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【求助】双酶切后电泳为什么目的条带这么弱？
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这个帖子发布于4年零237天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
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pGEMT/EGFP质粒用KpnⅠ,EcoRⅠ双酶切后载体条带还好，为什么目的条带（下面的条带）这么暗？请高手们解释一下，谢谢！如下图marker用的不合适，将就一下吧。第一排：左起 ㈠ DL2000;㈡
样本2；㈢ 样本3①；㈣ 样本3②；㈤样本4①；㈥样本4②；㈦样本5①；㈧ 样本5②；㈨-（十三）分别为为样本7 质粒，双酶切，KpnⅠ单切,EcoRⅠ单切；（十四）wide range500-15000第二排：左起 ㈠ DL2000;㈡-㈥分别为为样本8 质粒，双酶切，KpnⅠ单切,EcoRⅠ单切；（㈦wide range500-15000
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meixue１０２４ edited on
小提的吗？第一，你的质粒本身就不是太亮，以DNA marker最亮的150ng，一般50ng计算，你的质粒也就是50ng稍多点，以pgmt 3000bp，GFP750bp,外片大概也就是12、3ng，而EB的灵敏度是10个ng，要是酶切效率再差点，就更看不见了。第二，小提的质粒蛋白太多的话会影响酶切效率。建议加大酶切的质粒量。小提的时候操作手法应该更精细一些。
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质粒量本来就太少了，我也遇到过这种情况，很正常，加大量就OK了
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我们实验室的也有遇到这种情况的，原因：1.可能由于目的片段小 2.质粒弱 解决办法：提质粒时要多收菌， 使质粒的带更亮 ，酶切体系要加大，并且并行多做五六管 ，回收时合管，这样你试一下，下一步如果连接的话，你的目的基因量要多加！
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原因：提取的质粒太少 办法, 增加菌量
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1.正常，可以重新双酶切加大重组质粒的体积，条带会相对变亮。不知道你的载体和目的片段分别是多大的，如果载体比目的片段大很多的话，自然会比目的片段亮很多。2.如果酶切完要回收连接的话，可以重新摇菌、提取质粒（提取第一步倒入菌液离心弃上清后再加一管菌液离心弃上清，最后一步洗脱时Elution buffer 可以适当减少，然后洗脱两次）增加重组质粒的浓度，酶切鉴定时自然会亮很多，也利于后面的连接。
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衷心谢谢大鹏鸟,wodezxn,zhangjunbo666三位！再一次感到了园园的温暖，以前总是埋怨为什么实验室的就我自己做这个破实验，现在已经不这么想了，这对我也是一种考验吧。从园子里学到很多很多知识 并指导做实验，有问题时又有各位前辈指导，真的很感谢丁香园给我们这么一个学习的的平台！
呵呵，有点扯远了。归根结底，主要是我的质粒浓度太低的缘故，我是用的OMEGA的少量抽提的试剂盒，一般用5ml菌液来提（说明书上写的是1.5-5ml)，也提过很多次了，提后测得浓度一般都是50-500ug/ml之间。结果很不幸，这次用的T/EGFP的浓度多是位于50-100之间，浓度是真的好低，所以双酶切时质粒的量加的是0.5ug。不知该如何提高浓度呢？
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xdd0518 1.正常，可以重新双酶切加大重组质粒的体积，条带会相对变亮。不知道你的载体和目的片段分别是多大的，如果载体比目的片段大很多的话，自然会比目的片段亮很多。2.如果酶切完要回收连接的话，可以重新摇菌、提取质粒（提取第一步倒入菌液离心弃上清后再加一管菌液离心弃上清，最后一步洗脱时Elution buffer 可以适当减少，然后洗脱两次）增加重组质粒的浓度，酶切鉴定时自然会亮很多，也利于后面的连接。xdd0518 ：thank you.
按照你的说法，就是2管菌液合为一管提喽，那加的试剂如Solution Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ也应该加倍，要不然，会消化不完全的不？
我有一个问题没怎么搞懂，就是加了Solution Ⅱ后的混合液正确的应该是什么样的的呢？我的绝大多数是澄清的，但有时是那种有点粘粘的感觉，不知什么原因呢，可以解释一下不？
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是要加倍的否则无法充分溶解，加了Solution Ⅱ后的混合液应该是澄清的，粘粘的混合液可能是第一步没有充分溶解开。
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xdd0518 是要加倍的否则无法充分溶解，加了Solution Ⅱ后的混合液应该是澄清的，粘粘的混合液可能是第一步没有充分溶解开。谢谢你，xdd0518。我下次做时要注意了。还有个问题想问一下，我用ECOR Ⅰ、XHOⅠ分别双酶切pcDNA3.1和我的一个目的片段1650bp（经测序二者均正确）,胶回收后连接转化，平皿过夜长得菌落不错，连接比例做了3个梯度，各挑取了5个单克隆摇菌，用当初合成目的片段的引物PCR,结果电泳无任何条带。不足的是没有做空白质粒对照，可以肯定的是感受态没问题，皿是铺了有20天了，之前用是我、没问题的，不知原因出在哪里，帮忙分析者一下~
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向各位高手学习了，谢谢。
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关于丁香园酶切后电泳图(酶切,电泳图,质粒,条带) - DNA技术 - 生物秀
标题: 酶切后电泳图(酶切,电泳图,质粒,条带)
摘要: [酶切后电泳图(酶切,电泳图,质粒,条带)] 求战友们帮忙！我的基因2 4k，连在PGEM-Teasy载体上，现在用XbaI和SacII进行双酶切，理论上切下的应是2 4K的目的基因和3k的载体，然后我就可以回收目的基因做后面的实验。4月17号酶切图如下（这日的质粒浓度61 3ng μl,260 280是2 07）：??可以看得出来酶切成功了，但是由于条带太弱，所以没有回收，重新提了质粒用更大的酶切体系来做，然后问题就出现了，4月18号做的双 关键词:[酶切 质粒 条带 电泳图 双酶切 单酶切 目的基因]……
求朋友们帮忙！我的基因2.4k，连在PGEM-Teasy载体上，现在用XbaI和SacII进行双酶切，理论上切下的应是2.4K的目的基因和3k的载体，然后我就可以回收目的基因做后面的实验。4月17号酶切图如下（这日的质粒浓度61.3ng/μl,260/280是2.07）：??可以看得出来酶切成功了，但是由于条带太弱，所以没有回收，重新提了质粒用更大的酶切体系来做，然后问题就出现了，4月18号做的双酶切就完全没有条带，包括点的对照样（未酶切的质粒）：质粒都是用的天根小提试剂盒提的，4月18号这次的浓度有快400ng/μl，260/280是2.04（最近实验室用这个试剂盒提出来的数值都偏大，这个也不知道为什么，求解！）酶切体系做的是120μl的。担心是质粒提取的问题，今天又重提了一遍质粒，这次浓度不高，只有60多ng/μl，260/280是2.03，今天双酶切依然是没有条带（点样时仍然点了未酶切的质粒做对照，也无条带）之后我又做了质粒的单酶切来检测（XbaI和SacII的单酶切都做了），结果又是没有条带，我要崩溃了。。。我现在不清楚是哪一步出了问题，质粒提的不好？那为什么17号的那个酶切成功了呢？或者是酶切buffer里有DNA酶？真的很困惑。本人是分子实验的菜鸟，现在也没有金币可以悬赏，希望里有看到的师兄姐们不吝赐教，感激不尽！
回复Do transformation again to get new colonies. Grow some colonies for miniprep using reagent Solution I, II, III made by yourself. After Solution III, spin, and add ethanol to precipitate the supernatants.Run restriction enzy******estions to verify the plasmid DNA in quality ans in quantity. Make midprep or maxiprep for subcloning. Don"t use miniprep DNA for that.回复我也是才鸟，最近实验室的连接一直做不出来，老板也做了多次，没成功，在一步步排除的问题。。。回到正题，你的问题解决了吗？为什么提完质粒没有跑个电泳看一下呢？回复我也是才鸟，最近实验室的连接一直做不出来，老板也做了多次，没成功，在一步步排除的问题。。。回到正题，你的问题解决了吗？为什么提完质粒没有跑个电泳看一下呢？问题解决了，是质粒提取的问题，之后我用的菌液是放置了一段时间后再摇菌得到的菌液，可能质粒已经丢失了。提完质粒后我有用单酶切跑电泳啊，当时都是没有条带的。回复问题解决了，是质粒提取的问题，之后我用的菌液是放置了一段时间后再摇菌得到的菌液，可能质粒已经丢失了。提完质粒后我有用单酶切跑电泳啊，当时都是没有条带的。好晕哪，是不是摇菌的时候没加(antibiotic)啊？要不然怎么会质粒丢失？回复每一步都不能错啊！现在深有感触。科研需要净心。
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电话：021-酶切产物电泳检测无条带这是怎么回事?最近做酶切,出现很奇怪的现象.我四种要酶切的样品,分别进行单酶切和双酶切,结果电泳结果是只有一个可以切出1KB片段的样品有条带,其他几个只需要切出一个末端的样品却什么都没有.酶切体系绝对一样,我是先总量混合在分装的.不是没切开,电泳结果显示的是什么都没有就像直接点loading buffer进去一样.我的酶切体系是这样的.双酶切：12ul ddH2O、6ul tango buffer、1ul BamH1、1ul Hind3、10ul 样品质粒单酶切：16ul ddH2O、3ul BamH1 buffer、1ul BamH1、10ul 样品质粒顺便问下,我那个1KB的条带拖尾严重,是不是可能因为我酶切时间过长?我一般都是过夜12小时左右关于质粒纯度问题，我四种样品都是用一种试剂盒提的。而且如果是纯度问题应该是随机出现在四种中，但是我两次都只有那个1KB的片段有条带。质粒的上样量也没问题，我原始质粒对照上样量2ul条带很亮，酶切体系里质粒10ul稀释到30ul，上样量5ul，实际含量应该和原始质粒上样量差不多。
建议你做如下改进：1.原始质粒上样2ul,电泳检测,确定质粒质量没问题；2.所有酶切体系均改为10ul,其中质粒2ul,酶0.1ul （双酶切时另一种酶也加0.1ul ）,buffer终浓度为 1×,剩下为去离子水.酶切时间为4小时左右.3.电泳用的凝胶最好为新鲜配制的,浓度视质粒大小而定,一般为1%；电泳的缓冲液最好也是新鲜配制的,电泳电压适当.1KB的条带拖尾严重,可能是凝胶不新鲜,或者是电泳时电压过高,或者是酶切时间过长.上述建议中已经给出解决方法.至于你说的奇怪现象,可能质粒已经降解,也可能是酶切过久导致降解,也可能是枪头或者离心管等器材污染,总之保证一切是新鲜的,再做一次.
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1、我不建议酶用1ul，商品化的酶都是浓缩酶，0.1-0.2就足够。太多的酶可能会有星活性。2、如果DNA提取质量高，没有蛋白污染，那么过夜没问题，否则也不建议超长时间酶切；3、用多少质粒不是看体积，只要100ng就看得见，先定量质粒。做双酶切，如果2个片段都不太小，那么用200ng的质粒保证可以看见。你的质粒DNA加太多了所以酶切体系可以改改，减少DNA和酶的量，减...
扫描下载二维码柱提质粒后有几种形态呢?我双酶切质粒,有四条带,最前面是400多的目的带,三条差不多的载体带这三种分别是什么?双切下的,单切下的,和开环?还是?我要的是双切好的载体
柱提取质粒后,未经酶切的正常状态的应该有3个条带,分别是共价闭合超螺旋DNA、开环DNA和线状DNA,有时候会出现极淡的二聚体超螺旋带.双酶切质粒后,要看你质粒上有几个酶切位点来决定酶切后的带型.但是你要首先保证你的质粒是被完全酶切的.如果你能保证完全酶切,那么条带数应等于你的酶切位点数.
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【求助】质粒提取出来后，酶切如下条带，急求原因
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我的质粒是从top10菌液，9000多bp，酶切后全是拖行条带，测浓度约120ug/ml, 酶使用的是fermentas的，求教为什么。电泳上样10ul。1%的胶。120v 25min中间那个高的是我没有加酶的dna对照。37度1h，20ul体系，酶的量为1~2ul
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楼主跑电泳没有加MARKER吗？单从电泳结果来看，电泳本身就有问题。即使酶切不成功，绝不会出现这么严重的拖尾现象。检查一下你的电泳缓冲液有没有问题？琼脂糖有没有问题？先把电泳的问题解决了再分析酶切的问题。对于酶切，首先确定你的质粒确实有该酶切位点，然后使用的酶没有失效。如果这两点都没问题，再考虑甲基化的问题，不过从电泳图片来看，酶切应该是成功的，只是拖尾太严重了。很有可能是电泳缓冲液的问题，重新配置吧。
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图看起来像DNA降解带，不像质粒，有可能质粒本身有问题，有可能提取质粒溶液2加多了，质粒降解了
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这么四不像的乱糟糟的片子，说明问题很多。建议实验的时候每一步都要严谨一点。应该会有好的结果。
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breezemail 楼主跑电泳没有加MARKER吗？单从电泳结果来看，电泳本身就有问题。即使酶切不成功，绝不会出现这么严重的拖尾现象。检查一下你的电泳缓冲液有没有问题？琼脂糖有没有问题？先把电泳的问题解决了再分析酶切的问题。对于酶切，首先确定你的质粒确实有该酶切位点，然后使用的酶没有失效。如果这两点都没问题，再考虑甲基化的问题，不过从电泳图片来看，酶切应该是成功的，只是拖尾太严重了。很有可能是电泳缓冲液的问题，重新配置您好,我用的新电泳液跑了, maker 很整齐.但是还是出现同样的拖尾.如果是dna有杂质等,如何在实验中注意啊?重提质粒DNA吗?
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shinewj 图看起来像DNA降解带，不像质粒，有可能质粒本身有问题，有可能提取质粒溶液2加多了，质粒降解了我是按照说明书加的啊?250ul
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tanbotao1986 您好,我用的新电泳液跑了, maker 很整齐.但是还是出现同样的拖尾.如果是dna有杂质等,如何在实验中注意啊?重提质粒DNA吗?你是用试剂盒提的质粒吗？溶液2加完后应在5分钟内上下翻转离心管使菌体充分裂解，并加入溶液3。时间间隔不能太长，太长容易使基因组DNA也变性，提出来的质粒会有DNA污染。同时上下翻转时动作轻一点，不要太剧烈。一般试剂盒都有去蛋白液的，建议用去蛋白液清洗后再用乙醇清洗，之后洗脱。如果实验室有可以测浓度的仪器，可以看看A260/A280的比值是不是在1.8-2.0之间。
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breezemail 你是用试剂盒提的质粒吗？溶液2加完后应在5分钟内上下翻转离心管使菌体充分裂解，并加入溶液3。时间间隔不能太长，太长容易使基因组DNA也变性，提出来的质粒会有DNA污染。同时上下翻转时动作轻一点，不要太剧烈。一般试剂盒都有去蛋白液的，建议用去蛋白液清洗后再用乙醇清洗，之后洗脱。如果实验室有可以测浓度的仪器，可以看看A260/A280的比值是不是在1.8-2.0之间。比值是1.83，浓度120ug/ul。我又跑了一次没有酶切的质粒，如下图。我手机照的，没有maker。胶和电泳液都是新的。肉眼可见有两条带，另一条在最亮的那条上面较近的地方。质粒可以吗？感谢您
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是不是我酶切反应体系的问题
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tanbotao1986 比值是1.83，浓度120ug/ul。我又跑了一次没有酶切的质粒，如下图。我手机照的，没有maker。胶和电泳液都是新的。肉眼可见有两条带，另一条在最亮的那条上面较近的地方。质粒可以吗？感谢您这张看起来好多了，提出的质粒正常！图中你看到的最亮的那条带是超螺旋的，上面紧挨着的应该是缺口的。如果提的好的话，在最上面应该还能看到一条带，是线状的。你把你的酶切体系贴出来我看看有没有什么问题。另外，浓度应该是120ng/ul吧？
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tanbotao1986 比值是1.83，浓度120ug/ul。我又跑了一次没有酶切的质粒，如下图。我手机照的，没有maker。胶和电泳液都是新的。肉眼可见有两条带，另一条在最亮的那条上面较近的地方。质粒可以吗？感谢您质粒没什么问题，跑胶也没问题，那么看看酶是不是不对，用其他实验室的或者其他公司的酶切一切，看看效果，也可以切切其他酶切位点，看是不是正常，还是说一样会降解。
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建议把你提取的质粒重新转换到新的大肠杆菌克隆宿主中，然后再提质粒试试，我认为可能和大肠杆菌宿主有关。
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breezemail 这张看起来好多了，提出的质粒正常！图中你看到的最亮的那条带是超螺旋的，上面紧挨着的应该是缺口的。如果提的好的话，在最上面应该还能看到一条带，是线状的。你把你的酶切体系贴出来我看看有没有什么问题。另外，浓度应该是120ng/ul吧？大哥：我后面切下来了，我的载体是9000多的，目的片段大小是970多的，但是为什么在1000的maker附近有两条带啊？求解啊（倒数第二第三泳道）
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tanbotao1986 大哥：我后面切下来了，我的载体是9000多的，目的片段大小是970多的，但是为什么在1000的maker附近有两条带啊？求解啊（倒数第二第三泳道）首先，你的图片看不见。其次，在1000附近有两条带，考虑可能的原因有两个：1
在你构建好的载体中，你切割目的条带的其中一个内切酶是不是存在两个酶切位点？好好分析你的载体序列和目的基因序列。2
如果酶切位点没有问题，怀疑酶切体系有问题，导致出现了星活性。你使用什么酶？那个公司的，酶切体系告诉我，我帮你分析。
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建议楼主电泳少上点样，DNA量过多胶过载可能出现这种现象
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breezemail 首先，你的图片看不见。其次，在1000附近有两条带，考虑可能的原因有两个：1
在你构建好的载体中，你切割目的条带的其中一个内切酶是不是存在两个酶切位点？好好分析你的载体序列和目的基因序列。2
如果酶切位点没有问题，怀疑酶切体系有问题，导致出现了星活性。你使用什么酶？那个公司的，酶切体系告诉我，我帮你分析。使用fermentas 公司的内切酶，体系20ul，质粒 1ug，Ecor I 0.5ul
BamH I 1ul
buffer 为EcorI 的2ul（10x）。另一个是使用的BamH 的buffer ，酶的使用量交换。酶的原始含量是10u/ul 。37° 3h。非常感谢
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tanbotao1986 使用fermentas 公司的内切酶，体系20ul，质粒 1ug，Ecor I 0.5ul
BamH I 1ul
buffer 为EcorI 的2ul（10x）。另一个是使用的BamH 的buffer ，酶的使用量交换。酶的原始含量是10u/ul 。37° 3h。非常感谢我一直用的是fermentas 公司的快切酶，就是Fast Digest。没用过它的普通酶。按照快切酶来看，BamH 1和Ecor I在1个小时以后都会出现星活性。而且，fermentas有一个green buffer，所有的内切酶都可以共用这个的。你可以试试。从酶切体系来看，没什么大问题，就是酶切时间有点长。建议减少酶切时间试试。你可以每半小时取出来5ul样品，最后跑电泳看看是不是产生了星活性，同时也能找到合适的酶切时间。
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我想知道你这个图怎么贴上去的
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潇潇蛛 我想知道你这个图怎么贴上去的下面不是有个添加图片和附件嘛？
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tanbotao1986 大哥：我后面切下来了，我的载体是9000多的，目的片段大小是970多的，但是为什么在1000的maker附近有两条带啊？求解啊（倒数第二第三泳道）你后来是改变什么条件切开的，我也是和你一样的情况，弥散，浓度很高，求指点
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zhouyujun 你后来是改变什么条件切开的，我也是和你一样的情况，弥散，浓度很高，求指点我换了新的提取试剂盒和酶
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大哥。。fermentas貌似是Thermo scientific的旧称。你的酶是不是过期了？用阳性对照切切看。
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