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暂无探索3 小时前导读如果James Watt的蒸汽机开启了人类文明的“大门”，那么Kary Mullis无疑就是打开了生物“划时代之门”，人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实，并在第一台PCR热循环仪诞生后PCR自动化也成为现实。在PCR技术诞生30周年、变性、退火、延伸三部曲日趋完善、PCR之歌越唱越响的2013，我们期待学科领域内的研究进展可以为基因扩增、传染病诊断、遗传疾病鉴定的诊疗带来更多改变。让我们一起来回顾这30年来，PCR技术领域都有哪些进展。经典PCR技术盘点PCR技术30年经典回顾聚合酶链式反应（PCR）原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。材料：模板DNA、dNTP、TaqDNA聚合酶、蒸馏水、PCR缓冲液、引物、氯化镁、PCR仪、移液枪、PCR板、薄壁管、离心管、离心管盒步骤：一、标准的PCR反应体系&10×扩增缓冲液 　10 ul&4种dNTP混合物 　各200 umol/L&引物 　　　　 　 各10～100 pmol模板DNA 　　　 　0.1～2 ugTaq DNA聚合酶 　 2.5 uMg2+　　　　　　 1.5 mmol/L加双或三蒸水至 　 100 ul二、PCR引物设计PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。1. 引物设计的基本原则（1） 引物长度：15-30 bp，常用为20 bp左右。（2） 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。（3） 引物内部不应出现互补序列。（4）两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。（5） 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。（6）引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。（7） 引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。2. 引物设计软件Primer Premier5.0 （自动搜索）*、Oligo6 （引物评价）、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3 （在线服务）。三、模板的制备（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。（2）模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。（3）标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。四、PCR反应条件的控制1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。2. 镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。3. 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200 umol/L。4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。5. 引物 浓度一般为0.1 ～0.5 umol/L。6. 反应温度（1）变性温度和时间95℃，30 s。（2）退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。（3）延伸温度和时间72℃，1 min/kb(10 kb内）。（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)7. 循环次数 ：一般为25 ～30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。五、PCR的循环参数1. 预变性（Initial denaturation）模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。2. 循环中的变性步骤循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可 缩短该步骤时间，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。3. 引物退火（Primer annealing）退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。4. 引物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。5. 循环数大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。6. 最后延伸在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。六、PCR步骤1. DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA。2. 退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3. 延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。七、PCR检测PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。反向PCR （inverse-PCR）原理：反向PCR是克隆T-DNA插入位点侧翼DNA序列非常有效的方法。1.选择合适的限制性内切酶位点。并在T-DNA的边界（左边界、右边界均可）和酶切位点附近设计引物P1、P2；2. 回收DNA，T4连接酶连接，使酶切后的DNA片段环化；3. 回收连接后的DNA，用引物P1、P2做PCR，就可扩增到两端为T-DNA插入序列，中间为侧翼序列的片段。材料：DNA样品、DNA连接酶（T4 DNALigase）、引物 EcoR I ddH2O 酚 氯仿、无水乙醇、乙酸钠、电泳仪、离心管、离心机、超净台、水浴锅步骤：一、限制性内切酶消化1. 选择合适的限制性内切酶，基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前，应对基因组DNA定量。2. 根据T-DNA的左边界序列选择合适的酶切位点EcoRI，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位点上游附近设计引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用这些内切酶分别消化基因组DNA，酶切体系如下：37℃ 过夜，电泳检测酶切效果。二、回收DNA1. 将酶切产物转到1.5 ml离心管中，用ddH2O洗涤干净，并稀释到250 μl；2. 加入等体积的酚和氯仿（V：V=1：1），涡旋混匀，室温静置1 min；3. 最大速度（13 000 rpm）离心1 min；4. 将上清移到另一管中，加入等体积的氯仿，涡旋混匀，室温静置1 min；5. 最大速度（13 000 rpm）离心2 min；6. 将上清移到另一管中，加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，0.1倍体积的3 M 乙酸钠（pH=5.2），轻轻振荡混匀，室温静置5 min；7. 4℃最大速度（13 000 rpm）离心10~15 min；8. 弃上清，尽量除去管壁上的液体；9. 加入1 ml -20℃预冷的70%乙醇，轻轻颠倒几次。最大速度（13 000 rpm）离心5 min；10. 除去乙醇，在超净台上平放，将管壁上的乙醇挥发掉，20~40 μl ddH2O溶解。-20℃保存。三、连接1. 体系如下：2-14℃ 过夜2. 连接体系比较大，而DNA含量比较低，不需加入PEG4000，这样可以促进分子内的连接，减少分子间的连接。试验中我们采取蹇文婴等（2002）的方法（12-14℃连接48 h）。连接完成后，65℃ 水浴10 min灭活。按上述3.抽提回收，溶解于40 μl ddH2O中。3. 然后就可以用回收的链接片段做PCR了。直接原位PCR原理：原位PCR是原位杂交细胞定位和PCR的高灵敏度相结合的技术，使得靶基因检测有了极大的改进。此技术是在细胞（爬片、甩片或涂片）或组织（石蜡、冰冻切片）上直接对靶基因片段进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。材料：细胞或组织样品、福尔马林 二甲苯 PBS Tris-HCl Triton-X100 蛋白酶K PCR反应缓冲液、Tag酶、Tween-20、指甲油、无水乙醇、苏木素染色液、NP-40 NaCl、MgCl2 、BSA、 DAB、过氧化氢、盐酸酒精液玻片、湿盒、滤纸、显微镜步骤：一、组织切片和细胞样品的制备1. 试剂与配置10%福尔马林；二甲苯；PBS。2. 操作方法（1）用10%福尔马林固定组织8~15 h，石蜡包埋，切片（4 μm），将切片置于新鲜的二甲苯中处理5 min，放入无水乙醇中浸泡5 min，取出，空气干燥；（2） 对于培养细胞，可直接制备爬片，也可有PBS洗细胞一次，加10%福尔马林静置过夜，用橡胶刮下细胞；用PBS洗细胞两次，2 000 rpm×3 min，用5 ml PBS重悬细胞，即可用甩片机甩片或直接吸50 μl点在载玻片上。二、切片预处理（蛋白酶消化）1. 试剂与配置0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)缓冲液A：0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)，0.3% Tween-20，0.5% NP-40蛋白酶K：20-50μ g/ml，溶于TE中2. 操作方法（1）干燥后的切片置于0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)中，室温孵育5 min；（2）浸入缓冲液A中，室温孵育10 min；（3） 滴加20 μl蛋白酶K液于标本上，在湿盒中37℃孵育20 min；（4）在室温下，用0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)漂洗两次，每次5m in。三、原位扩增（以标记生物素为例）1. 试剂与配置PCR反应缓冲液：两种引物各100pmol，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μmol， Bio-dUTP 50mol，1×PCR缓冲液；Tag酶：5U/μl缓冲液B：0.01mol/L PBS，0.1% Triton-X100指甲油（市售）无水乙醇2. 操作方法（1）切片用1×PCR缓冲液平衡3次，每次5 min；（2） 用滤纸吸去切片上多余的液体，置60℃，每片加入30 μl PCR反应缓冲液，5 U Tag酶，用盖玻片封片，四周封以指甲油，防止蒸发；（3） 94℃变性5 min，按下列条件（94℃×2 min，55℃×2 min，72℃×3 min）循环20~25次后，72℃延伸5 min；（4）玻片浸入无水乙醇中10 min，以软化指甲油；（5） 用刀片撬开盖玻片并除去；（6） 用缓冲液B漂洗两次，每次3 min；（7）用无水乙醇固定5 min，并吹干。四、检测（以ABC法为例）1. 试剂与配置缓冲液C：0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.5)，0.1 mol/LNaCl，2 mmol/L MgCl2， 0.5% Triton-X100封闭液：3%BSA（溶于缓冲液C中）显色液：0.05%DAB，溶于0.05 mol/L Tris-HCl (pH7.4)，临用前每10 ml加30%过氧化氢50 μl。1%盐酸酒精液苏木素染色液2. 操作方法（1） 用30 μl 3%BSA滴加在玻片上，封闭1 h；（2）用缓冲液C简洗1 min，每片滴加ABC复合物20～30 μl，室温放置40 min；（3）缓冲液B室温漂洗3次，每次15 min；（4） 滴加显色液于玻片上，镜下观察控制显色时间（一般7～14 min）；（5）流水洗片，浸入苏木素液中复染30 s，1%盐酸酒精分化（提抽2次）；（6） 常规脱水、透明、封片，镜下观察。间接原位PCR材料：组织或细胞样品、SSC、SDS、DTT、Rnase、Denhardt’s+液、硫酸葡聚糖、甲酰胺、脱脂奶粉、变性的鲑鱼精DNA、乙醇、玻片、石蜡膜、橡皮泥、湿盒步骤：一、预杂交1. 试剂与配制2×SSC50%去离子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v）预杂交液：2×SSC，5%硫酸葡聚糖，50%甲酰胺，0.2%脱脂奶粉2. 操作方法（1）在进行完原位PCR扩增后，用2×SSC预浸经乙醇脱水、空气干燥的玻片，并简洗15 min；（2） 用50%去离子甲酰胺37℃孵育15 min；（3）加预杂交液20 μl/片，在杂交温度下孵育30 min～2 h。二、杂交1. 试剂与配制杂交液：50%去离子甲酰胺，5×SSC，10%硫酸葡聚糖，5×Denhardt’s 液，2%SDS，10 mg/ml变性的鲑鱼精DNA2. 操作方法（1）弃预杂交液，加杂交液（含0.2～5 μg/ml探针）10～20 μl/片，覆盖经硅化的盖玻片，石蜡膜封片或橡皮泥封片；（2）玻片置于湿盒中，42℃杂交12～18 h（过夜，但不能超过24 h）。三、杂交后处理1. 试剂与配制2×SSCRnase（20 μg/ml）50%去离子甲酰胺10 mmol/L DTT2. 操作方法1. 杂交完毕，用2×SSC浸泡玻片数分钟，轻轻移去盖玻片，再用2×SSC洗玻片1～2 min；2. 2×SSC（含20μg/ml RNase，适宜RNA探针，DNA探针可省略此步）中洗片30 min，37℃；3. 2×SSC/50%去离子甲酰胺，42℃×10 min；4. 1×SSC/50%去离子甲酰胺，37℃×30 min，2次；5. 4×SSC/10 mmol/L DTT洗1 h；6. 0.1×SSC洗2次，每次37℃×30 min；7. PBS中洗10 min，即可进行显色，方法同上。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）原理：逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。材料： 组织、细胞、RNA提取试剂、dNTP+混合物、Taq+DNA聚合酶、第一链cDNA合成试剂盒、离心管、离心机、水浴锅、PCR管、电泳仪、凝胶图像分析系统、移液管、移液枪、离心管盒步骤：一、总RNA的提取见“总RNA的提取”相关内容。二、cDNA第一链的合成目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。1． 在0.5 ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11 μl。在管中加10 μM Oligo（dT）12-18 1 μl，轻轻混匀、离心；2．70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min；3． 取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 μl；上游引物（10 pM） 2 μl；下游引物（10 pM） 2 μl；dNTP(2mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl） 1 μl。轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5 min；4．加入SuperscriptⅡ1 μl ，在42℃水浴中孵育50 min；5． 于70℃加热15 min以终止反应；6．将管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。三、PCR1．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP(2 mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；2．加入适量的ddH2O，使总体积达50 μl。轻轻混匀，离心；3．设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照；4．电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；5．密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。实时荧光定量PCR（realtime PCR）材料：细胞样品、RNA提取试剂盒、荧光定量PCR+Mix、TRIZOL、dNTP、氯仿、逆转录酶MMLV、异丙醇、Taq酶、DEPC水、ddH2O、TE、MgCl2、琼脂糖、溴化乙锭、MOPS、甲醛、乙酸钠、EDTA、EB、溴酚兰、离心管、离心机、分光光度计、电泳槽、凝胶板、Realtime+PCR仪步骤：一、 样品RNA的抽提1. 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。2. 两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。3. RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。4. RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7 000 rpm离心5分钟。5. RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。6. 溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。二、 RNA质量检测1. 紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。（1）浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：RNA溶于40 μl DEPC水中，取5 μl，1:100稀释至495 μl的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg（2）纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。2. 变性琼脂糖凝胶电泳测定（1）制胶1 g琼脂糖溶于72 ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。10×MOPS电泳缓冲液浓度 成分0.4 M MOPS，pH 7.00.1 M 乙酸钠0.01 M EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。（2）准备RNA样品取3 μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。（3）电泳上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。（4）紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。三、样品cDNA合成1. 反应体系序号反应物剂量1逆转录buffer2 μl2上游引物0.2 μl3下游引物0.2 μl4dNTP0.1 μl5逆转录酶MMLV0.5 μl6DEPC水5 μl7RNA模版2 μl8总体积10 μl轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。2. 混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 μl，37℃水浴60分钟。3. 取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。四、 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR1. β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3 μl按10倍稀释（加水27 μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。2. 反应体系如下：序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10 μl2阳性模板上游引物F0.5 μl3阳性模板下游引物R0.5 μl4dNTP0.5 μl5Taq酶1 μl6阳性模板DNA5 μl7ddH2O32.5 μl8总体积50 μl轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。3. 管家基因反应体系：序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10 μl2内参照上游引物F0.5 μl3内参照下游引物R0.5 μl4dNTP0.5 μl5Taq酶1 μl6待测样品cDNA5 μl7ddH2O32.5 μl8总体积50 μl轻弹管底将溶液混合， 6000 rpm短暂离心。3. 制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃　2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。五、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板1. 针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。2. 反应体系序号反应物剂量110× PCR缓冲液2.5 ul2MgCl2 溶液1.5 ul3上游引物F0.5 ul4下游引物R0.5 ul5dNTP混合液3 ul6Taq聚合酶1 ul7cDNA1 ul8加水至总体积为25 ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72?C延伸5分钟。（3）PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。（4）将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。六、 待测样品的待测基因实时定量PCR1. 所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。2. 体系配置如下：序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10 ul2上游引物1 ul3下游引物1 ul4dNTP1 ul5Taq聚合酶2 ul6待测样品cDNA5 ul7ddH2OddH2O8总体积50 ul轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。（3）将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃ 2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。七、 实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。八、电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。重叠延伸PCR原理：此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。材料：基因样品、PCR仪步骤：1. 以引物a/b进行pcr1。2. 以引物c/d进行pcr2。3. 引物b/c中引入了需要的限制性位点。4. 混合二者pcr产物，混合以前最好回收一下。5. 进行pcr延伸反应，只有右面这个可以延伸。6. 以延伸反应的产物为模板，以a/d为引物进行pcr。7. 产物即为所需最终产物。甲基化PCR材料：基因组DNA、蛋白酶K、RNA酶、双蒸水、氢氧化钠、对苯二酚、紫外分光光度计、水浴锅、亚硫酸氢钠、EP管、铝箔纸、移液枪步骤：一、基因组DNA的提取此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。使用两者的细节：1. 蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20 mg/ml；2. RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10 mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20℃保存。3. 验证提取DNA的纯度的方法有二：（1）紫外分光光度计计算OD比值；（2）1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。二、亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。1. 将约2 ug DNA于1.5 ml EP管中使用DDW稀释至50 ul；2. 加5.5 ul 新鲜配制的3 M NaOH；3. 42℃水浴30 min；水浴期间配制：4. 10 mM 对苯二酚（氢醌），加30 ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）。5. 3.6 M 亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88 g 亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3 M NaOH滴定溶液至pH 5.0，最终体积为5 ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。pH一定要准确为5.0。加520 ul 至上述水浴后溶液中。6. EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。7. 加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。8. 50℃避光水浴16 h。一般此步在4 pm开始做，熟练的话不到5 pm即可完成，水浴16 h正好至次日8 am以后收，时间上很合适。这一步细节：（1）基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4 ug。（2）所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。（3）亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。（4）水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。三、修饰后DNA纯化回收EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5 mlEP管中。2. 以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）（1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；（2）加1 ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；（3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，如果有真空负压吸引器，使用起来很方便；如果没有，需要自备3 ml~5 ml 注射器。将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2 ml 以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。（4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2 ml 80%的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。（5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5 ml 洁净EP管上，离心12 000 rpm，2 min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。（6）将小柱取下置于另一洁净1.5 ml EP管上，移液器加50 ul 预热好的DDW，室温放置5 min。（7）离心12 000 rpm，20 s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为50 ul。3. 加5.5 ul 新鲜配制的3 M NaOH，室温放置15 min。4. 加33 ul 10 M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液pH于7.0左右。5. 加4 ul 10 mg/ml 糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。其实，加入这些糖原究竟能起多大作用，不好说。不过有国产糖原卖，包装不大，也很便宜，买来一用，算严格遵守文献的步骤吧。6. 加270 ul 冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。有人为沉淀最短可至2小时，但我认为时间长些可能会更好。并且做到此步骤时，一般会到中午，如果样本多的话要到下午，不妨放置过夜，日程可以轻松些，顺便做些其他试验。如果想当天做完，没有问题，但我认为最好多沉淀些时候，至少6小时吧。7. 4度，12 000 rpm 离心，30 min，倒去上清液，收集沉淀。不必吸净。8. 加500 ul 70%乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可。轻柔倾斜EP管，旋转一圈，再次离心，4度12 000 rpm，5 min。离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。此为洗涤步骤，共2次。9. 倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，室温干燥5 min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20 ul~30 ul DDW，溶解沉淀。至此，已完成了修饰后DNA的纯化回收，所得为修饰后DNA溶液，可用于此后的进一步实验。10. -20℃保存DNA溶液。此步细节：（1）在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作用。（2）乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。（3）异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。因为树脂与DNA结合需要有一个适当的pH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了四、修饰后DNA用于PCR这一步也没有悬念。我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：1. 引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，但以失败告终。如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多，自己设计引物没有问题。如果不是这样，还是参考文献更好些。首先查阅SCI分值高的文献，然后是著名实验室的文献，如果国内有做的，更好了，可以直接联系咨询。查到序列后，一定要和Genbank中的序列进行比对，防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。然后再到google上搜一下，看用的人多否，体系条件是否一样。用的人多、体系条件一样，表明可重复性比较强。我也是按此行事，算比较顺利。2. Taq酶问题：有文献用高保真的金牌Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适，一般的热启动酶是可以的。我开始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配有10x含mg2+的LA缓冲液。有时候用没了，暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。如何选择，可以根据自己的情况。初作者还是用好一点的酶。3. PCR的条件：变性一般都选择95度，3 min。其余我感觉还是根据文献，退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试。一般和文献报道差别不大。只是扩增片断特异性的问题。建议根据文献。4. 做PCR的EP管最好选择进口的，壁薄且厚度均匀，这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液，使体系真正在所设定的温度下运行。5. PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了，最好一直用此仪器继续。不同的仪器“脾气”也不一样，但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好，留有空隙，我认为会影响温度的传递。五、PCR产物的凝胶回收这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）。把切下来的胶按说明书操作即可。几个细节：1. PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。2. 凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性。3. 紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。4. 回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。六、PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选1. 连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）15 ul 体系T-easy 1 ulLigase 1 ul2×buffer 7.5 ulDNA 5.5 ul4度，过夜。2. 连接产物的转化（1）-70度冰箱内取出感受态细菌，融化后置于冰上；（2）连接产物15ul 全部加入，至于冰上30分钟；（3）42度， 90秒钟；（4）冰上2分钟；（5）800 ul LB培养基；（6）280 rpm，37度，摇床45分钟（将管放水平了摇，保证菌液摇匀）；（7）8 000 rpm，1分钟；在超净台内去上清，留100~150 ul；（8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）先涂：X-gar 35 ulIPTG 25 ul后涂：混悬液过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点，取白色斑点，尤其是蓝色斑点周围的白色斑点，此处自联率较低。3. 取白斑，划种于新板上新板：先涂：X-gar 35 ulIPTG 25 ul然后于板底划出分区，进行标记。根据需要，一般一板作50个克隆没有问题。针头挑白斑划2道于板上相应区域内。37度，孵箱过夜。4. 联系测序公司送测序。一般一个克隆在35~45元。这一部分的细节：（1）涂板要均匀，保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；（2）不要让蓝白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。降落PCR材料：基因样品、PCR步骤：1. 反应体积为50 μl。2. 人CD137胞膜外区基因的PCR扩增体系：CD137-pCDNA3质粒4 μl，P1，P2各0.5 μmol/L，MgCl2 2 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，Taq 5 U。3. hIgG1Fc片段的PCR扩增体系：含人hIgG1Fc的PGEM-T质粒4 μl，P3、P4各0.4 μmol/L，MgCl2 2 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，Taq 5 U。4. HBVDNA多聚酶基因的PCR扩增体系：（1）第一轮：HBVDNA模板4 μl，P5、P6各0.25 μmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq 0.8 U.（2）第二轮：取5倍稀释的第一轮PCR产物4μl为模板，P7、P8各0.25 μmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq 0.8 U。5. 分别在各灭菌PCR管加入上述各反应成分，100℃煮沸5 min，立即冰浴5 min，加入TaqDNA聚合酶，混匀，离心，PCR程序如下：6. 取 10 μl PCR 扩增产物，在2%或3%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察扩增产物。差示反转录PCR实验原理：几乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都带有一个多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA为模板，以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。根据mRNA分子3’-末端序列末端结构的分析可以看到，在这段poly(A)序列起点碱基之前的一个碱基，除了为A的情况之外，只能有C、G、T三种可能。根据这种序列结构特征，P.Peng等人设计合成三中不同的下游引物，它由11个或12个连续的脱氧核苷酸加上一个3’-末端锚定脱氧核苷酸组成，用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示，这样每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都将能够把总mRNA群体的1/3分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。于是，采用这三种引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上分成三个亚群体。然后用一个上游的随机引物和与反转录时相同的oligo(dT)引物对这个cDNA亚群体进行PCR扩增，因为这个上游的引物将随机结合在cDNA上 ,因此来自不同mRNA的扩增产物的大小是不同的，可以在测序胶上明显分辨开来，从而筛选出不同样品间基因差异表达的DNA片段。材料：红豆杉细胞、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、SuperscriptTMⅡ试剂、柠檬酸钠、Taq+DNA聚合酶、dNTPs、十二烷基肌氨酸钠、巯基乙醇、RNAimage试剂盒、异硫氰酸胍、焦碳酸二乙酯、基因扩增仪、凝胶成像系统、超低温冰箱、电热鼓风干燥箱、超净台、脱色摇床、核酸定量仪、多用电泳仪、DNA序列分析电泳槽步骤：一、实验材料1. 红豆杉细胞未经MJ诱导处理的A和经MJ诱导处理的B红豆杉细胞。2. 寡核苷酸引物（1）3’锚定引物：①H-T11A(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’②H-T11C(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’③H-T11G(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’（2）5’ 随机引物：Kit引物：①H-AP1(2uM)： 5’-AAGCTTGATTGCC-3’②H-AP2(2uM)： 5’-AAGCTTCGACTGT-3’③H-AP3(2uM)： 5’-AAGCTTTGGTCAG-3’④H-AP4(2uM)： 5’-AAGCTTCTCAACG-3’⑤H-AP5(2uM)： 5’-AAGCTTAGTAGGC-3’⑥H-AP6(2uM)： 5’-AAGCTTGCACCAT-3’⑦H-AP7(2uM)： 5’-AAGCTTAACGAGG-3’⑧H-AP8(2uM)： 5’-AAGCTTTTACCGC-3’生工引物：①H-AP1(2uM)： 5’-AAGCTTCATTCCG-3’②H-AP2(2uM)： 5’-AAGCTTCCACGTA-3’③H-AP3(2uM)： 5’-AAGCTTCGGGTAA-3’④H-AP4(2uM)： 5’-AAGCTTGAGTGCT-3’⑤H-AP5(2uM)： 5’-AAGCTTCGGCATA-3’⑥H-AP6(2uM)： 5’-AAGCTTGGAGCTT-3’⑦H-AP7(2uM)： 5’-AAGCTTACGCAAC-3’⑧H-AP8(2uM)： 5’-AAGCTTTAGAGCG-3’特异引物：①5ac： 5’-GAGTTTCCACCATGGTGT-3’②ck5： 5’- GGAGTGAGTTTCCACCAT-3’③10ac： 5’-TTGTTGTAGGGGTGAGTT-3’④10acb： 5’-CATGGTATATGTGATGGA-3’⑤2ben： 5’- GTTGTGGGCACAAGATTC-3’⑥3ben：5’- CATAGTGTATGTGATGGA-3’⑦Phen：5’-GGTAGTGCATGCGATGCA-3’二、 实验方法2. 总RNA的提取与检测（1）用品的准备塑料器皿，如离心管、Tip头等用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上，高压灭菌并烘干后使用；所用溶液用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上，高压灭菌后4℃保存；玻璃器皿经180℃烘烤12小时以上，冷却备用。（2）试剂的配置① CSB缓冲液42 mmol/L 柠檬酸钠（Sodum citrate）0.83%（W/V）十二烷基肌氨酸钠（N-lauryl sarcosine）0.2 mmol/L 巯基乙醇（β-mercaptoethanol）（使用前加入）（3）RNA提取对悬浮培养细胞A、B进行RNA提取，提取步骤如下：① 50 ml 离心管中加入10 ml 变性匀浆液，冰浴5分钟。② 取0.5 g 细胞在液氮中研磨至粉末，转移至预冷的变性匀浆液中，加200 ul β-巯基乙醇，振荡混匀。③迅速加入1 ml 2 mol/L 乙酸钠（pH4.0），充分混合。④ 加入10 ml 水饱和酚，剧烈振荡10~15秒，在冰上放置5分钟。⑤ 加入2 ml 氯仿：异戊醇（24：1），剧烈振荡10~15秒，在冰上放置15分钟。⑥ 4℃，12 000 g，离心20分钟。⑦ 小心移取上层水相，弃去中间相和下层有机相。⑧ 加入6 ml 水饱和酚，剧烈振荡10~15秒，在冰上放置5分钟。⑨ 加入6 ml 氯仿：异戊醇（24：1），剧烈振荡10~15秒，在冰上放置15分钟。新技术解读PCR技术30年经典回顾第三代PCR技术Mullis博士在发明PCR技术后曾这样描述：“用一个单分子DNA，PCR能在一个下午内产生100百万个相似的分子。反应很容易进行，只需要一个管子、一些简单的试剂和一个用来加热的设备”（Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an afternoon. The reaction is easy to execute. It requires no more than a test tube, a few simple reagents, and a source of heat）30年来，PCR技术就如同阿基米德拿来撬动地球的杠杆一样撬动了生命科学研究的每一个领域。30年，PCR技术刚好发展到了第三代：第一代PCR就是常见的定性PCR技术，它采用普通PCR仪来对靶基因进行扩增，采用琼脂糖凝胶电泳来对产物进行分析。定性PCR有几个缺点：1)采用毒性较大的核酸染料，会对实验人员和环境造成伤害，2)容易发生污染而造成假阳性结果，3)检测耗时长，操作繁琐，4)只能定性检测产物的有无，而不能对起始模板量进行定量（如图一）。图一 定性PCR仪第二代PCR就是荧光定量PCR技术（Real-Time PCR，qPCR），荧光定量PCR诞生于1992年，它通过在反应体系中加入能指示反应进程的荧光试剂来实时监测扩增产物的积累，借助荧光曲线的Cq值来定量起始靶基因的浓度。荧光定量PCR需要借助校准物制备的标准曲线来定量，因此实际上是一种相对定量方法。而且不同厂家生成的仪器确定Cq值的方法不同，甚至同一个厂家还有多种确定Cq值的方法，实验者也可以根据自己的经验随意调节Cq值，这就直接造成了人与人之间、仪器与仪器间、实验室与实验室间的定量结果可比性差；荧光定量PCR也存在多个问题，如校准品和样品间背景不同而引入偏差、难以检测低拷贝数的靶DNA、样品与校准物的扩增效率不同、DNA提取中引人的杂质或DNA降解影响PCR的动态扩增等。（如图二）图二 实时定量PCR仪第三代PCR技术--数字PCR（Digital PCR，dPCR，Dig-PCR），是一种全新的对核酸进行检测和定量的方法。它采用直接计数目标分子而不再依赖任何校准物或外标，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。（如图三）图三 数字PCR仪Vogelstein和Kinzler第一次描述了数字PCR的概念，用于在大量正常细胞群中检测少数含突变的细胞（如结肠直肠癌的致癌基因）。通过稀释样品DNA到每两个检测孔中才有一个分子，经PCR扩增后，向每个孔中加入特异性结合突变型的荧光探针和既能与突变型结合也能与野生型结合的荧光探针与产物杂交，然后直接计数样本中突变型和野生型等位子的数量。数字PCR要通过使用统计分析（如贝叶斯估计）来评估等位基因分布同正常值不同的可能性强度，因此将传统PCR的指数的模拟信号转换成线性的数字信号。数字PCR的灵敏度取决于分析中采用的检测孔的数目和聚合酶的固有突变率。在聚合酶的保真性难以提高很大的情况下，增加分析孔的数量可有效提高检测的灵敏度。现代数字PCR的发展趋势是采用微滴式方法替代传统的稀释方法，通过对样品进行微滴化处理，将含有核酸分子的反应体系分散成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理即可得出样品中靶分子的起始拷贝数。数字PCR技术主要应用在以下几个方面：突变分析、评估组织内的等位基因失衡、体液DNA的癌症检测、混杂DNA的癌症检测、定量特异等位基因的基因表达等。数字PCR分析突变示意图一对分子信标引物设计用来扩增一段约100bp的PCR产物，这段产物的中部包含一个单核苷酸多态性（SNP）位点。两个分子信标除了同SNP位点互补的碱基和标记的荧光分子外，完全相同。绿色和红色分别代表荧光素和hex标记。游离状态的分子信标的信号被3'-dabcyl基团猝灭而不发出荧光。当同互补序列杂交时，分子信标发出荧光。样品DNA被分配到384孔PCR板中，经PCR反应后，向每个孔中加入分子信标以确定等位基因状态。数字PCR和基于分子信标的等位基因鉴别也可整合到一步反应进行。PCR芯片技术PCR仪器发展的趋势之一变得更加微型化， PCR芯片就是在这种趋势下诞生的。PCR芯片就是在微型的载体上进行PCR反应，是微型化的PCR仪。芯片PCR不仅节省了大量反应试剂因此降低了实验成本，还有助于提高反应速度。下面就让我们回顾下PCR芯片的发展历史：早在1994年Peter Wilding等人就通过在硅表面蚀刻的三维小室放入PCR反应物，然后通过半导体加热制冷片控制温度，扩增出了PCR产物。虽然当时实验效果不如使用成品化的PCR仪效果好，但他们预言PCR芯片将来一定会扮演重要的角色。随后，Adam T. Woolley等人将基于硅片小室的PCR扩增和基于毛细管电泳（CE）的芯片成功耦合起来，PCR反应的加热和冷却速率可以分别达到10℃/s和5℃/s。借助高速（&120s）毛细管电泳可直接分离和分析扩增产物，而无需经过传统的凝胶电泳分析。Woolley指出若以后可以将样品制备也整合到PCR芯片中，可加速人类基因组工程的进展。Martin U. Kopp等人则创造性的采用连续流PCR芯片。不同于在基于硅片小室的PCR芯片和成品化的PCR仪上采用的固定反应液位置，周期改变外部温度的反应方式，Martin U. Kopp等人采用“时空转换”的思路，使反应液在毛细管中依赖静水压，不断地连续流过芯片上的三个独立的不同温度区（95℃变性，60℃退火，77℃延伸）。不像固定反应液位置的方式反应液温度变化要受到仪器固有加热和冷却速率的影响，采用新的方式使温度变化只受把反应液转移到下一个温度区所用时间的影响，因此反应液加热和冷却的时间可小于100ms。Krishnan M等人则利用瑞利-贝纳尔（Rayleigh-Benard）对流原理设计了一种热对流PCR芯片。在形成的高温（97℃）到低温（61℃）的温度梯度的对流场（convective flow field）中，利用热对流效应 (thermally driven convective flows) 驱动腔体内的反应液连续流过与变性、退火和延伸反应相对应的温度区域。基于硅片小室的PCR芯片示意图连续流PCR芯片示意图Yannick Bejat设计的螺旋线式连续流PCR芯片示意图热对流PCR芯片示意图
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历史上的今天
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