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【求助】同一个PCR反应体系不同时间结果不同
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这个帖子发布于9年零142天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我使用同一个CDNA，进行PCR反应，相同的反应体系，但是在第一次有产物，第二次却没有产物，请各位大侠帮忙分析一下。另外，我在PCR的过程中，发现反应结束后，本来20ul的体系却只剩下约10ul左右了，可是管口也没有松开呀。
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我也存在这个问题，据师姐讲是因为在热盖过程和变性过程中温度高，造成了挥发，我也不知道这么说对不对！嘿嘿怎么解决这个问题呢？望高手赐教！！
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我觉得是模板cDNA或者反应条件没有稳定的造成的问题，多摸索几次反应条件应该可以改善，对模板cDNA也要特别注意，因为它极其容易降解，但各人的情况不一样，像我的模板，保存半年照样可以P出来，嘿嘿……
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楼主的PCR体系出现蒸发？？ 你的反应程序 一开始的盖子温度多少？？
一定要大于你下面程序的温度
可以设高点 99
105度什么的
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我的反应体系是94℃ 2min，然后94℃30s，58℃30s，72℃30s，30个循环，72℃10min。请问crepi为什么一开始盖子温度要大于下面程序的温度，这跟PCR体系出现蒸发有关么？
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比如变性95度的时候 这时ep管底的温度是95度 而盖子的温度如果是105度 即ep管盖也是105度 这样管底形成的蒸汽就不会凝结成水 不会造成损失 当然还有种措施 就是PCR加完样后 再最上面加点石蜡油 再离心下 这样更保险
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我也存在这个问题，造成了挥发量少了。嘿嘿怎么解决这个问题呢?可以在PCR体系上面加上一层的石蜡就可以防止蒸发了呀！
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你可能喜欢反应体系是什么?如题
在某一温度和压强下lmol某物质B完全燃烧时的反应热,称为该物质的燃烧热,其符号记作△CHm(B).完全燃烧（或完全氧化）的涵义系指反应物中碳元素与氧生成气态的二氧化碳,氢元素与氧生成液态的水,硫元素与氧生成气态的二氧化硫,氮元素成为氮气,氯元素成为氯化氢溶液,金属变成游离态等.显然,完全燃烧后的产物其燃烧热为零.在标准状态下1mol某物质B完全燃烧时的反应热,称为该物质B的 物质的标准燃烧热（298.15K）可从手册中查到.因有机物一般难以由稳定的单质直接合成,其生成热的数据不易得到.但有机物能燃烧生成稳定的氧化物,且燃烧反应的热效应又可直接测量,因此,许多有机物的生成热可通过其燃烧热求得.
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PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul
PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特异...
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ATS――声波移液技术引领者
来源:生物谷
浏览人数: 483
ATS诞生于专注技术研发，低调的美国公司EDC，并很快地被GSK，Novartis，Merck， Pfizer
等公司采用。Broad Institute和美国伯克利国家重点实验室也在文章中标注采用ATS进行基于定量PCR 的高通量药物筛选和高通量质谱分析实验。ATS到底是怎样一个技术？ 让我们一起来了解他。声波几乎无处不在，很普通，ATS却能用它进行液体的转移。ATS利用声波探头把电能转化为声波，并聆听声波的反射来获得样品性质和液面高度的信息。声波探头根据所获得的信息，自动调整探头的位置来精准地聚焦能量到液面的一个点，激发出纳升级液滴。液滴飞向上方的容器，液滴通过表面张力粘附于容器表面，或直接融入到反应体系中（如图1）。ATS通过调整能量的状态，精确控制液滴大小，根据实验的需要在1nl 和50nl 之间任意调整液滴体积。更大体积的液体转移通过每秒钟上百个液滴的转移来实现。
图1: ATS声波移液原理示意图 ATS可进行任意孔到任意孔的转移。移液过程中样品飞速穿过空气，无需枪头，喷嘴和管路，不存在液体残留，交叉污染和阻塞。需要转移的液体可存放在96,384,孔板中，通过ATS可转移液体到任何SBS／ANSI板，甚至是载玻片，晶体板，或芯片。ATS移液的精准度和精确度远高于传统移液技术, 且死体积小于0.5ul, 可最大限度的使用宝贵的实验样品。 目前声波移液技术在如下领域都有建树：高通量药物筛选、结构生物学、分子诊断
、合成生物学、 精准医疗、 高通量质谱分析。现在和大家分享几个应用案例。
1.高通量药物筛选：革新传统实验流程，缩小反应体系，实现高通量低成本药物筛选在IC50实验中，母液的化合物溶度高，传统的实验流程需先把母液转移到微孔板中，用移液设备进行梯度稀释。再将稀释后的化合物加入到实验板中(如图2)。整个移液过程很难避免液体残留在枪头，导致实验结果的偏差。
图2：传统梯度稀释法移液流程 ATS最小的液滴体积为1nl，可采用直接稀释法（如图3），直接将化合物母液转移到实验板中，该过程可用ATS的Cherry Pick和Dose-Response软件协助完成。ATS移液的准确性和精密性可减少实验重复次数。0.5ul的死体积，显著减少实验所需溶液的体积，节约珍贵的样品和试剂。
图3：ATS直接稀释法移液流程百时美施贵宝公司在化合物筛选实验中，将声波移液技术和基于枪头的传统移液技术做平行比较，他们惊人地发现在1000个被筛选的化合物中，其中108个化合物只在采用声波移液技术时有活性(如图4)。 图4: 百时美施贵宝声波移液和传统移液方法的筛选结果比较2. 高通量定量PCR: 自动化，微体系，极低的CV 定量PCR（qPCR）被广泛应用于基因表达分析，基因分型，SNP分析等应用。目前定量PCR常用的反应体系为10ul-20ul，采用ATS 声波移液技术可进行1ul 甚至更小反应体系定量PCR。ATS
进行cDNA, Mix buffer，引物，荧光试剂的纳升级移液，整个过程无需枪头，没有交叉污染，且CV极低。Broad Institute of MIT and Harvard 的科学家采用ATS与Roche LightCycler® 1536 定量PCR仪联用，实现基于定量PCR 的高通量药物筛选[1]。ATS也可与机械臂联用，实现24小时无人值守高通量药物筛选（如图5）。
图5: ATS自动化药物筛选平台 3. 蛋白结晶：高通量，微体系蛋白结晶；减少种晶基质效应，提高结晶成功率蛋白结晶过程可分为3个阶段成核，生长和停止生长。晶核的形成是蛋白质晶体生长的起点和关键点，通过种晶可提高结晶的成功率。种晶过程，会引入外加缓存液对于结晶条件的影响，Roche的科学家首次把声波移液技术应用到高通量的蛋白结晶的条件筛选。他们通过ATS降低种晶的体积到15nl，减少缓冲液对于结晶环境的影响[2]。 如图6所示蓝色柱状图为ATS进行种晶，橙色，黄色柱状图为没有种晶的对照组。统计了6种蛋白样品，每种蛋白96个液滴中结晶液滴的个数。在另一篇文章中[3]，Roche的科学家采用ATS进行蛋白溶液和各种结晶试剂的转移, 实现30nl体系结晶(如图7)和高通量的结晶条件筛选。 图6：ATS种晶结晶数据
图7：基于ATS移液的溶菌酶30nl 体系结晶 4. 高通量质谱分析：ATS高通量质谱样品点样，效率提高100倍美国伯克利国家重点实验室，为了优化微生物分解多糖，生产生物燃料的培养条件，建立了基于ATS的高通量质谱分析方法。ATS 从384孔板中，转移1nl的培养基到质谱样品金属板上（如图8），再进行微生物代谢产物的质谱分析。ATS 在2分钟内完成一个点间距为450um，288个点的样品矩阵点样。该方法比人工方法，工作效率提高100多倍[4]。
图8：用ATS进行高通量质谱样品点样至今，全球前10位的制药公司和众多知名研究机构都采用ATS声波移液技术，应用于高通量药物筛选、结构生物学、分子诊断
、合成生物学、 精准医疗等领域。更多信息请联系：
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上海市张江高科技园区达尔文路88号21号楼4楼
电话：086-21-
传真：086-21-
邮箱：marketing@
LBD腾泉北京办事处
北京市昌平区中关村生命科学园科学园路30号138室
电话：086-10- 参考文献：[1]High-Throughput
RT-PCR for small-molecule screening assays. Curr Protoc Chem Biol. ; 4(1):
49C63. doi:10.559277.ch110204.[2]Acoustic matrix
microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical biasActa Cryst. (2010).
D66, 568C576[3] Nanolitre-scale
crystallization using acoustic liquid-transfer technology.
Acta Cryst. (2012). D68, 893C900
[4]High throughput
nanostructure-initiator mass spectrometry screening of microbial growth
conditions for maximal β-glucosidase production. Frontiers in Microbiology. December 2013 |
Volume 4 | Article 365 | 1
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【求助】PCR反应体系改变
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这个帖子发布于7年零287天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请教各位，我摸PCR条件是用10微升体系的，现在变成50微升，即各成分均增加5倍，电泳有时候有条带，有时候没有，而且没有的时候比较多，不知道要怎么办？是不是50微升的体系分成5管，每管10微升，pcr后再把5管合成一管，这样行不行？多谢啦。。
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10微升体系条件好，50微升不见得一定好，我的体系20微升比较稳定，可是当我准备大量扩时，50微升体系则差些，后来在原来的基础上稍做改动，效果还可以，你也可以试一试，如果实在不愿意摸索，当然也可以像你说的，10微升体系多扩几管，可能会损失多些
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原来的条件就摸索了很久，再摸要崩溃了，还是多扩几管算了，谢谢啊。。。
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可能是加热块或者管子的问题哦：1. 50ul加好后放进PCR仪里，看看是不是完全看不到液体？液体如果高出金属块加热效率应该好不了2.如果用相同的PCR管，10ul相对于50ul而言蒸发会更多，所以10ul反应体系真实浓度应该更高，因此建议50ul反应体系适当调高某些组分的浓度。3. 楼主要干么？要那么多PCR产物啊？如果PCR反应特异性够好，适当增加10个循环PCR终产物的量会增加一些的，这样和增加反应管的量效果差不多。4.其实 还是多扩几管最简单。楼主遇到的可能和工程学的放大过程差不多，有太多不可控因素在里面了。
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我pcr产物测序，公司说最少35微升，加上拿出5微升跑电泳验证有没有产物，所以要求量比较多。我而且已经45个循环了，如果再加10个循环还行吗？
很奇怪的，我之前做的也是有时候有产物，有时候没产物。。真是郁闷啊。
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我以前也碰到过类似的情况，最可能的原因是Taq酶的质量不好，须更换Taq酶，用热启动酶进行实验，这样条带一定会很稳定的出来，如您需要热启动酶的话，请与我联系，我可以给你一些试用，一定会做出很亮的条带，我的联系方式：。
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你给我的酶条带出不来啊。。
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你模板加太多了，加少点，2倍左右就够了
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那你用我们给你的PCR MIX做吧，但一定要保证引物和模板没有问题？如果再不行的话，那一定是某个东西出现了问题，或是引物或是模板，实在不行的话可能要重新设计引物和重提模板了。
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加点mg可能会有惊奇的发现
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楼主的做法不是很正确。不是体系大了，相应的各个组分就要随比例增加的。根据我的感觉，模板适当减少一点，体系也不要用那么大，做两个25ul的体系就好，比较容易控制，也能满足要求。常用的扩增体系也是20ul-25ul。50ul的体系，使用的ep管肯定和你10ul体系用的不一样，所以在pcr过程中肯定会出现各种不可预知的问题，而且体系太大，扩增效果自然会变差。扩增周期的问题，都已经45了，再加也没有什么意义了。
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谢谢各位好心人的指导啊，呵呵。我现在重新提取了一批DNA，浓度比以前低，用原来的条件就做不出来了，PCR的时候DNA模板提高了2倍3倍都做不出来了，是不是退火温度也要重新摸？我以前就很奇怪，摸条件的时候退火35秒，延伸35秒可以做出来，退火30秒，延伸30秒就做不出来，是不是巧合还是要求真的这么严格啊？
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wfyh41560 加点mg可能会有惊奇的发现加镁离子？buffer里就有啊，这个怎么调整啊？？太深奥了吧？
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那还是用PCR MIX做试试吧，PCR MIX中所有的组份都是优化好的，只要你设计的引物和提取的模板没有问题，就一定会得出结果。
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我也遇到与楼主类似的问题，两种细胞的RNA，做反转录PCR，同样的体系和酶，就引物和模板不一样，其中一个基本比较稳定，每次都能扩出来；而另一个模板就总是一会扩出来，一会扩不出来的情况。所以，是不是可以排除机器和酶的问题。是跟目的基因的丰度低有关系吗？请高手不吝赐教！
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