, 对引物扩增的生物类群和未扩增的生物类群物种数量进行预测统计及比较, 进而对3对引物的敏感性、特异性进行评估。本实验选取已发表的海洋真核生物高通量测序引物V9(F/R)和C4(F/R)作为比较分析参照物[]。
1.3 浮游植物鉴定
1.3.1 形态学鉴定
分别在辽东湾长兴岛海域采集3份浮游植物水样, 经福尔马林固定后带回实验室进行显微镜检测。
1.3.2 分子鉴定
(1) 样品采集
现场采集1L表层海水, 经20 μm微孔滤膜过滤去除小型及大型浮游生物, 然后用0.22 μm微孔滤膜过滤收集微型和微微型浮游生物, 最后将滤膜转移至1.5 mL无菌离心管中, 置于-20 ℃或-80 ℃冷冻保存、运输。
(2) DNA提取
采用CTAB法提取浮游生物基因组, 将0.22 μm滤膜剪碎于1.5 mL离心管中, 加入500 μL CTAB裂解液(2% CTAB; 100 mmol/L Tris-Cl pH 8.0；1.4 mmol/L NaCl；10 mmol/L EDTA)和1 μL β-巯基乙醇, 5—10 μL蛋白酶K, 55℃裂解1—1.5 h。短暂离心, 取出液体于新的离心管中, 用酚氯仿抽提2次后, 取上清, 加入两倍体积预冷的无水乙醇, 沉淀2—3 h, 保留沉淀, 使用75%乙醇清洗沉淀, 得到微型浮游生物基因组DNA, 1%琼脂糖凝胶电泳检测并利用紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度, -20℃冰箱保存备用。
(3) 引物合成和PCR扩增
引物序列设计完成, 交由上海生工生物公司进行合成。PCR反应体系为50 μL, 包括PCR Buffer 5 μL、dNTP Mixture 8μL、上下游引物(10 μmol/L)各2 μL、模板DNA 2 μL、Taq DNA聚合酶2.5 U, 加适量灭菌水。扩增反应均在PE 9700型PCR仪(PE公司)上完成, 反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s, 58℃退火45 s, 72℃延伸45 s, 共33个循环；72℃延伸5 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。将检测合格产物交由诺和致源生物信息科技有限公司, 使用NEB Next(R) UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina(New England Biolabs)建库试剂盒进行文库的构建, 构建好的文库经过Qubit定量和文库检测, 合格后, 使用Hiseq2500 PE250进行上机测序。
(4) 数据分析
测序得到的原始数据使用FLASH软件进行拼接, 参照Qiime软件质量控制流程, 将拼接后的序列经过截取、过滤得到有效数据。利用Uparse软件对有效数据进OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类和物种分类分析, RDP Classifier方法与Silva数据库对OUTs代表序列进行物种注释分析。再对OTUs进行丰度、多样性指数等分析, 同时对物种注释在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。最后在以上分析的基础上, 可以进行一系列的基于OTUs和物种组成的聚类分析, 挖掘样品内和样品间的物种组成差异。
2.1 引物设计
利用软件MEGA4对179条序列进行多重序列比对, 找到对应的V4和V9区, 同时结合测序技术要求进行引物设计, 片段长度为300—450bp, 并使用FPCR、OligoCalc等软件对引物的基本参数进行检测和评估, 其基本参数满足引物设计的基本要求, 引物设计结果见。
表 1 微型藻类18S rDNA可变区扩增引物序列
Table1 Primers used in the 18S rDNA variable region of microalgae
引物名称Primer
引物序列Sequence(5′-3′)
5′-GCGGTAATTCCAGCTCCAATA-3′
5′-GATCCCCHWACTTTCGTTCTTGA-3′
5′-CCCTGCCHTTTGTACACAC-3′
5′-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC-3′
5′-CCAGCASCYGCGGTAATTCC-3′
5′-ACTTTCGTTCTTGATYRA-3′
2.1 引物敏感性、特异性评估
采用在线软件Taxman对3对引物的敏感性、特异性进行评估, 结果如。统计数据显示, 引物V9(F/R)对的整体扩增效率低于引物V4(F/R)和C4(F/R), 引物V4(F/R)对真菌、后生动物、领鞭毛虫目类群的扩增特异性低于C4(F/R), 对定鞭藻纲、绿藻门等生物类群的扩增特异性高于C4(F/R), 说明V4(F/R)在扩增真核藻类类群中较有优势。
表 2 引物对扩增SILVA数据库中真核生物类群的特异性统计
Table2 Specificity of the PCR primers foreukaryotarDNA sequences in the SILVA database
真核生物序列eukaryotic sequence
0.29(2165)
0.42(3122)
后生动物Metazoa
0.12(1524)
0.44(5628)
0.70(8900)
领鞭虫目Choanoflagellida
植物界Viridiplantae
0.75(3137)
0.75(3115)
定鞭藻纲Haptophyceae
绿藻门Chlorophyta
甲藻门Dinophyceae
隐藻门Cryptophyta
0.91 (121)
硅鞭藻纲Dictyochophyceae
金藻纲Chrysophyceae
0.86 (123)
硅藻门Bacillariophyta
0.77 (514)
黄群藻纲Synurophyceae
引物对主要扩增真核类群的频数分布, ()内的数字表示扩增该类群的序列数, ()前的数字表示扩增序列数占该类群序列数的比例
2.2 引物对基因组DNA扩增产物检测
为了比较3对引物在实际样品中对真核藻类扩增特异性的差异, 对采集的3份样品分别进行了引物扩增。扩增产物的检测结果见, 本文中3对引物V4(F/R)、V9(F/R)和C4(F/R)的扩增产物片段分别为370bp、135bp、380bp左右, 显示, 片段长度检测结果与设计要求相符, 扩增产物量满足测序需求, PCR体系合格。
图 1 引物扩增片段检测
Fig. 1 PCR amplification of representative DNA templates with rDNA primer sets
2.3 不同引物对的测序结果
通过IlluminaHiSeq2500测序平台PE250测序, 得到的原始数据使用FLASH软件进行拼接, 参照Qiime软件质量控制流程, 将拼接后的序列经过截取、过滤得到有效数据。每个样品平均获得68834条原始序列, 经过拼接和质量过滤, 每个样品平均得到68420条有效序列, 高质量数据占到99%以上, 获得基因注释的序列数在97%以上, 表明测得的数据准确可靠。9个样品测序结果见。
表 3 有效序列数及OTUs数
Table3 The statistics of Effective Tags and OTUs numbers
引物名称Primer
样品名称Sample Name
原始序列Raw Tags
有效序列Effective Tags
注释序列Taxon Tags
总OUTTotal OUT num
种水平平均OTUsAverage OUT num
种水平浮游植物OTUsPhytoplankton OUT num
为了研究样品的物种组成多样性信息, 使用Uparse软件对所有样品的有效序列进行聚类, 以97%的一致性将序列聚类成为OTUs。每个样品平均获得308个OTUs, 每个OTUs代表一类物种。3对引物V4(F/R)、V9(F/R)和C4(F/R)鉴定的平均微型/微微型浮游植物OTUs数分别为78、42、58。
2.4 镜检优势种属与分子鉴定结果比较
镜检优势种属与高通量测序结果见。从结果中可以看出引物V4(F/R)对镜检优势种属的检出率与引物C4(F/R)相当, 并且都高于引物V9(F/R), 对于样品中物种多样性的挖掘, 引物V4(F/R)略高于引物C4(F/R), 且明显高于引物V9(F/R)。
表 4 镜检优势种属与分子检测结果
Table4 The microscopic examination results of three samples
Species names
镜检Microscopic examination
藻类种类数The numberofalgae species
密度Density/(个/L)
Thalassiosira sp.
Chaetoceros sp.
Chaetoceros sp.
Noctilucascintillans
Chaetoceros sp.
Asterionellopsisglacialis
根据注释结果, 在种水平下, 统计3对引物对应的测序鉴定结果, 引物V4(F/R)鉴定出的浮游植物数量多于V9(F/R)和C4(F/R)鉴定出的数量。3对引物对优势种Dolichomastix tenuilepis, 细小微胞藻(Micromonas pusilla)、金牛微球藻(Ostreococcus tauri)、密球藻(Pycnococcus provasolii)、里氏金色藻(Chrysochromu linaleadbeateri)、抑食金球藻(Aureococcus anophagefferens)、赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)等微型和微微型浮游植物的鉴定能力比较, 引物V4(F/R)与C4(F/R)相近, 二者强于V9(F/R)。
表 5 3对引物鉴定浮游植物种类
Table5 Amplification of Phytoplankton with three rDNA primer pairs
物种名称Species names
拉丁文Latin names
甲藻门Phylum Dinoflagellata
Akashiwo sp.
Alexandrium pseudogoniaulax
Alexandrium tamarense
Amoebophrya sp.
Amylax triacantha
Ceratium tenue
Duboscquella sp.
Gonyaulax polygramma
Gyrodinium sp.
Karlodinium sp.
Karlodinium veneficum
Neoceratium sp.
Noctiluca scintillans
Pelagodinium beii
Prorocentrum micans
Prorocentrum minimum
Protoperidinium bipes
Protoperidinium pellucidum
Scrippsiella sp.
Scrippsiella trochoidea
Stoeckeria sp.
Stoeckeria algicida
Woloszynskia sp.
Woloszynskia halophila
绿藻门Phylum Chlorophyta
Bathycoccus sp.
Crustomastix sp.
Dolichomastix tenui
Mamiella gilva
Mantoniella squamata
Micromonas pusilla
Micromonas sp.
Nannochloris sp.
Nephroselmis pyriformis
Ostreococcus tauri
Picochlorum sp.
Prasinophyceae sp. RCC39
Pseudococcomyxa simplex
Pterosperma cristatum
Pycnococcus provasolii
Pyramimonas sp.
Tetraselmis sp.
隐藻门Phylum Cryptophyceae
Geminigera cryophila
Hemiselmis sp.
Hemiselmis cryptochromatica
Katablepharid sp.
Leucocryptos sp.
Leucocryptos marina
Myrionecta rubra
Rhodomonas sp.
Teleaulax gracilis
Teleaulax sp.
Teleaulax amphioxeia
定鞭藻门Phylum Haptophyta
Calyptrosphaera sp. LKM-2007-1
Chrysochromulina sp.
Chrysochromu linaleadbeateri
Emiliania sp.
Haptolina fragaria
Imantonia sp.
Prymnesiumn palpebrale
Tergestiella adriatica
硅藻亚门Phylum Bacillariophytina
Asterionellopsis glacialis
Chaetoceros calcitrans
Chaetoceros muellerii
Chaetoceros socialis
Chaetoceros sp. p442
Cyclotella choctawhatcheeana
Ditylum brightwellii
Entomoneis cf. alata
Hyalosira sp.
Minutocellus sp.
Peridiniumquin quecorne endosymbiont
Pleurosigma planktonicum
Rhizosolenia setigera
Rhizosolenia similoides
Skeletonema sp.
Skeletonema pseudocostatum
Stephanopyxis turris
Thalassiosira sp.
Thalassiosira concaviuscul
Thalassiosira mala
Thalassiosira minima
Thalassiosira oceanica
不等鞭毛门Phylum Heterokontophyta
Apedinella radians
Aureococcus anophagefferens
Bolidomonas pacifica
Dictyocha fibula
Ochromonas sp.
Dictyocha speculum
Florenciella parvula
Heterosigma akashiwo
Paraphysomonas sp.
Pedinella sp. squamata
Phaeocystis antarctica
Pseudochattonell afarcimen
Pseudopedin ellaelastica
Pteridomonas sp.
+表示引物扩增片段的注释结果在3个样品中任意出现一次即标记+
分子生物学技术极大地推动了微型真核藻类多样性的研究。目前, 世界各大海域的微微型浮游生物分子多样性逐步开展研究, 相关基因文库数据也在不断更新和扩充[-]。针对海洋微型和微微型藻类鉴定方面存在的难题, 本实验选择18S rDNA的可变区作为目标基因, 构建高通量测序文库, 应用生物信息学处理数据, 对海洋微型和微微型藻类进行了多样性研究。18S rDNA结构和功能保守, 区分力可达种属水平, 常用于真核生物物种鉴定和系统发生学分析。18SrDNA全长序列交替排列着保守区和可变区, 反映了生物种间的亲缘关系和物种间的差异, 利用了保守区设计引物, 扩增出可变区, 根据不同种属可变区的序列特征进行分类[]。真核生物共含有8个可变区, 其中V4和V9区是目前广泛使用的真核生物标记基因[]。Wuyts等比较分析了3253条核糖体rDNA核酸序列的V4区, 发现该区域为真核生物核糖体rDNA种多样性最大的区域[]。Stoeck和Micah等人研究发现, V4区在区分亲缘关系较近的物种具有较大优势[], 且与V9区相比, V4区得到的实验结果更接近于以18S rDNA全长为目标基因的研究结果[, ]。18S rDNA的V4区变异较大、长度较长、均一性好, 适用于高通量测序技术, 是微微型藻类鉴定的良好目标基因。
本文通过对3对引物的敏感性、特异性进行评估结果显示：引物V4(F/R)对真菌、后生动物、领鞭毛虫目类群的扩增特异性要低于V9(F/R)和C4(F/R), 而对真核藻类的扩增特异性均高于V9(F/R), 扩增红藻门的特异性低于C4(F/R)。为了验证引物V4(F/R)、V9(F/R)和C4(F/R)对海水样品中微型/微微型浮游植物多样性分析的可行性和差异性, 采用IlluminaHiSeq2500测序平台PE250测序, 解析出在种的水平下每对引物对应的平均微型/微微型浮游植物OTUs数, 并与样品的显微镜检测结果进行比较。结果显示, 引物对V4(F/R)在微型/微微型浮游植物种类数鉴定方面优于其他两对引物。高通量测序获得浮游植物种类与显微镜观察结果进行比较, 引物V4(F/R)对镜检结果中的藻类的检出率与引物C4(F/R)相同, 并且都高于引物V9(F/R), 对于样品中物种多样性的挖掘能力, 引物V4(F/R)略高于引物C4(F/R), 且明显高于引物V9(F/R)。
根据注释结果, 在种水平下, 统计3对引物对应的扩增产物的鉴定结果, 3对引物对优势种细小微胞藻、金牛微球藻、密球藻、里氏金色藻、抑食金球藻、赤潮异弯藻等微型和微微型浮游植物的鉴定能力, 引物V4(F/R)与C4(F/R)相近, 二者高于V9(F/R)。其中, 金牛微球藻是一种单细胞绿藻, 直径0.8μm左右, 是目前发现的个体最小、细胞结构简单、基因组结构却十分复杂的自养真核细胞生物[]。Vaquer等[]发现了法国肖泻湖(Thaulagoon)金牛微球藻丰度与铜含量有关, 并发现贝类无法摄食这种藻类。赤潮异弯藻是一种细胞微小、分布广泛、广温、广盐性赤潮藻种, 对其他生物影响较大[-]。抑食金球藻, 呈金光色球形或亚球形, 直径2μm左右, 属于微微型藻类, 是目前发现引发褐潮的主要种类, 对生态环境和渔业养殖影响较大[]。2013年7月在长兴岛近岸海域出现水色异常现象, 经分子检测, 主要优势种为抑食金球藻, 丰度超过107个/L[]。于杰等人利用通用引物扩增18S rDNA可变区V9后, 结合高通量技术, 建立浮游生物多样性高效检测技术, 对渤海海域的4个褐潮多发区的优势藻种进行分析, 发现抑食金球藻和多形微眼藻共同引发了该海域的褐潮[]。
本研究表明, 以18S rDNA的V4区作为目标基因, 设计引物V4(F/R), 借助IlluminaHiSeq 2500 PE250高通量测序平台和生物信息学方法, 建立了海洋微型和微微型藻类高效检测方法。该方法既传承了传统分子技术的特点, 又具有一些独特的优势：测序通量高, 实验流程简单；数据处理快速、准确；灵敏度高；节约成本；适用性广泛。针对海洋中不同水域、水层、时间的微型/微微型浮游植物多样性的研究均适用。
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