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蛋白纯化技术员简介
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1条信息1&&0.0
1条信息2&&3.0
1条信息3&&2.3
1条信息4&&0.0
1条信息5&&0.0
1条信息6&&2.4
1条信息7&&0.0聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质
实验四& 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质
&&& (polyacrylamide gel
electrophoresisPAGE)(disc-electrophoresis)(slab-electrophoresis)PAGEpHPAGEPAGEPAGE
【试剂及器材】&&
1(pH8.9)& Tris 36.3glmolL HCl48ml80mlpH8.9100ml4
2(pH6.7)& Tris 5.98glmolLHCl48ml80mlpH6.7100ml4
3(30)& (Acr)29.2g丙烯酰胺(Bis)0.8g100ml 41
4(pH8.3)& 28.8gTris 6.0g850mlpH&31000ml410
5(10)& 0.5g5ml41
6(TEMED)& 4
7& 斯亮蓝R250(CBBR250)L 25g50454ml46ml
8& 12.5(TCA)
9& 30ml125ml500ml
12& 0600V0300mA
14管& 0.50.6cm10cm
1550ul10cm510ml
【操作步骤】
&& (1) 0.6cm10cm端量至7cm7.5cm
&& (2) 4-110ml7.55ml管至7cm(0.5cm)分界线后，倾去覆盖的水并用滤纸条吸干。
表4-1& 浓缩胶的配制
&&& (3) 410ml3.07.5cm(0.5cm)
&&& 2& 0.1ml400.1ml0.050.1ml()10tq管浓缩胶表面，相当于加血清3.3ul
&&& (1)将已加样的凝胶管安装在电泳槽上的橡皮孔中，使凝胶顶部恰好可见，并弃掉下端的橡皮垫。
&&& (2)用毛细滴管吸电极缓冲液，小心注满凝胶玻管(不能搅动样品层)。然后将电极缓冲液慢慢倒人上、下电极槽中，上槽应浸没凝胶玻璃管，下槽液面应超过凝胶玻管下端。小心排除凝胶管的上、下管口内可能存在的气泡，否则会影响导电。
&&& (3)将上槽的电极接电泳仪的负极，下端接正极，通电。先调节电流为1毫安／管，待示踪染料进入分离胶后，再调节电流为2毫安／管。待示踪染料达到玻管下口约0.5cm时，切断电源，电泳完毕。
&&& 4．剥胶& 取下凝胶管，用带10cm长针头的注射器吸满蒸馏水。将针头小心插入胶柱与管壁之间，一边注水一边旋转玻管，靠水流压力和润滑力将玻管内壁与凝胶分开，然后用洗耳球在胶管一端轻轻加压，凝胶柱便缓缓从玻管中滑出。
5．固定、染色& 将凝胶柱浸泡于12.5％的TCA中0.5～1h，然后转入CBBR-250染色液中染色l～2h，或90℃水浴中染色10min。
&&& 6．脱色、保存& 将已染色的凝胶柱置于7％冰醋酸溶液中浸洗，不断更新冰醋酸，直到浸洗无色为止。全过程约需5—7d。或用洗脱液漂洗3～4次，每次20—30min。取lcm×l5cm小试管，内盛7％冰醋酸溶液，把凝胶柱浸泡其中，加塞蜡封即可长期保存。
&&& 7．定量
&&& (1)切片抽提法：切割特定区域的片段，用10倍量的水或0.1-0.2mol／L
NaCl或适量的缓冲液进行匀浆。4℃过夜抽提，离心取上清液，选择合适的波长测定吸光度值。这种定量方法准确性不高，可作为样品的回收方法。
&&& (2)微量光密度计法：目前已有不经染色直接进行紫外扫描的微量光密度计，也有必需经过染色后进行测定的光密度计，还有配备显微装置的超微量光密度计。为了消除圆柱状凝胶的球面差，可将胶条放人7％冰醋酸内进行测定。
【注意事项】&&
&&& 1．Acr和Bis是神经毒剂，可经皮肤、呼吸道等吸收，操作时要注意保护。
&&& 2．Acr和Bis在低温下稳定，应放棕色瓶干燥低温(4℃)保存。30％单体交联剂应装棕色瓶中，贮存于冰箱(4℃)能部分地防止水解，但也只能保存l～2月。可测定pH(4.9～5.2)来检查是否失效，失效液不能聚合。
&&& 3．在制胶过程中用蒸馏水封住胶面是为了阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。
&&& 4．TEMED宜密封避光保存。
&&& 5．制备凝胶用玻管要用洗液浸泡清洁，如玻管不清洁，倒胶后在管壁会出现气泡。
&&& 6．制备分离胶和浓缩胶时，加入催化剂和加速剂混合后约在10～30min内聚合，故应尽快注人玻管。如室温过高，为防止过快聚合，可置冰浴中操作。如果凝胶不聚合，通常是由于制备的试剂浓度不准确，或者凝胶混合液中漏加某一试剂，也可能是试剂不纯所致。应重新配制混合液。
&&& 7．本法可简化，用同一分离胶以及同一缓冲液和pH的连续凝胶电泳，也可获得较好的结果。
【评价】&&
&&& 聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶强度好，对热稳定，无电渗作用，透明度高，且凝胶孔径大小可调节，所需样品量小，并具有高分辨率等多种优点。其中圆盘电泳设备简单，操作方便。但平板电泳可用于同时对多个样品的比较分析，而且结合十二烷基硫酸钠(SDS)形成SDS—PAGE，或者与等电聚焦(IEF)配合作IEF-PAGE的双向电泳，均可进一步提高其分辨率及扩大应用范围。以下试题来自：
多项选择题聚丙烯酰胺凝胶电泳时，蛋白质的泳动速度取决于A．蛋白质的分子量B．蛋白质的分子形状C．蛋白质所在溶液的pH值D．蛋白质所在溶液的离子强度
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1A．苯丙氨酸B．酪氨酸C．丝氨酸D．苏氨酸2A．腺嘌呤-胸腺嘧啶B．胞嘧啶-鸟嘌呤C．尿嘧啶-鸟嘌呤D．腺嘌呤-尿嘧啶3A．支链氨基酸B．芳香族氨基酸C．血氨D．尿素4A．在十二指肠中，中和一部分胃酸，有利于肠内消化B．乳化脂肪C．促进脂肪酸的吸收D．促进维生素A、D、E、K的吸收5
A．动脉血压高低
B．心脏射盅能力和静脉回心血量之间的相互关系
C．胸膜腔的压力
D．静脉系统的容量
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实验方法原理
蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4 g SDS/1 g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。
聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。
试剂、试剂盒
仪器、耗材
30%凝胶贮备液：称取29 g 丙烯酰胺（Acr）和1 g 甲叉-双丙烯酰胺（Bis），加蒸馏水至100 ml，滤纸过滤贮存。
10% SDS：称取SDS 10 g 加蒸馏水至100 ml。
10%过硫酸胺（AP）
N，N，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED）
5×电泳缓冲液：于900 ml蒸馏水中分别加入15.1 g Tris、94 g甘氨酸、5 g SDS，混匀后加蒸馏水至1 000 ml。
1.5 mol/L Tris-HCl(pH8.8)和1.0 mol/L Tris-HCl(pH6.8)
电泳加样缓冲液 10 mmol/LpH6.8 Tris 200 mmol/LDTT 4%SDS 0.2% 溴酚兰 20% 甘油
移液器、移液管、烧杯、垂直电泳槽、电泳仪。
三、操作步骤
配制分离胶浓度8%、体积15 ml H2O ：6.9 ml 30%凝胶贮备液 ：4.0 ml 1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8) ：3.8 ml 10%SDS： 0.15 ml 10%过硫酸胺： 0.15 ml TEMED： 0.01 ml
2.一旦加入TEMED，混匀后立即小心地将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，为成层胶留有足够空间。用毛细管轻轻在其顶层加入几毫升正丁醇，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。
聚合完成之后，倒掉覆盖液体，用去离子水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干顶端的残存液体。
配制5%成层胶5 ml，插入梳子，小心避免混入气泡，垂直放置室温下。 H2O ：3.4 ml 30%凝胶贮备液： 0.83 ml 1.0 mol/Ltris-HCl(pH6.8) ：0.63 ml 10%SDS ：0.05 ml 10%过硫酸胺： 0.05 ml TEMED ：0.01 ml
在成层胶聚合时，将样品与加样缓冲液混匀，100℃加热3 min。
成层胶聚合完成后，用去离子水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，将凝胶放入电泳槽上。
电泳：开始时电压为8 V/cm凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。
9.取下凝胶，固定、染色或进行分析。
最新实验心得
(共3个心得)
跑SDS-聚丙烯酰胺电泳时恒压不如恒流好控制，电压过高产热过多，电压过低跑得太慢，效果上来说恒流恒压都差不多。
发表于 14:57
(共1个问题)
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谁能提供实验帮助？
谁做这个实验？
所给的加样缓冲液是几成的啊，与样品混合比例是多少没有详细介绍哦
谁关注这个实验？
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SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白跑不出来 有个白色的长条带 怎么回事
见图所示，求助！跑的是bFGF和BSA BSA勉强能看到，但bFGF基本看不到啊
可以试试用EDC&&NHS活化羧基，在摇床上震荡结合就可以了。
Heparin–deoxycholic acid chemical conjugate as an
anticancer drug carrier and its antitumor activity
Kyeongsoon Park, Gee Young Lee, Yoo-Shin Kim, Mikyung Yu, Rang-Woon Park, In-San Kim, Sang Yoon Kim, Youngro Byun
Journal of Controlled Release 114 (–306
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多谢LZ，千秋万代~~
能上博士很厉害啊，我是药学专业，今年也想考博，压力大啊
本人是生物系小硕，奈何此时在化学系混，无奈无奈~~~~~~~~~
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