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异型巨噬细胞集落刺激因子在人白血病细胞系中的表达及性质
来源：青年人()&更新时间： 16:48:23 &【字体： 】
【摘要】　目的　探讨异型巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)在人白血病细胞系中的表达和性质。方法　采用ABC免疫酶标技术,间接免疫荧光染色, 流式细胞计数,蛋白免疫印迹和反向酶联DNA-蛋白质相互作用分析技术研究了4株人白血病细胞系(J6-1、J6-2、K562、HL-60)和正常人外周血单个核细胞M-CSF的分布、表达及其分子大小。结果　正常人外周血单个核细胞未见M-CSF的表达，经植物血凝素刺激后有低水平的表达；4株人白血病细胞系的M-CSF都高表达,分布于细胞膜、细胞质和细胞核；4株细胞系的胞质和胞核M-CSF阳性率分别为65.7%、45.4%、36.5%、72.5%；胞膜M-CSF阳性率分别为71.6%、69.7%、42.7%、57.4%； 显著高于正常人外周血单个核细胞的表达水平。胞质中相对分子质量为14 000、16 000、20 000和44 000的4种M-CSF分子,而胞核中只有16 000和20 000两种M-CSF分子；抗M-CSF单抗能显著抑制4株白血病细胞系细胞的增殖,其抑制率随细胞的膜结合型M-CSF表达水平的升高而增强；M-CSF在体外有结合DNA的能力。结论　膜结合型M-CSF是白血病细胞增殖的一个刺激因子；M-CSF在人白血病细胞系的表达呈异质性和多样性，可能是一种DNA结合蛋白,在造血细胞转化和癌变过程中可能有重要的病理学意义。　　【关键词】　白血病；　巨噬细胞集落刺激因子；　DNA结合蛋白质类；　肿瘤细胞，培养的
The expression and effects of isoforms of macrophage colony stimulating factor in human leukemic cell lines
TANG Shengsong, DU Xiping, CHEN Guibin, RAO Qing, GENG Yiqi, WU Kefu.(State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology, Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300020, China)
　　【Abstract】　Objective　To explore the expression and effects of isoforms of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) in human leukemic cell lines. Methods　Three normal human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and 4 human myelomonocytic leukemic cell lines including J6-1, J6-2, K562 and HL-60 were studied using ABC immunoperoxidase assay, indirect immunofluorescene staining, flow cytometry, Western blot and reverse enzyme-linked DNA-protein interaction assay (reverse ELDIA). Results　M-CSF was noticed to be localized in the cytoplasm, nucleus and at the cell membrane in 4 human expression of M-CSF was not detected in normal human PBMCs without PHA stimulation. Human PBMCs stimulated by PHA expressed a low level of M-CSF. Frequencies of membrane bound M-CSF expression in J6-1，J6-2，K562 and HL -60 were 71.6%，69.7%, 42.7% and 57.4% respectively. Frequencies of cytoplasm and nucleus associated M-CSF were 65.7%, 45.4%, 36.5% and 72.5% respectively. The cytosolic bound M-CSF was expressed in J6-1 cell as four isoforms with a molecular weight of 14 000, 16 000, 20 000 and 44 000. While nucleus associated M-CSF expressed as two isoforms with a molecular weight of 16 000 and 20 000. Anti-M-CSF monoclonal antibody could dramatically inhibit proliferation of leukemic cells and its inhibitory effect was related to the levels of membrane bound M-CSF expression in leukemic cells. Reverse ELDIA showed that M-CSF could bind with DNA in vitro. Conclusions　Expression of M-CSF isoforms is heterogeneous and polymorphous in leukemic cells. Membrane bound M-CSF is crucial for the proliferation of leukemic cells, which might be a DNA-bound protein and could be involved in the transformation and tumorigenesis of hematopoietic cells.　　【Key words】　Leukemia；　Macrophage colony-stimulating factor；　DNA-binding proteins；　Tumor cell，cultured
　　巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)又称集落刺激因子-1(CSF-1)是造血系统细胞因子调控网络中的一个重要成员,与其他集落刺激因子比较,具有多功能性和表达产物的多样性。已经发现M-CSF至少有可溶性M-CSF(s-M-CSF)、膜结合型M-CSF(m-M-CSF)、基质结合型M-CSF(PG-M-CSF)等3种不同的表达形式。M-CSF与疾病的关系引人嘱目。在白血病前期、白血病、妇科肿瘤、动脉粥样硬化、肾功能衰竭等多种疾病的s-M-CSF表达水平明显升高,但机制不清［1］。我们实验室的工作表明:m-M-CSF及其受体能介导J6-1细胞的自身并置性刺激［2，3］,且有受体样作用［4］,在某些情况下可出现胞质结合型(c-M-CSF)和胞核结合型M-CSF(n-M-CSF)等细胞结合型M-CSF异型体；对病人标本的研究发现，M-CSF在白血病［5］、淋巴瘤［6］、肝癌［7］细胞中有不同水平表达。为探讨细胞结合型M-CSF在白血病中的病理学意义及其调控细胞增殖的机制,我们以人白血病细胞系为模型研究了m-M-CSF、c-M-CSF、n-M-CSF等细胞结合型M-CSF在人白血病细胞系中的表达及其性质。
材料与方法
　　1.细胞系与细胞培养:4株人白血病细胞系,J6-1,J6-2来源于人粒-单型白血病，为本室建立的粒-单型白血病细胞系［8］，HL-60为来源于人急性粒细胞白血病的髓样细胞系，K56为来源于人慢性白血病急变期胸水的髓样细胞系。用RPMI 1640常规培养, 其中J6-1和J6-2细胞系加20%胎牛血清,HL-60和K562 细胞系加10% 胎牛血清。　　2.外周血单个核细胞的分离:3例正常人静脉取血,肝素抗凝,按1∶1加入淋巴细胞分离液,以250×g离心10 min,取单个核细胞涂片,ABC免疫酶标染色；或置含20%胎牛血清的RPMI 1640培养液中常规培养，并用20 ng/ml的植物血凝素（PHA）处理48 h以刺激细胞表达M-CSF。　　3.ABC免疫酶标技术:按常规方法进行。抗M-CSF单克隆抗体B5的制备、筛选和鉴定见文献［9］,其特异性结合区为M-CSF的氨基端。生物素标记的羊抗小鼠单抗,卵白素标记的辣根过氧化物酶为Vector产品。　　4.间接免疫荧光染色和流式细胞计数:参照文献［10］稍加改进:取4×105/ml细胞分别加入2只离心管中,用Hanks液(内含2%胎牛血清)洗细胞3次;多聚甲醛固定15 min,一管用Hanks液洗3次,另一管用Hanks液洗2次再用含0.1%saponin(Sigma公司)的Hanks液洗1次,分别用B5(10 μg/ml)孵育40 min；用Hanks液洗2次,含0.1% saponin的Hanks液洗1次；异硫氰酸荧光素（FITC）标记的大鼠抗小鼠IgG单抗(7 μg/ml,Vector公司)孵育30 min；Hanks液洗3次；用非荧光标记的同型抗体(Vector公司产品)阻断作为阴性对照,上述步骤皆在4°C进行；然后在流式细胞计数仪(Becton Deckinson公司)计数10 000个细胞。　　5.细胞质和细胞核蛋白的提取与蛋白免疫印迹(Western blot):参照文献［11］稍加改进,取3×108/ml细胞,PBS洗3次,低渗缓冲液(10 mmol/L Hepes pH 7.9,1.5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L KCl，0.2 mmol/L PMSF,10 μg /ml aprotinin, 10 μg /ml leupeptin)洗细胞1次, 4℃,1 850×g离心,细胞重悬低渗缓冲液,冰上溶胀30 min,匀浆10 min, 4°C,3 300 ×g离心15 min,上清为胞质粗提取物,沉淀物依次加入低盐缓冲液［20 mmol/L Hepes pH 7.9,25%甘油,1.5 mmol/L MgCl2,20 mmol/L KCl,0.2 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)0.2 mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）,10 μg/ml aprotinin,10 μg/ml leupeptin］和高盐缓冲液(20 mmol/L Hepes pH 7.9,25%甘油,1.5 mmol/L MgCl2,1.2 mol/L KCl,0.2 mmol/L EDTA,0.2 mmol/L PMSF,10 μg/ml aprotinin,10 μg/ml leupeptin)匀浆,4°C,16 500×g离心上清为胞核提取物；胞质粗提取物加入10×胞质提取缓冲液(0.3 mol/L Hepes,1.4 mol/L KCl,0.03 mol/L MgCl2)，4℃,100 000×g离心1 h,上清为胞质提取物。十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,封闭;B5孵育,洗膜；辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体孵育，洗膜；0.1% NiCl的DAB-H2O2显色。　　6.抗M-CSF单抗B5对细胞生长的抑制试验:将细胞以4×105/ml接种于24孔培养板,按1∶5、1∶10,1∶20,1∶40加入B5,对照管用PBS替代B5,37℃,5% CO2培养48 h，锥虫蓝（又称台盼蓝）染色,细胞计数,抑制率按公式计算: 抑制率=（对照组细胞数-实验组细胞数）/对照组细胞数×100%。　　7.反向ELDIA(reverse enzyme-linked DNA/protein interaction assay):参照文献［12］稍加改进：饱和酚抽提DNA,用核酸内切酶EcoRI 和BamHI分别消化,所得片段主要位于200～20 000 bp。提取胞质和胞核总蛋白,以G-200葡聚糖柱层析蛋白粗提纯,收集目的产物作为抗原粗提物，以消化的DNA(300 ng DNA/孔)包酶标板,50℃孵育5 h洗板5次,每次3 min,经封闭后,PBS洗3次,每次3 min。加入抗原粗提取物,加入2×DNA-蛋白质结合缓冲液(pH 7.4,100 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L NaCl,10 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)10 mmol/L EDTA,50%甘油)室温,1h,PBS 3次，每次3 min,加入B5,37℃ 2 h, PBS 3次,每次3 min, 加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体(Vector产品),37°C,孵育1 h,PBS洗5次,每次3 min, 加入OPD显色液(pH 5.0柠檬酸缓冲液13.2 ml,OPD 5.3 mg,25 μl H2O2)避光15 min,用2 mol H2SO4中止反应。在酶标仪上,用492 nm波长比色。
图1，2　M-CSF在白血病细胞系中的表达，M-CSF表达阳性定位分布于细胞膜(图1，↑),细胞质和细胞核(图2，↑) ABC法×200
　　8.M-CSF与DNA的结合反应：从J6-1细胞中提取DNA ,用限制性内切酶将DNA切成200～20 000 bp小片断，并以J6-1细胞的胞质和胞核含M-CSF的组分作为抗原，做反向ELDIA分析，测胞质和胞核的不同M-CSF稀释浓度（1∶32、1∶16、1∶8、1∶4、1∶2）的J6-1细胞的提取液结合DNA的吸光度（A，曾称光密度OD），绘制其比值曲线。　　9.统计学分析：采用非配对t检验。
　　1.M-CSF在人白血病细胞系的表达与分布：间接免疫荧光染色和流式细胞计数分析显示:在正常人外周血单个核细胞未见M-CSF表达，经PHA刺激后可见M-CSF表达；4株细胞系均表达M-CSF,并显著高于PHA刺激的正常人外周血单个核细胞的表达水平（表1）。ABC免疫酶标显示:白血病细胞的
表1　M-CSF在细胞各组分中的表达结果
M-CSF表达百分率(%，±s)
胞膜阳性率
胞核和胞质阳性率
93.8±2.1**
71.6±3.2**
65.7±7.4**
85.1±4.7**
69.7±3.7**
45.4±5.8*
58.7±2.6*
42.7±2.2*
36.5±6.3*
80.9±2.8**
57.4±1.5**
72.5±8.2**
　　注：(1)本实验一式三份，未用PHA刺激的正常人外周血单个核细胞均为阴性，(2)PBMC为正常人外周血单个核细胞，(3)与PBMC+PHA组比较：*P&0.05，**P&0.01胞膜,胞质和胞核均可测出M-CSF（图1，2）,除HL-60外其他细胞系以细胞膜阳性为主。
　　2.J6-1细胞中M-CSF的分子大小：经SDS-PAGE和蛋白免疫印迹显示: J6-1细胞内有相对分子质量不等的M-CSF,其中胞核中有16 000、20 000,胞质中有14 000、16 000,20 000和44 000的M-CSF(图3)。
C：J6-1细胞质提取液，N：J6-1细胞核提取液图3　蛋白免疫印迹检测结果
　　　3.抗M-CSF单抗B5对白血病细胞增殖的抑制作用：活细胞计数结果: B5能显著抑制4株细胞的增殖和生长，其最大抑制率分别为64.4%、52.6%、37.6%、48.7%(图4),抑制作用有浓度依赖性,并随白血病细胞表达m-M-CSF的水平增高而增强;能抑制J6-1和J6-2的成丛状生长。
图4　抗M-CSF单抗B5对白血病细胞增殖的作用
　　4.M-CSF与DNA的结合反应：胞质和胞核的M-CSF的A值分别是对照组的2.1倍和1.8倍,并且随M-CSF浓度的增高其A值增高,表明M-CSF与DNA的结合是特异性的,说明M-CSF具有结合DNA的能力。
　　M-CSF是一个重要的造血调控因子,在其受体的介导下,能调控单核/巨噬细胞增殖,分化;并参与妊娠、骨组织形成,动脉粥样硬化、妇科肿瘤等生理和病理过程［1］。它在正常细胞中的表达具有分化阶段特异性,细胞类型特异性和细胞周期特异性等特点,肿瘤细胞的原癌基因表达则失去上述特点,表现为高表达或过度表达,表达程序发生紊乱,不具有细胞周期特异性等。我们的结果表明,正常人外周血单个核细胞不表达M-CSF,而在4株人白血病细胞系细胞出现不同程度的高表达,并显著高于PHA刺激的正常人外周血单个核细胞的表达水平，提示白血病细胞中M-CSF基因表达紊乱。　　M-CSF是单基因编码的产物,由于其mRNA的选择性剪接和复杂的转录后调控,有s-M-CSF,m-M-CSF,PG-M-CSF 3种异型体,分别存在于血清,细胞膜和细胞基质中［1］,不同的异型体功能不同,且与疾病的发生相关。在正常情况下,M-CSF在细胞内合成,完成功能后在细胞内迅速降解,因此外周血单个核细胞内不能检出M-CSF。我们在白血病细胞系检出了m-M-CSF,c-M-CSF和n-M-CSF,免疫印迹显示胞核存在相对分子质量不等的M-CSF分子,提示人白血病细胞系M-CSF表达的多样性和异质性。　　m-M-CSF是通过选择性剪接形成的跨膜分子,因其氨基酸序列中缺如蛋白酶识别位点不能被酶切而滞留在细胞膜上。m-M-CSF主要通过受体样机制和并置性刺激发挥作用［2，3］,本室以前的工作证明:m-M-CSF能介导J6-1的并置性刺激,是J6-1细胞成丛状生长的一种调控方式。我们用M-CSF的单抗B5阻断白血病细胞膜上的m-M-CSF,使4株人白血病细胞的增殖明显受到抑制,最高抑制率可达64.6%，且B5能抑制J 6-1和J6-2的成丛状生长，其抑制率与细胞表达的m-M-CSF水平呈正相关。由于B5与m-M-C SF结合可导致自家并置性刺激机制减少,m-M-CSF受体样作用受阻,细胞增殖受到抑制, 因此m-M-CSF介导的并置性刺激和受体样信号是上述白血病细胞增殖的一种重要的调控机制。　　细胞因子通常以可溶性形式存在于细胞外,通过与相应的膜受体结合使膜受体活化而发挥生物学功能。晚近发现许多细胞因子存在于细胞质和细胞核内,这些细胞内,尤其是核内的细胞因子已引起广泛的关注。由于核膜的存在,真核细胞细胞质的蛋白质入核受到核孔的严格控制,通常相对分子质量&44 000时能以扩散的方式进入细胞核,而分子更大的则借助核定位序列入核［13］。本结果显示:J6-1细胞质中检出相对分子质量为14 000、16 000、20 000和44 000的M-CSF，而细胞核内只检出16 000和20 000的M-CSF,提示M-CSF可能是以扩散的方式进入细胞核的。本文结果显示细胞核内有M-CSF存在。我们提取胞质和胞核的蛋白质,采用反向ELDIA分析表明,M-CSF具有DNA结合能力,提示M-CSF可能具有转录因子样的作用,至于M-CSF的DNA结合的特异性序列,是否具有转录激活作用等正在研究中。
（本文编辑：霍临明）
基金项目：国家自然科学基金资助项目()通信作者：吴克复作者单位：唐圣松（300020 天津,中国医学科学院 中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室）杜喜平（300020 天津,中国医学科学院 中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室）陈桂彬（300020 天津,中国医学科学院 中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室）饶青（300020 天津,中国医学科学院 中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室）耿以琪（300020 天津,中国医学科学院 中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室）吴克复（300020 天津,中国医学科学院 中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室）
1，Fixe P, Praloran V. M-CSF: haematopoietic growth factor or inflammatory cytokine? Cytokine, -37.2，Wu KF, Rao Q, Zheng GG. et al. Enhancement of J6- 1 human leukemic cell proliferation by cell-cell contact mechanism: role of an M- CSF-like membrane-associated growth factor MAF-J6-1. Leuk Res, -849.3，Wu KF, Rao Q, Zheng GG. et al. Enhancement of J6-1 human leukemic cell proliferation by membrane-bound M-CSF through a cell-cell contact mechanism Ⅱ.Role of an M-CSF receptor-like membrane protein. Leuk Res , -60.4，Wu KF, Rao Q, Zheng GG, et al. Receptor role of membrane-bound macrophage colony-stimulating factor. Chin Sci Bulletin, 4-1037.5，张倩,薛艳平,宋玉华,等.巨噬细胞集落刺激因子及其受体在造血细胞中的表达. 中华血液学杂志,-251.6，Zheng GG, Wu KF, Geng YQ, et al. Expression of membrane- associated macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) in Hodgkin's disease and other hematologic malignancies. Leuk Lymphoma, -344.7，Yang WQ, Wu KF, Zhao MH, et al. Coexpression of macrophage colony-stimulating with its receptor in human hepatoma cells and its potential roles. Chinese J Cancer Res, -84.8，吴克复，张一泉，齐淑玲，等. 粒-单型人白血病细胞系的建立及其生物学性质. 遗传学报，6-143.9，耿以琪,饶青,孔建,等.白血病细胞膜相关因子(MAF-J6-1) 单克隆抗体的制备及性质.中华血液学杂志,-632.10，Sander B，Hoiden I, Anderson U, et al. Similar frequencies and kinetics of cytokine-producing cells in murine peripheral blood and spleen. Cytokine detection by immunoassay and intracellular immunostaining. J Immunol Methods, -214.11，Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. Short protocol in molecular biology. third ed. John Wiley & Sons: Inc: -11.10.12，Benotmane AM, Hoylaert MF, Collen D, et al. Noisotopic quantitative analysis of protein-DNA interactions at equilibrium. Anal Biochem, 5-1262.13，Jans DA, Hassan G. Nuclear targeting by growth factors, cytokines, and their receptors: a role in signaling? Bioessays, -411.
（收稿日期：）
&&&&责任编辑：蒲公英&
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