实训三 组织分离制母种实训第一夶部分n讲解及演示n指导老师 王德芝食用菌味道鲜美 风味独特l下面请同学们欣赏几道l美味的菜肴菇香美味迎客来花好月圆蘑菇香香菇招来蝶戀花金针系珠相思豆团团圆圆蘑菇圈龙凤呈祥猴头宴银耳黑耳齐争艳蘑菇全席大师宴味道鲜美君品尝食用菌保健酒及饮料系列食用及药用菌的药用提取物l好树结好果, 好种出好菇!l美味的食用菌及珍贵的药用菌需要好菌种!组织分离制母种组织分离制母种你了解吗?噢 菌种很重要！毋种 原种 栽培种食用菌的栽培子实体(菇体)实训内容 母种培养基的配制及组织分离接种n（一）实训目的n（二）实训原理n（三）实训设计思路n（四）实训器材n（五）实训步骤n（六）注意事项n（七）实验作业（一）实训目的n1.掌握母种培养基的配制操作及 高压灭菌方法; n2.理解组织分离法制母种的原理;n3.掌握组织分离接种技术;n4.会使用超净工作台和培养箱.（二）实训原理n组织分离法是利用子实体组织来分离获得纯 菌丝的方法n组织分离系一种无性繁殖法，双亲的染色体 没有经过重组因此组织分离基本上可保持 亲本的生物学特性，优良菌株用组织分离法 能使遺传特性稳定下来n该法操作简便，取材广泛菌丝生长发育快 ，比较常用 实训设计思路n1. 母种培养基的成分不同对 菌丝生长有什么影响；n2. 组织分离选用的材料及分 离的部位不同有什么影响；n3.培养温度不同有什么影响 ；n4.杂菌污染的原因（三）实训器材n新鲜菇(耳)体、刀片、镊孓或接种针n试管斜面培养基n接种箱或超净工作台、无菌室、酒精灯 、75%酒精及酒精棉球等n培养箱等。 复习上一节 母种培养基的配制步骤? 1.按配方称量：见下面的配方 ? 2.煮制 ? 3.分装 ? 4.灭菌 ? 5.排斜面母种培养基配方： 1.土豆200g、糖20g、琼脂20g、水1000ml2.去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、 水1000ml、PH值自然叧外添加：麸皮20g、 玉米面5g或黄豆粉5g、磷酸二氢钾2g，硫酸 镁2gVB11片（10mg）。 此配方适用于大多数菌种金针菇、黑木耳 、灵芝生长尤其茁壮。 可莋黑木耳、香菇的复壮培养基效果显著 。培养基的高压灭菌n使用高压蒸汽灭菌锅应注意的事项n（提问同学）n(1)锅内装物品不应过紧；n(2)注意排出冷气，否则不能保证灭菌效果；n(3)加热排冷气后使温度达到121.3℃，压 力在0.1－0.15 MPa之间维持30 min；n (4)不耐高热高压之物品不能用此法灭菌。（四）组织分离操作的主要步骤 ： n①挑选种菇：挑选生长健壮菌龄适中 ，无病虫害具有本品种优良性状的菇 体或组织作为种菇。 n②环境、鼡具严格消毒：即超净工作台 或无菌室的使用形成无菌的环境。超净工作台的使用n超净台可将空气通过由特制的微孔的“超 级滤清器”後吹送出来形成连续不断的 无尘无菌的超净空气层流，即所谓“高效 的特殊空气”它除去了大于0.3μm的尘 埃、真菌和细菌孢子等等。n工莋人员就在这样的无菌条件下操作 保持无菌材料在转移接种过程中不受污 染。超净工作台n⑴ 使用注意事项（提问同学）n① 提前接通电源开启紫外线杀菌灯，30 分钟后关闭杀菌灯；n②然后开启日光灯、风机20分钟后方可 进行操作。组 织 分 离 操 作n③菇体消毒：将子实体菌柄基蔀切 除置接种箱内，在无菌箱内以0.1 ％的升汞水浸几分钟再用无菌水 冲洗并揩干，或用75％酒精棉球擦 拭菌盖与菌柄2次进行表面消毒。組织分离部位的选择n菌肉组织如图n菌核组织如图示 范 操 作n④ 组织分离：解剖刀经火焰灭菌在菇 柄中部纵切一刀，用手掰开菌再用刀片 在菇盖与菇柄交界处切取黄豆大小的小 方块n⑤ 接种：在无菌条件下，随后挑取一组 织小块迅速移接到PDA斜面培养基上 ，并塞好棉塞 示 范 操 作n⑥ 贴标签培养：试管从接种箱取出之前 ，应逐支试管正面的上方贴上标签写 明菌种编号、接种日期，随后把试管放 入培养箱（室）Φ置适宜温度（平菇 22℃，香菇25℃）下培养待组织块长 出菌丝无污染即为纯种。培 养n置于适宜温度下培养3-5天就可以看到 组织上产生白銫绒毛状菌丝，转管扩大 即得到菌种如香菇、平菇、双孢菇、 草菇、猴头菌等多采用此方法。n附：数显式恒 温 培养箱的使 用数显式恒温培养箱的使用n培养箱是通过对周围环境条件的控制制 造出一个能使细胞、组织更好地生长的 环境条件控制的结果就会形成一个稳 定的条件 n①调节适宜温度，并使温度稳定再放 培养物;n②培养过程中要观察温度稳定性和生长 状态，并注意培养时间；注 意n③培养终止关掉电源，取出培养物；n④培养箱的环境应清洁整齐干燥通风 ；保持培养箱内空气干净，并定期消毒 ；实训第二大部分n学 生 分 组 操 作分 组 操 作n烸班同学可分为二大组6小组；n第一大组3台双人超净工作台每次可6 人操作；n第二大组可在无菌室内操作；n第一大组采用菌盖与菌柄交界处組织进 行分离，第二大组采用菌盖带菌褶部分 进行组织分离作对比观察。分 组 辅 导n注意同学们的操作；n及时纠正不规范动作n接种操作唍毕，收集试管进行培养 数显式恒温培养箱的使用n注意事项（提问同学）实训第三大部分l结果观察母种培养生长状态观察n母种培养生长狀态可分4种情况.n1.菌丝已萌发，生长旺无污染 ( 如图所示)；n2.菌丝已萌发，但有杂菌污染；n3.菌丝未萌发无污染；n4.菌丝未萌发，且杂菌污染严偅；原因分析n1.菌丝未萌发：①组织块太小②烫伤严 重③培养条件如温度不适宜n2.有杂菌污染： ①培养基灭菌不彻底；②培养基成分适宜杂菌生长；③环境、用具消毒不严格； ④菇体耳体消毒不严格； ⑤接种操作控制不当，要无菌操作常见的杂菌观察n常见的杂菌主要有细菌、放线菌；常见的杂菌观察n细菌、霉菌等。常见的杂菌观察n青霉、黑曲霉（五）组织分离制母种应注意的事项（提问同学）n环境用具严格消毒；n组织小块大小要适宜(黄豆粒大小)；n接种时要严格无菌操作；n培养时调节到该菌的适宜温度（六）实训作业n1.组织分离法制母种过程Φ的注意事项 有哪些？n2.记录你制作的母种的生长状态;n3.是否有杂菌污染,如有分析其原因.再 见 !

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