食品中致病菌PCR检测方法-沙门氏菌_百度文库
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食品中致病菌PCR检测方法-沙门氏菌
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PCR技术在食品安全检测上的应用
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3秒自动关闭窗口FTA滤膜用于PCR检测肉中的沙门氏菌--《河北农业大学》2009年硕士论文
FTA滤膜用于PCR检测肉中的沙门氏菌
【摘要】：
食品安全突发事件频率高是近年来食品安全问题的一个显著特点,沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一,其病原沙门氏菌属肠道细菌科,包括那些引起食物中毒,导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。人畜感染后可呈无症状带菌状态,也可表现为有临床症状的致死疾病,它可能加重病态或死亡率,或者降低动物的繁殖生产力。为确保食品安全与食品贸易,需要大力加强食品检验的力度,迫切需要建立快速、灵敏的沙门氏菌的检验方法。
本研究以沙门氏菌的invA基因为靶基因,选择特异性引物,进行PCR扩增,检测肉中沙门氏菌。对PCR反应体系中镁离子浓度、引物添加量及退火温度和循环数进行优化,以确定适宜的PCR反应体系和扩增程序,其适宜反应体系为: 6μL 10×PCR buffer,4μL dNTPs混合物,5.0μL Mg2+ (25mM),2μL 10μmol正向引物,2μL 10μmol反向引物,0.25μL(5 U/μL)Taq,20.75μL水,总反应体系为50μL;其适宜的PCR扩增程序为:PCR反应采用冷启动,94℃预变性5变性94℃1 min～退火58℃0.5 min进行35个循环。PCR反应产物在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像系统观察结果。对扩增产物进行了测序,PCR扩增产物序列与文献报道的靶基因序列的同源性达100%,从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物。本研究共检测了16株菌,以验证引物的特异性,结果表明:4株沙门氏菌均为阳性结果;12株其它非沙门氏菌菌株均为阴性结果。因此该引物特异性强,可用于检测沙门氏菌。
利用FTA滤膜,采用PCR技术可直接检测肉及肉制品中的沙门氏菌,无需增菌,灵敏度高。在采用浮选与溶剂萃取相结合方法的基础上,使用FTA膜可高效地从鲜肉中提取沙门氏菌的DNA,消除PCR反应的抑制因子。以沙门氏菌编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的invA基因为靶基因,经过PCR扩增得到376bp的产物。经过DNA测序证实该产物为目的扩增产物。使用FTA滤膜处理样品,再通过PCR方法检测沙门氏菌,猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉匀浆液的检出限均为101cfu/mL,可在6h内完成对肉中沙门氏菌的检测,比目前普遍采用的先增菌再进行PCR检测的方法缩短了12～24h。实际检测了72份样品,同时与GB/T3方法做比较,PCR方法的检出率为27.8%,检出时间为6h,GB/T3方法检出率为22.2%,检出时间为5d,结果表明FTA滤膜用于PCR检测肉中沙门氏菌检出率高,耗时短。使用FTA滤膜法制备模板DNA,为食品中的致病菌快速检测构建了一个技术平台。
【关键词】：
【学位授予单位】：河北农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2009【分类号】：TS251.7【目录】：
Abstract5-9
1 引言9-21
1.1 立题背景及意义9-10
1.2 沙门氏菌菌简介10-12
1.2.1 沙门氏菌生物学性状10
1.2.2 沙门氏菌抗原构造与分类10-11
1.2.3 沙门氏菌的流行病学11-12
1.3 沙门氏菌检测研究现状12-15
1.3.1 沙门氏菌传统检测方法12-14
1.3.2 以抗体为基础的检测方法14
1.3.3 以核酸为基础的方法14-15
1.4 沙门氏菌检测常用的目的基因15-17
1.4.1 编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的inv 基因序列15
1.4.2 沙门氏菌侵袭基因正调节蛋白hilA15-16
1.4.3 编码沙门氏菌鞭毛蛋白的基因序列16
1.4.4 与沙门氏菌质粒毒力相关的SPV 基因序列16
1.4.5 编码菌毛的fimA 基因序列16
1.4.6 编码沙门氏菌LPSO 抗原的rfb 基因16
1.4.7 编码与蛋白质结合的DNA 的hns 基因16-17
1.4.8 16S rRNA 基因17
1.5 FTA 卡的介绍17-20
1.5.1 基因的储藏18
1.5.2 用于医学检测18
1.5.3 用于植物DNA 的提取18-19
1.5.4 用于食源性致病菌的检测19-20
1.6 研究内容20-21
2 材料与方法21-28
2.1 试验材料21-22
2.1.1 菌株21
2.1.2 培养基21
2.1.3 仪器与设备21-22
2.1.4 生化试剂与样品22
2.2 方法22-28
2.2.1 沙门氏菌培养22-23
2.2 2 利用FTA 滤膜制备用于肉中沙门氏菌PCR 检测的模板23-24
2.2.3 PCR 检测肉中人工污染的沙门氏菌以确定检出限24-25
2.2.4 肉中沙门氏菌DNA 提取方法比较25-27
2.2.5 实际样品检测27-28
3 结果与分析28-37
3.1 PCR 反应条件优化28-32
3.1.1 最适Mg~(2+)浓度选择28
3.1.2 最适退火温度选择28-29
3.1.3 最适引物浓度选择29-30
3.1.4 最适反应循环数选择30
3.1.5 PCR 反应的热启动与冷启动比较30-32
3.2 PCR 引物的特异性32
3.3 利用FTA 滤膜提取沙门氏菌DNA 进行PCR 检测的灵敏度32-33
3.4 PCR 产物测序33
3.5 利用FTA 滤膜制备检测肉中沙门氏菌的PCR 模板33-35
3.6 PCR 检测人工污染肉中的沙门氏菌以确定检出限35
3.7 肉中沙门氏菌DNA 提取方法比较35-36
3.8 实际检测结果36-37
4 讨论37-40
4.1 沙门氏菌检测37
4.2 PCR 反应程序优化37
4.3 DNA 模板的制备方法—FTA 滤膜方法37-38
4.4 DNA 模板的制备方法比较38
4.5 与其它检测方法的比较38-40
参考文献41-46
硕士期间发表学术论文47-48
作者简介48-49
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实时荧光定量PCR法测定禽蛋中沙门氏菌
为建立禽蛋中沙门氏菌的荧光PCR法检测方法，根据invA基因序列设计实时荧光定量PCR引物和探针，常规方法提取菌体DNA，以55℃为退火温度进行荧光PCR扩增，并进行方法学考察。结果表明：阳性对照品和沙门氏菌为模板的样品有明显扩增曲线。其他菌株为模板的样品无扩增曲线，特异性、灵敏度和重现性考察提示实时荧光定量PCR方法符合检测方法学要求。实时荧光定量PCR法的应用，提高了禽蛋制品中沙门氏菌检测的灵敏度、缩短了检测时间、简化了检测流程。
作者单位：
安徽国家农业标准化与监测中心,安徽合肥,230051
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