用PCR方法定量检测IL-6受体基因在前列腺癌中的表达--《同济医科大学学报》1998年06期
用PCR方法定量检测IL-6受体基因在前列腺癌中的表达
【摘要】：利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）定量检测了10例正常人前列腺、15例前列腺癌（PCa）及 PCa细胞系PC-3m中白细胞介素6受体(IL-6R）基因表达水平。结果发现,正常人前列腺组织中IL-6R基因呈低水平表达,PCa组织中IL-6R基因表达增强,明显高于正常组（P0.01）,且73.3％（11/15）组织样本中IL-6R mRNA表达水平高于 PC-3m。而IL-6所介导的假单胞菌外毒素融合蛋白对该细胞系有强烈的杀伤作用。这表明IL-6及IL-6R与PCa的发生发展有关,并为PCa的生物学治疗的研究奠定了基础。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R737.25【正文快照】：
白细胞介素6（Interleukin-6）是一种多效性细胞因子,对细胞的生长、分化具有凋节、诱导作用。其生物学功能由位于细胞表面的L-6受体（IL-6R）及其信号系统所介导。IL-6R是一条含有配体结合区的糖蛋白,分子量为80kU。近年来研究表明,1卜6与多种肿瘤发生发展密切相关[‘]。它
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结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用
【摘要】：目的建立结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测方法,探讨荧光PCR检测痰标本中结核分枝杆菌的应用价值。方法根据结核分枝杆菌基因保守序列设计引物和探针,并构建标准品。对102例培养涂阳的结核痰液标本和45例非结核感染者的痰标本,应用荧光定量PCR法、痰涂片抗酸染色法检测结核分枝杆菌。结果荧光定量PCR、抗酸染色法检测结核分枝杆菌的特异性分别为100%、30%。结论荧光定量PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法,具有重要的应用价值。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R450【正文快照】：
结核病是严重危及全球的公共卫生问题之一,自1985年以来结核病疫情在全球范围内急剧上升,据世界卫生组织报道,目前全球有近1/3的人感染了结核杆菌,即20亿人口感染了结核杆菌,其中活动性肺结核病人约2000万,每年新增结核病人约800～1000万,每年约有300万人死于结核病[1～3]。
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京公网安备74号［请教］如何识别小片段ＰＣＲ产物？难！(二聚体,模板,空白对照) - PCR实验 - 生物秀
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摘要: [［请教］如何识别小片段ＰＣＲ产物？难！(二聚体,模板,空白对照)] 我的ＰＣＲ产物只有８０bp，而所做的不加模板的空白对照跑出的二聚体带也在小于１００bp，甚至就在８０bp处．该怎么区分我的产物和二聚体呢？ 关键词:[二聚体 模板 空白对照]……
我的ＰＣＲ产物只有８０bp，而所做的不加模板的空白对照跑出的二聚体带也在小于１００bp，甚至就在８０bp处．该怎么区分我的产物和二聚体呢？
回复:我的也是，给你看看我的方法2．DXY上的建议：1．可以用非变性PAGE胶电泳，应该能分开的，理论上说分辨率达到1个碱基。可以用非变性丙烯酰胺凝胶电泳进行分离鉴定NA在丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围:丙烯酰胺(W/V):12% 有效分离范围(bp):40-20015% 25-150电压一般是1-8V/cm, 6个小时后银染即可分辨你的两个片段2．可以用1.3%TAE的长胶，在30伏的电压下（中号电泳槽），跑16-20小时是应该可以分开的。3．用2.5%的琼脂糖就能分开，我们实验室经常用它来分开相差28bp的片段，效果很好，看的很清楚，但有几点要注意，缓冲液要是新配的，电压100v跑10分钟，接着50v跑一个 半小时，到两个小时。 4．理论上用1.5或者2.5琼脂糖应该都可以分开，在电泳的时候电压不适宜太大，用40-50v跑上2小时左右应该就可以了。电压加大到80v或者100v的时候虽然节省实验时间，但是有时条带的效果看起来就不是很好。还有就是似乎你的Marker选择的不好，即使电泳能够分开两条带，这个Marker也很难来说明你的目的条带和内参带的大小。5．用聚丙烯酰胺跑垂直电泳。1。需要单独的垂直电泳槽，及配置聚丙烯酰胺凝胶。2，具体的做法可以到 生物谷 网站，有详细的说明。3，你可以用5%的琼脂糖跑一下。6．建议你跑PCR的时候做个阴性对照，只加引物，电泳时看阴性对照引物二聚体的位置，以区分拟订目的片段71bp条带，或是电泳时直接加一空引物做对照　1　材料与方法　　1．1　标本　　人单核细胞系U937，细胞密度2×108/L，分对照组(N)、处理Ⅰ组(T1)、处理Ⅱ组(T 2)，N用1640培养基及10％胎牛血清培养，T1用IFN-γ104U/L LPS 1μg/L、T2用IFN- γ10 U/L LPS l0μg/L分别刺激7 h。　　1．2　主要试剂与　　TRIzol试剂(GIBCO BRL)、Fluoro DD试剂盒(Genomyx)、Supersript Ⅱ逆转录酶(GIBCO 　BRL)、Ampli　Taq DNA聚合酶(GIBCO BRL)、RNase-free DNaseI(Promega);Genomyx LR 、 Genomyx SC、DNAThermal Cycler(Perkin Elmer)　　1．3　总RNA的制备　　按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总 RNA，以 RNase-free DNase I(终浓度80 000 U/L)除去其中污染的 DNA，经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性，并以紫外分光光度计检 测其纯度　　1．4　mRNA差异显示1.4．1　逆转录反应　选择锚定引物［T7(dT12)AP(anchored prime rs，AP)，序列为5′ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3′，其中 M＝A／G／C． N＝A /G/C/T］，以总RNA为模板进行逆转录反应，每管反应体系如下：总RNA l．0μg,AP 4 pmol ,70℃ 5 min,加入50 mmol/L Tris-HCl(pH8.3),75 mmol/L KCl,3 mmol/L MgCl2,10mmol /L DTT,25μmol/L，dNTPmix(1∶1∶1∶1)，SuperScriptⅡ 60 Units，总反应体系20 μl 。42℃ 5 min，50℃ 50 min，70℃ 15 min。1．4．2　荧光标记差异显示PCR　 选取与逆转录引物序列相同的带荧光物 质标记的锚定引物［TMR-T7(dT12)AP］，随机引物(5"ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG 3")，以逆转录产物为模板，进行PCR反应。反应体系包括：20 mmol/L Tris-HCl(pH8．4) ，50 mmol/L KCl，3．75 mmol/L MgCl2，逆转录产物3．0 μl，50 μ mol/L dNTP mi x(1∶1∶1)，0．35 μmol/L 5"-随机引物,0．35 μmol/L 3-锚定引物,Ampli Taq 0.5 U nits，总反应体系10 μl。95℃ 2 min。94℃　15 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min，4个循环； 94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，25个循环；72℃延伸7 min。　　1．4．3　分离差异显示片段　配制5．6％变性聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0．2 5 mm，大小61×33 cm。将PCR产物加4．0 μl上样缓冲液，95℃变性后上样。3000V、100 W 、55℃电泳4．5 h。干胶后置于Genomyx SC扫描，用系统所带的AcquireSC program软件分 析处理扫描结果。　　1．4．4　回收差异条带　用AcquireSC软件将差异条带定位，用一次性手 术刀片切割下所需条带，置于30 μl去离子水中，37℃水浴30～60 min，备用。　　1．4．5　差异条带的再扩增　以经上述处理的回收条带为模板，T7启动子 22-mer(5"GTAATACGACTCACTATAGGGC3")、反M13(-48)24-mer(5’AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3")为引物,进行再扩增反应：模板2.0 μl,20 mmol/L Tris-HCl(pH8．4)，50 mmol/L KCl，1．5 mmol/L MgCl2,20 μmol／L dNTP mix(1∶1∶1∶1)，0．2 μmol／L T7、0 ．2 μmol/L M13-r，AmpliTaq 1．0 U nits，总反应体系20 μl。反应条件同差异显示PC R。　　2　结果　　2．1　总RNA的质量总RNA经Dnase I处理，用1．0％甲醛变性凝胶电泳，可见清楚的28 S、18 S、5 S条带 ，且28 S／18 S约为2∶1(图1)，表明RNA完整性好，无降解现象。N、T1、T2的OD260／OD28 0比值分别为1．92、1．83、1．98，表明样品纯度高。
Fig.1 Result of total RNA on formaldehyde-agarosegel　　2．2　荧光标记mRNA差异显示结果显示每一泳道均有约50条大小不等的扩增产物，各组间比较见较多呈有无或强弱变 化的差异条带，图2中箭头所示。
　2．3　差异条带再扩增　　取T2中约1．25Kb的条带再扩增，结果见图3。
荧光标记差异显示技术通过对引物设计、PCR条件、凝胶、电泳条件以及标记物的改进，极 大减少了上述不足。　　差异显示的锚定引物有单碱基锚定引物、简并或非简并的双碱基锚定引物等多种类型，本实验通过使用双碱基锚定引物，将总mRNA群体分为12个亚群，这极大减小了每一锚定引物 产生的第一条cDNA链的数量，不仅可降低随机引物的用量，更可降低DD产物的复杂性，使差 示条带在序列胶上易于分辨，从而传统方法中常见的“重叠带”现象减少。DD专用的随机引 物的特点为A+T与G+C含量近乎相等，且3’-端以G或C结尾，可增加DD扩增的效率。通过改 变RT-PCR反应条件如底物浓度、延伸时间等，差异片段的长度可达1．0～1．5 kb(图2)， 因较长的cDNA片段容易通过Northern blot进行分析鉴定辨别真假阳性克隆，且其中可提供 更多的序列信息，故获取大的片段具有重要的意义。　　文献认为差异显示居高不下的假阳性率实际上因再扩增所致［4］。通常， 再扩 增的引物与DD引物相同，本试验将再扩增引物设计为T7(22-mer)与M13-r(24-mer)，此为 在锚定引物的5’端和随机引物的3"端分别增加的序列(本文方法中所列差异显示引物序列的 划线部分)，这两种来源于原核生物的引物尽可能降低了在真核mRNA序列中非特异性扩增的 机会。同时，T7启动子序列可直接用于体外转录合成cRNA探针，为cDNA片段的直接测序和鉴 定(RPA或Northern分析)提供了方便。　　用常规的序列分析胶进行分辨时,较长的cDNA片段往往挤在胶的上端而影响分辨率。本 操作改用5．6％的PAGE胶(聚丙烯酰胺)，减少胶的厚度(仅250 μm)，通过提高电泳的电压( 3000 V)及温度(55℃),可显著提高分辨率。　　同位素标记存在曝光时间长、带型不佳，基本与相邻的带混合、污染等缺点，将荧光物 质标记于锚定引物的5"端,可产生清晰、明亮、低背景的分辨效果，操作周期仅两天。　　目前，DD技术己被广泛应用于与疾病、衰老、生殖、生长发育、分化等生理［5］ 、病理过程相关的未知表达基因的研究,相信对揭示生物界基因表达调控的奥秘将起重要的 作用。　　军队“九五”医药卫生科研基金资助课题(96M145)7．（附）：凝胶电泳程序：凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种. 一、琼脂糖凝胶电泳:　　琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和 鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度， 把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在 37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连 接等.(一)凝胶浓度　　凝胶浓度的选择依DNA分子的大小而定.琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2(二)电泳缓冲液　　核酸电泳缓冲液有三种，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE 与TPE缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使 DNA沉淀.TAE缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA可螯合 二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解.　　10XTBE缓冲液的配制　　Tris硷，108克　　EDTA，9.3克　　硼酸，55克　　H2O至，1000ul　　(其PH应为8.0～8.2)　　临用时用水稀至0.5XTBE(20倍稀释.(三)核酸电泳的指示剂与染色剂　　1.指示剂:核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似.　　指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有①增加样 品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色，使加样操作更方便.　　染色剂:核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其 次是银染色.　　溴化乙锭(ethidium bromide，E是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对 之间，在紫外线激发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂 糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般&5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染 色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察.　　银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收.(四)电泳　　1.电泳装置:　　电泳装置主要有电泳仪，电泳槽及灌胶模具等.　　2.电泳方法:　　(1)用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净.放在水平桌面上，并架好梳子.　　(2)根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200～400bp的DNA片段， 可配制1.2～1.7%浓度的琼脂糖用于电泳.　　3.配制0.5XTBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅 或微波炉内加热熔化.冷却至60℃(需要时可加入溴乙锭)，倒入电泳槽中，待凝固.　　4.向电泳槽中倒入0.5XTBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子.如样品孔内有 气泡，应设法除去.　　5.在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内.　　6.接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样 孔的一端为负).电压为1-5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算).　　7.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳.一般200～400bp的PCR产物50V电压， 电泳20～40min即可.　　(3)溴化乙锭染色后，紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩 增产物的大小.二、聚丙烯酰胺凝胶电泳　　聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分 析.其装载的样品量大，回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸 分子即能分离.　　聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N"一四甲基乙二胺)和 过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N"一亚甲 双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶.　　聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的，不同浓度丙烯酰胺和DNA的 有效分离范围见表2.丙烯酰胺(%)有效分离范围(bp)溴酚兰*二甲苯青*3.04605.080～8.060～12.040～200307015.025～150156020.010～1001245　　*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp).(一)材料　　1.电泳:，垂直电泳槽及其附件.　　2.30%丙烯酰胺　　丙烯酰胺，29克 　　N，N"一亚甲基双丙烯酰胺，1克　　H2O，加至100ml　　装于棕色瓶内，4℃可保存二个月.　　3.10%过硫酸铵　　过硫酰铵，1克　　加水至，10ml　　4℃可保存一周，-20℃可保存一个月.　　4.1XTBE电泳缓冲液　　5.TEMED(四甲基乙烯基二胺)(二)聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳　　根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶.　　1.按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂 糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出.　　2.将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角.　　3.按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数.　　4.加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液 体接近溢出时为止.　　5.立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力 的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使 成10°角，可减少液体泄漏的机会.　　6.室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1XTBE 缓冲液.　　7.小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳 子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产 生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则.　　8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不 要产生气泡.　　9.接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳.　　10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳.　　11.电泳毕，切断电源，弃去，取出胶床板，小心移去一块玻 璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶 液中，15～30min后取出水洗紫外仪下观察结果.　　12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出&10ng以上量的DNA条带.要求更高 的灵敏度，可用银染.(3).出现引物二聚体应该怎么做？1．若是非特异扩增的小片段条带2．可以引物浓度不变，升高一下褪火温度。设计一个引物浓度梯度，接着降引物浓度 。3．除了做引物浓度梯度，可以降低一下Mg离子浓度，或者干脆做一个镁离子浓度梯度，降低退火温度肯定是非特异产物更多的 。引物二聚体的出现是相对的，并不是单纯因为你的条件而导致二聚体的出现，事实上如果引物更倾向于和目的片断结合，正常pcr扩增的话，那引物二聚体就基本不会出现了，换句话说，如果你能扩增出目的条带，那么同样的条件，撤去模板，进行pcr循环就有可能出现引物二聚体。引物二聚体的出现并不可怕，只是说明你的引物不是最佳，但不直接决定能否扩增出来，通常只要引物和目的片断有一定的配对区，摸索合适的pcr条件，应该是能扩增出来的。4．拿我的实验为例，我的目的片断GC含量较高，在未加DMSO之前，怎么优化条件，总是扩不出目的片断，而电泳前端的引物二聚体倒是常常光顾，且亮度挺高，当向体系中加入1.5μl的DMSO后，终于扩出了目的片断，而且二聚体也不攻自破了 。5．原因之一：6．引物二聚体的出现太多，说明你的扩增效率不高，也就是说很多引物没有被用来参与PCR的扩增，尤其是目的片段少的情况下，更能用此解释。你可以检查一下你的扩增产物是不是很多。7．单纯依靠降低退火温度，不能解决这一问题，反而会增加非特异扩增的机会。建议你先摸索一下退火温度，提高退火温度常可解决问题。从你的条带位置看，不像是二聚体，到像是非特异扩增的条带，很可能引物设计的不好，还有另一位置扩增效率更高，因为条带短，更容易扩增出来。另外，你用的引物浓度也太高了。正常情况下，终浓度0.1-1uM。8．100-200bp应该是非特异的扩增条带。可以提高退火温度以及降低Mg2+浓度试试9．你没有说除了100－200bp的条带还有没有你要扩增的目的条带？比例是多少？如果有你要的扩增条带，量还可以那没关系呀，把你要的条带切胶继续往后做克隆如果没有你要的扩增条带，建议你重新设计引物好了有时候你反复摸PCR条件还不如你重新设计合成引物来的快 10．电泳都是引物二聚体，内参是GAPDH，原因可能是模板量太少，1.RNA抽提的问题。抽完RNA后应立即测一下纯度。可以用紫外分光光度仪或甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外算A260/A/280值，如果在1.6-1.8之间，表明纯度较好，低于辞职说明有蛋白污染，高于此值说明可能有RNA降解。糖电泳可以大致的估计一下 看三条带的亮度，28S〉18S〉5.8S。2.RT没做成功。关于逆转录的反应体系的影响因素都要考虑进去，为了防止RNA被痕量的RNase 降解，一般还应加入RNase抑制剂。3.如果RT没问题，就加大模板的量再扩扩试试。 11．其对策有：①必要时重新设计引 物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。12．回复:ＰＣＲ产物已鉴别出!我是加大模板的量多做的PCR,虽然电泳检测时二聚体就在ＰＣＲ产物同一位置(80bp),但ＰＣＲ产物的亮度比二聚体大多了,由此判断是我所要的ＰＣＲ产物. 之后的实验证明我的判断没错.
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