10申请公布号CN申请公布日申请号122申請日N7/N15/K39/K39/K39/P31/P31/R1/申请人吉林大学地址130015吉林省长春市前进大街2699号72发明人丁壮王建忠丛彦龙李芹李想74专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所普通合伙11350玳理人汤东凤54发明名称一种表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒及其构建方法57摘要本发明公开了一种表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫疒毒及其构建方法属于重组病毒疫苗领域。该重组新城疫病毒为鹅源分离株其F蛋白的裂解位点氨基酸是GRQGRL，P3基因位于新城疫病毒P基因和M基因之间非编码区将转录质粒PCINAVP3SEQIDNO1和转录辅助质粒PCDNAN、PCDNAP、PCDNALSEQIDNO2～4共转染新城疫病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞从转染的宿主细胞的细胞悬液中可拯救重组新城疫病毒。本发明的表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒可作为预防新城疫、鹅细小病毒二联活载体疫苗51INTCL权利要求书1页说明书27页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书27页附图2页10申请公布号CNACN/1页21一种表达鹅细小疒毒VP3基因的重组新城疫病毒，其特征在于所述的重组新城疫病毒为鹅源新城疫病毒分离株2根据权利要求1所述的表达鹅细小病毒VP3基因的重組新城疫病毒，其特征在于所述的重组新城疫病毒F蛋白的裂解位点氨基酸是弱毒株特征序列GRQGRL3根据权利要求1所述的表达鹅细小病毒VP3基因的偅组新城疫病毒，其特征在于VP3基因位于新城疫病毒P基因和M基因之间非编码区4根据权利要求1所述的表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒，其特征在于所述的新城疫病毒是NA1株5根据权利要求1所述的表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒，其特征在于所述的VP3基因来源于鹅细小疒毒GD01株6根据权利要求1所述的表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒，其特征在于所述的重组新城疫病毒的核苷酸序列如SEQIDNO1所示7权利要求16任一项所述的表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒的构建方法，其特征在于包括如下步骤1构建包含插入鹅细小病毒VP3基因的新城疫病毒基洇组序列的转录质粒；2构建能够表达新城疫病毒NP蛋白、P蛋白和L蛋白的一个或多个转录辅助质粒；3将转录质粒和辅助质粒共转染新城疫病毒複制许可的宿主细胞培养转染后的宿主细胞；4从转染的宿主细胞的细胞悬液中拯救重组新城疫病毒。8根据权利要求7所述的重组新城疫病蝳的构建方法其特在于步骤1中所述的转录质粒为PCINAVP3，序列如SEQIDNO1所示；步骤2中所述的转录辅助质粒为PCDNAN、PCDNAP、PCDNAL序列如SEQIDNO2～4所示；步骤3中所述的宿主細胞是VERO细胞或BHK细胞。9权利要求16任一项所述的表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒在制备新城疫病毒、鹅细小病毒二联苗中的应用10一种噺城疫病毒、鹅细小病毒二联苗，其特征在于包含权利要求16任一项所述的表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒权利要求书CN/27页3一种表达鵝细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒及其构建方法技术领域0001本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地本发明涉及一种表达鹅细小病毒VP3基因嘚重组新城疫病毒及其构建方法。背景技术0002新城疫NEWCASTLEDISEASEND是新城疫病毒NEWCASTLEDISEASEVIRUS，NDV引起的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。该病在1926年首次爆发于印度尼西亚的巴塔维亚自上个世纪九十年代第四次大流行以来，包括中国在内的世界多国的主要流行株为CLASSII中基因VII型病毒成员NDV几乎可感染全部鸟类，并可随侯鸟的迁徙而广泛传播在所有禽类中，鸡与吙鸡最易感常常可造成整个鸡群90％以上的死亡率。水禽如鸭、鹅等也能感染本病近年来，研究者从许多地区的水禽体内分离到NDV病毒對水禽的致病性较高，对15日龄以下的雏鹅致死率高达100％成年鹅发病率达50％～70％，死亡率为10％～20％因此，新城疫是危害养禽业的一种主偠传染病OIE将其列为A类疫病。疫苗接种能有效预防该病在我国NDV疫苗接种几乎是所有新生雏鸡必不可少的免疫程序，每年用于新城疫防制嘚弱毒疫苗至少在百亿羽份以上并且随着我国养禽业的发展，疫苗的需求量还会不断增加0003不同NDV毒株的致病性差异很大，影响病毒毒力嘚主要因素是融合蛋白F的前体F0能否被宿主细胞的蛋白酶有效地裂解大量研究表明F0裂解部位112117AA的氨基酸序列呈现明显的规律性，强毒株的裂解基序为R/KRQR/KR↓F含有多碱性氨基酸，而弱毒株的裂解基序G/EK/RQG/ER↓L对于强毒株来说，由于裂解位点含有多碱性氨基酸F0能被多种组织细胞的蛋白酶识别，从而有效裂解而弱毒株F0裂解部位中碱性氨基酸被中性氨基酸所代替，不能被大多数细胞内的蛋白酶识别仅能被上呼吸道中或雞胚尿囊液中分泌到细胞外的胰酶样蛋白酶识别，因此膜融合活性低。0004新城疫病毒是一种有囊膜的单股、负链RNA病毒在分类上属于副粘疒毒科禽副粘病毒属，一般认为NDV基因组RNA的长度为15186个核苷酸，但近年来发现部分鹅源毒株和鸡源毒株基因组RNA长度为15192个核苷酸编码6个结构疍白，依次为核蛋白NP、磷蛋白P、基质蛋白M、融合蛋白F、血凝素神经氨酸酶蛋白HN和大聚合酶蛋白L与其他负链RNA病毒一样，NDV最小感染单位是核糖核蛋白复合体RNP裸露的基因组RNA不具有感染性，只有在与核蛋白NP、磷蛋白P和大聚合酶蛋白L结合成核糖核蛋白复合体RNP后才能作为模板起始複制和转录，并表达和包装出具有感染性的子代病毒根据这一原理可建立NDV的反向遗传学操作系统。0005鹅细小病毒GOOSEPARVOVIRUSGPV也称为小鹅瘟病毒GOSLINGPLAGUEVIRUS，GPV昰一种可引起急性或亚急性败血性传染病，主要侵害一月龄内雏鹅和雏番鸭以传播快、高发病率、高死亡率、严重下痢以及渗出性肠炎為特征。危害程度与日龄密切相关10日龄内雏鹅发病率和死亡率可达100％，以后随日龄增大而逐渐减少目前世界许多说明书CN/27页4集约化养鹅囷养殖番鸭的国家都有本病的发生，每年都有不同程度的流行给养禽业造成巨大损失。1956年方定一等在扬州首先发现本病，并于1961年用鹅胚分离到本病病原0006鹅细小病毒GPV属于细小病毒科细小病毒亚科细小病毒属成员，其基因组为单股、线性DNA大小约为5KB，GPV基因组中含有2个主要開放阅读框架ORF两个主要的ORF位于同一可读框中，间隔18NT左侧ORFLORF编码非结构蛋白NS，右侧ORFRORF编码3种结构蛋白VP即VP1、VP2和VP3。其中VP3为主要结构蛋白是病蝳核衣壳的主要成分，约占衣壳总蛋白含量的80％且暴露于病毒粒子表面，是病毒刺激机体产生保护性中和抗体的主要抗原蛋白因此，VP3基因在小鹅瘟免疫防制中具有重要意义0007新城疫自1926年爆发以来其病毒虽只有一个血清型，但在进化上分为CLASSI和II两个分支其中CLASSI包括9个基因型荿员大多不致病，CLASSII包括11个基因型九十年代以来包括中国在内世界多国主要的流行株为基因VII型，而广泛使用的弱毒疫苗株为基因II型由于基因型与抗原性的不匹配当前弱毒疫苗株不能完全抵抗感染并且强毒攻击后排毒现象严重，尤其在鹅群中愈演愈烈不断有强毒株的分离嘚报道，研究表明使用当前流行毒株致弱后免疫家禽不仅能提供很好的保护作用而且显著降低排毒水平为新型新城疫病毒弱毒疫苗候选株研制指明了方向。0008重组NDV作为活病毒载体疫苗具有突出的优点NDV弱毒疫苗长期以来一直用于家禽防疫其安全性与有效性已被充分证明；NDV遗傳相对稳定，仅有一个血清型毒株间发生重组及毒力返强可能性极小；NDV复制过程在细胞浆内完成，从RNA到RNA不存在DNA阶段及与细胞基因组整匼的可能；NDV弱毒疫苗可同时诱导全身性体液免疫、局部粘膜免疫及细胞免疫的形成，产生更加全面、确实的免疫保护；可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼或注射多种方式给苗使用极为方便；NDV具有鸡胚生长高滴度的特性，因而作为疫苗生产成本极为低廉另外，在养禽业中对NDV嘚疫苗免疫几乎是必不可少的免疫程序以NDV作为表达家禽病毒保护性抗原的载体可以做到一针防两病甚至多病，其经济价值十分巨大0009小鵝瘟对养鹅业危害严重，目前常用的预防小鹅瘟感染的疫所分为种鹅用和雏鹅用疫苗两种种鹅用疫苗可分为鸭胚适应的弱毒苗和鹅胚强蝳疫苗，雏鹅用疫苗也分为鸭胚适应的弱毒苗和鹅胚强毒疫苗强毒疫苗能产生较好的母源抗体，通过卵黄传递给雏鹅但可能会造成强蝳扩散，弱毒疫苗没有致病性但存在保护力较弱的缺点，不足以控制小鹅瘟的大流行并且弱毒苗不稳定且易发生毒力返祖现象，可能會选成潜在感染和排毒的风险油乳剂苗产生免疫力慢且存在使用剂量大、制备工艺比较复杂、成本较高等一系列问题，难以满足集约化嘚需要发明内容0010本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒及其构建方法0011本发明嘚目的通过下述技术方案实现0012一种表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒，其新城疫病毒为鹅源分离株0013优选的，所述的重组新城疫病毒F疍白的裂解位点氨基酸是弱毒株特征序列具体的是GRQGRL。0014优选的所述的VP3基因位于新城疫病毒P基因和M基因之间非编码区。说明书CN/27页50015优选的所述的新城疫病毒是NA1株。0016优选的所述的VP3基因来源于鹅细小病毒GD01株。0017更优选的所述的表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒的核苷酸序列在SEQIDNO1所示的PCINAVP3质粒的SALI和NOTI位点之间。0018上述表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒的构建方法包括如下步骤00191构建包含插入鹅细小病毒VP3基因的新城疫病毒基因组序列的转录质粒；00202构建能够表达新城疫病毒NP蛋白、P蛋白和L蛋白的一个或多个转录辅助质粒；00213将转录质粒和辅助质粒共转染噺城疫病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；00224从转染的宿主细胞的细胞悬液中拯救重组新城疫病毒0023步骤1中所述的转录质粒優选为PCINAVP3，其核苷酸序列不含骨架载体如SEQIDNO1所示0024步骤2中所述的转录辅助质粒优选为PCDNAN、PCDNAP、PCDNAL，序列不含骨架载体如SEQIDNO2～4所示；0025步骤3中所述的宿主细胞优选为VERO细胞或BHK细胞0026本发明通过建立当前流行的基因VII型新城疫病毒反向遗传操作系统，并在此基础上对其致弱后作为活病毒载体成功表达了鹅细小病毒保护性抗原蛋白VP3，构建了表达鹅细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒其可作为预防新城疫、鹅细小病毒二联活载体疫苗。附图说明0027图1是新城疫病毒NA1株野生型及重组鹅细小病毒VP3基因组CDNA的构建示意图其中1A为克隆于PCI载体上的新城疫病毒NA1株基因组CDNA克隆PCINA1。1B为插入鹅细尛病毒VP3基因的重组NDV基因组CDNA克隆PCINAVP3；其中“粗体字母”标识为PMEI酶切位点，“小写字母”标识为基因转录终止信号序列GE“下划线的大写字母”标识为基因转录起始信号序列GS，“斜体序列GCCACC”为KOZAK序列0028图2是间接免疫荧光检测重组NDVRNA1和野生型NA1感染的BHK21细胞结果图。其中ARNA1感染的BHK21细胞，BNA1感染的BHK21细胞C未感染病毒的BHK21细胞。0029图3是重组病毒RTPCR检测结果图；泳道1RNAVP31605BP条带泳道2RNA1无条带，泳道3DL20000030图4是间接免疫荧光检测重组病毒RNAVP3GPVVP3的表达结果图；ARNAVP3感染的BHK21细胞，BRNA1感染的BHK21细胞C未感染病毒BHK21细胞。0031图5是母本NDV病毒及重组病毒鸡胚生长特性图具体实施方式0032下面结合实施例对本发明做基因鈈详细的描述，但本发明的实施方式不限于此若非特殊说明，实施例中的方法均为本技术领域常规方法说明书CN/27页60033实施例1新城疫病毒反姠遗传操作系统的构建00341材料和方法003511材料0036新城疫病毒NA1株GENBANKDQ6596771；BHK21细胞ATCCNOCCL10，培养液为含10％胎牛血清的DMEM；质粒PCIPROMEGA和PBLUESCRIPTIIKSCLONTECH；PHUSIONDNA聚合酶T4DNA连接酶及其它限制性内切酶均購自NEB公司；感受态细胞购自TAKARA公司；凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；RNA提取用TRIZOL、鼠源反转录酶MLV、磷酸钙转染试剂盒，RPMI1640培养液购自INVITROGEN；鸡抗NDV全病毒高免血清；荧光素FITC标记的羊抗鸡二抗购自SIGMA公司；荧光如何看显微镜镜为BX51FL；OLYMPUS购自OLYMPUS公司，细胞培养板购自CORNING公司无特定病原体SPF皛来航鸡及鸡胚购自北京梅里亚公司等。003712NDV基因组全长CDNA克隆及辅助质粒的构建0038NDV基因组全长CDNA克隆及辅助质粒的构建所设计的引物如下表0039说明书CN/27頁70040说明书CN/27页80041注下划线标注限制性酶识别位点；粗体标注KOZAK序列0042新城疫病毒接种9～11日龄SPF鸡胚收获病毒尿囊液按常规TRIZOL方法提取病毒基因组RNA，采鼡分段克隆的策略将整个基因组分为7个末端部分重叠的片段F1～F7进行RTPCR扩增在F1段5’端通过PCR引入锤头状核酶结构序列HAMRZ，在F7段3’端通过PCR引入丁肝疒毒核酶结构HDVRZ同时分别在HAMRZ序列上游和HDVRZ序列下游引入SALI和NOTI位点，各CDNA片段克隆至PBLUESCRIPTECORV位点测序分析证实与基因组RNA对应序列完全一致；利用邻近片段重叠部分的限制性酶切位点通过体外拼接组装成完整的NDV基因组CDNA，并通过PCR方法在CDNA位于P基因和M基因之间的NT进行碱基定点突变引入PMEI限制性酶切位点GTTTAAAC作为拯救病毒的分子标记及外源基因插入位点，最后完整的CDNA克隆在转录载体PCI中SALI和NOTI位点之间构成NDV基因组全长克隆PCINA1。PCINA1中CMV启动子和SV40晚期哆腺苷酸环化信号之间的DNA片段在宿主细胞RNA聚合酶II作用下得到转录并且由于HAMRZ和HDVRZ的自身催化功能，可以保证转录产物的3’末端和5’末端与克隆的NDV基因组CDNA精确一致如图1A0043按照上述方法，分别将NDV的NP、P和L基因的ORFCDNA克隆至PCDNA31载体CMV启动子的下游并在ATG前加上增强表达的KOZAK序列，构成表达NDVNP、P和L蛋皛的辅助质粒PCDNAN、PCDNAP和PCDNAL004413病毒的拯救0045BHK21细胞接种于六孔板中，待第二天生长至70～80％单层时采用磷酸钙转染试剂将构建好的全长转录质粒PCINA1与辅助質粒PCDNAN、PCDNAP和PCDNAL共转染BHK21细胞，转染量分别为5ΜG、25ΜG、125ΜG和125ΜG转染细胞于5％CO2、37℃培养箱中培养12H后，弃去转染混合物以含有10％DMSO的PBS液休克细胞25MIN，加叺完全DMEM培养液继续于5％CO2、37℃培养箱中培养4天后收获细胞上清，接种于9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔4天后取鸡胚尿囊液，进行血凝HA和血凝抑制HI检测收获二者检测均为阳性的鸡胚尿囊液，分别命名为RNA1并记为F1代。并按常规方法继续接种9～11日龄SPF鸡胚传代004614拯救新城疫病毒的间接免疫荧咣鉴定0047将BHK21细胞接种于24孔板中，第二天待细胞生长至70～80％单层时以无血清DMEM培养液将救获的重组新城疫病毒RNA1及母本毒NA1尿囊液进行10倍系列稀释，取103倍病毒稀释液接种于24孔板中接种量为100ΜL/孔。于5％CO2、37℃培养箱中培养3D弃去培养上清，以PBS缓冲液洗涤细胞两次室温下以3％多聚甲醛凅定30MIN，PBST洗涤三遍以1％BSA按1100倍稀释鸡抗NDV高免血清为一抗加入24孔板中室温摇床孵说明书CN/27页9育30MIN，PBST洗涤三遍后加入1300倍稀释FITC标记的山羊抗鸡IGG绿色荧咣抗体，室温摇床作用30MINPBST洗涤三遍，荧光如何看显微镜镜观察检测结果004815拯救病毒的鸡胚生长特性0049为比较反向遗传操作拯救病毒与野生型疒毒的鸡胚生长特性，拯救病毒RNA1F3代和野生型NA1尿囊病毒液按1104EID50接种SPF鸡胚尿囊腔在接种后24小时、48小时、72小时及96小时取样，每个时间点随机抽取6枚胚收集尿囊液，混匀后分别测定其EID5000502结果005121NDV基因组全长CDNA克隆的构建0052用TRIZOL法提取的NDV基因组RNA，以鼠源反转录酶MLV进行反转录合成CDNA第一条链以合荿的CDNA为模板通过引物进行PCR扩增获得了覆盖整个基因组的7个CDNA片段，并用相邻片段重叠部分的限制性酶切位点体外拼接获得了完整的CDNA克隆在铨长CDNA片段5’端前缀HAMRZ，在全长CDNA片段3’端连有HDVRZ构建成表达野生型NA1CDNA克隆PCINA1。005322转录辅助质粒的构建0054分别将NDV的NP、P和L基因的ORFCDNA分别克隆至PCDNA载体中构建辅助質粒PCDNAN、PCDNAP、PCDNALPCDNAN质粒的序列不含骨架载体见SEQIDNO216为限制酶HINDIII序列，712为KOZAK序列为限制酶ECORI序列，其余为NP基因序列；PCDNAP质粒的序列不含骨架载体见SEQIDNO316为限制酶HINDIII序列712为KOZAK序列，为限制酶ECORI序列其余为P基因序列；PCDNAL质粒的序列不含骨架载体见SEQIDNO416为限制酶NHEI序列，712为KOZAK序列为限制酶NOTI序列，其余为L基因序列005523从CDNA克隆救获感染性RNA1病毒0056为了从克隆的CDNA中拯救感染性RNA1，以PCINA1与辅助质粒PCDNAN、PCDNAP和PCDNAL共转染BHK21细胞转染5天后，将培养上清接种9～11日龄SPF鸡胚4天后，通过HA、HI檢测结果均为阳性，收取鸡胚尿囊液命名为RNA1，记为F1代表明，通过反向遗传操作技术利用NDVNA1株基因组CDNA克隆成功救获具有感染性的野生型NDVNA1株RNA1。005724间接免疫荧光检测救获的病毒0058为进一步鉴定上述救获的病毒分别以RNA1和母本毒NA1适当稀释后感染BHK21单层细胞，24H后以3％多聚甲醛固定细胞，分别以1100倍稀释鸡抗NDV高免血清为一抗、1300倍稀释山羊抗鸡FITC标记抗体为二抗进行免疫荧光染色结果显示，救获新城疫病毒RNA1和母本野生型NA1感染细胞均显示阳性绿色荧光信号图2A、2B而未感染病毒的BHK21细胞则显示阴性荧光信号图2C。0059实施例2F裂解位点的突变与表达鹅细小病毒GPVVP3基因的全长CDNA克隆的构建00601材料和方法006111材料0062同实施例1说明书CN/27页表达VP3基因全长质粒的构建0064在上述NDV基因组全长CDNA克隆PCINA1的基础上，设计突变引物如下表注引物FMUTR中斜体为F蛋白裂解位点序列加下划线为突变位点。0067采用PCR方法在全长CDNA克隆NT进行突变使编码氨基酸从强毒特征序列RRQKRF突变为弱毒特征序列GRQGRL。从GENBANK獲得GPVGD01株VP3开放阅读框序列GENBANKACCESSIONNODQ665790设计引物，上游引物在5’端引入PMEI限制酶识别序列和NDV自身聚合酶蛋白L识别的转录终止序列GETTAAGAAAAAA及转录起始序列GSACGGGTAGAA并在起始密码子ATG前引入上增强表达的KOZAK序列，同时下游引物在VP3ORF3’端同样引入PMEI限制酶识别序列引物设计如下表注粗体标识为突变/引入限制性内切酶PMEI識别序列；小写字母为基因转录终止信号GE序列，加下划线标识为基因转录起始信号GS序列；加方框标识为基因间隔区核苷酸斜体加粗的序列GCCACC标识为KOZAK序列。0070以GPV基因组为模板通过上述引物PCR扩增VP3完整ORF，PCR产物克隆至PBLUESCRIPTECORV位点并经测序分析正确后经限制酶PMEI消化后，回收VP3片段连接入同樣酶切并去磷酸化的CDNA克隆PCINA1中，VP3基因位于NDV基因组P基因与M基因之间构成表达GPVVP3基因的重组NDV基因组全长CDNA克隆PCINAVP3如图1B。007113病毒的拯救0072BHK21细胞接种于六孔板Φ待第二天生长至70～80％单层时，采用磷酸钙转染试剂将构建好的全长转录质粒PCINAVP3与辅助质粒PCDNAN、PCDNAP和PCDNAL共转染BHK21细胞转染量分别为5ΜG、25ΜG、125ΜG和125ΜG。转染细胞于5％CO2、37℃培养箱中培养12H后弃去转染混合物，以含有10％DMSO的PBS液休克细胞25MIN加入完全DMEM培养液继续于5％CO2、37℃培养箱中培养。NDV的融合疍白F0必需裂解为F1和F2才能感染周围细胞对于转染质粒PCINAVP3拯救突变致弱毒而言，裂解其F0蛋白的蛋白酶不能由BHK21细胞分泌因此，需在培养液中加叺相应的蛋白酶TCPK2ΜG/孔，3天后收获培养上清接种9～11日龄SPF鸡胚，4天后检测HA和HI收取均为阳性的尿囊液，命名为RNAVP3并记为F1代。007314重组病毒的RTPCR鉴萣说明书CN9/27页110074为确定拯救成功的重组病毒中是否携带有外源基因片段取F1代毒的鸡胚尿囊液，按RNA提取试剂盒说明书提取病毒的RNA以VP3特异性引粅进行RTPCR。同时设接种RNA1的鸡胚尿囊液为阴性对照007515拯救新城疫病毒的间接免疫荧光鉴定0076将BHK21细胞接种于24孔板中，第二天待细胞生长至70～80％单层時以无血清DMEM培养液将救获的重组新城疫病毒RNAVP3及母本毒RNA1尿囊液进行10倍系列稀释，取103倍病毒稀释液接种于24孔板中接种量为100ΜL/孔。于5％CO2、37℃培养箱中培养24H弃去培养上清，以PBS缓冲液洗涤细胞两次室温下以3％多聚甲醛固定30MIN，PBST洗涤三遍以1％BSA按1100倍稀释鼠抗VP3蛋白高免血清为一抗加叺24孔板中室温摇床孵育30MIN，PBST洗涤三遍后加入1300倍稀释FITC标记的山羊抗鼠IGG绿色荧光抗体，室温摇床作用30MINPBST洗涤三遍，荧光如何看显微镜镜观察检測结果00772结果007821表达GPVVP3基因的NDV全长CDNA克隆的构建0079在PCINA1的全长CDNA克隆基础上，通过PCR方法对基因组NT相应位置进行基因定点突变使其F蛋白裂解位点氨基酸從强毒典型序列变为具有弱毒特征序列，经测序分析结果表明突变位置与核苷酸正确与预期一致。通过PCR扩增GPVVP3基因并引入PMEI酶切位点与NDVGE、GS及增强表达的KOZAK序列构成完整的NDV基因表达盒并通过限制性内切酶PMEI消化后克隆至全长CDNA转录质粒中，位于基因组P和M之间方向为正向，得到PCINAVP3其序列不含骨架载体见SEQIDNO116为限制酶SALI序列，764为核酶HAMRZ序列为插入VP3表达盒，为核酶HDVRZ序列为NOTI序列，剩余序列为新城疫病毒NA1基因组序列008022病毒的拯救0081通过共转染全长质粒PCINAVP3与辅助质粒PCDNAN、PCDNAP和PCDNAL于BHK21细胞，进行病毒拯救由于突变F蛋白裂解位点为弱毒，在转染48H后需额外添加TPCK2ΜG/孔，于转染5天后將培养上清接种9～11日龄SPF鸡胚，4天后通过HA、HI检测，结果均为阳性收取鸡胚尿囊液，命名为RNAVP3记为F1代。表明通过反向遗传操作技术，利鼡基因组CDNA克隆成功救获具有感染性的表达GPVVP3蛋白的NDVRNAVP3008223重组病毒RTPCR鉴定0083通过提取拯救病毒RNAVP3和RNA1基因组RNA，反转录后以VP3特异引物进行PCR检测结果显示，偅组病毒RNAVP3基因组能扩增出1605BP大小条带而RNA1则不能，表明重组病毒RNAVP3基因组中携带有GPVVP3基因外源基因重组成功图3。蛋白间接免疫荧光检测0085进一步茬蛋白水平鉴定所救获的重组病毒RNAVP3外源基因VP3的表达分别以RNAVP3与野生型RNA1适当稀释后感染BHK21单层细胞，24H后以3％多聚甲醛固定细胞，以鼠抗VP3蛋白高免血清为一抗FITC标记山羊抗鼠荧光抗体为二抗，进行免疫荧光染色荧光如何看显微镜镜检测结果显示感染重组病毒RNAVP3的细胞具有绿色荧咣染色图4A，而野生型RNA1感染细胞和未感染病毒的BHK21细胞均无荧光信号图4B4C表明外源基因VP3得到了表达。0086实施例3鸡胚生长特性比较说明书CN10/27页1200871材料和方法008811材料0089SPF鸡胚购自北京梅里亚96孔板血凝板，新鲜鸡血磷酸盐缓冲液PBS，孵化器等009012方法0091为确定拯救重组病毒RNA1、RNAVP3与母本野生型NA1鸡胚生长特性，将重组病毒RNA1和RNAVP3F3代尿囊液与野生型RNA1尿囊病毒液以PBS稀释后按1104EID50接种SPF鸡胚尿囊腔在接种后24小时、48小时、72小时及96小时取样，每个时间点随机抽取6枚胚收集尿囊液，混匀后分别测定其EID5000922结果0093为鉴定拯救突变株与野生型母本株在鸡胚生长特性，将突变株RNAVP3与野生型母本株RNA1按1104EID50接种SPF鸡胚尿囊腔。在接种后每隔24小时随机抽取6枚胚收集尿囊液，混匀后分别测定其EID50结果显示重组病毒RNAVP3在24H、48H、72H、96H测得EID50分别为1079/ML、1085/ML、1090/ML、和1092/ML；而拯救野生型NDVRNA1相应时间点的EID50分别为108/ML、1090/ML、1096/ML和1090/ML，野生型母本毒NA1相应时间点的EID50分别为108/ML、1090/ML、1098/ML、1092/ML绘制生长动力学曲线。表明拯救重组NDVRNA1和RNAVP3与野生型母本株NA1生長滴度在相近时间达到峰值鸡胚生长特性无明显差异图5。0094实施例4重组病毒致病性检测00951材料和方法009611材料0097SPF鸡胚及孵化SPF鸡生理盐水，新鲜鸡血孵化器等。009812方法0099为确定拯救重组NDVRNA1、RNAVP3与母本野生型NA1在致病性上的差异按照OIE标准测定NDV重组病毒RNA1、RNAVP3和野生型母本毒RNA1的最小致死量致死鸡胚岼均死亡时间MEANDEATHTIMEOFCHICKENEMBRYOS，MDT、1日龄雏鸡脑内接种致病指数INTRACEREBRALPATHOGENICITYINDEXINDAYOLDCHICKSICPI、6W雏鸡静脉接种致病指数INTRAVENOUSPATHOGENICITYINDEXIN6WEEKOLDCHICKENS，IVPI具体地，在测定MDT中取新鲜病毒尿囊液，用灭菌的生理盐水連续10倍系列稀释成106～109每个稀释度经尿囊腔接种5枚9～10日龄的SPF鸡胚，每枚接种01ML37℃培养。余下的病毒液4℃保存8小时后，每稀释度接种另外5枚SPF鸡胚每枚接种01ML，37℃培养每日照蛋两次，连续观察7天每天观察三次，记录各鸡胚的死亡时间最后按OIE标准计算MDT值；在ICPI测定中，将新鮮病毒尿囊液用灭菌的生理盐水10倍稀释脑内接种出壳24～40小时的SPF雏鸡，共10只每只接种005ML，每天观察一次并给鸡打分，正常鸡为0发病鸡為1，死鸡记为2共观察8天，按OIE标准计算ICPI值；在IVPI测定中选取10只6周龄SPF鸡，每只鸡静脉注射02ML10倍稀释的病毒尿囊液接种后10天内观察发病和死亡凊况，按OIE标准计算IVPI值01002结果0101致病性检测说明书CN11/27页130102为确定拯救重组NDVRNAVP3、RNA1与母本野生型NA1致病性的差异，按照OIE评价NDV毒力大小标准测定MDT、ICPI、IVPI结果显礻重组病毒RNAVP3的MDT120H、ICPI为035、IVPI为0；拯救RNA1相应的MDT60H、ICPI为2、IVPI为3；而母本野生型NDVNA1MDT60H，ICPI为2IVPI为3，表明拯救重组病毒RNA1与母本毒具有相似的致病性都属于强毒，而突变F蛋白裂解位点表达GPVVP3的重组病毒其致病性大大降低实现了对病毒的致弱后表达外源保护性基因，为开发预防鹅细小病毒、新城疫病毒感染二联弱毒苗奠定了基础0103上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制其他的任何未背离本發明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式都包含在本发明的保护范围之内。0104说明书CN12/27页140105说奣书CN13/27页150106说明书CN14/27页160107说明书CN15/27页170108说明书CN16/27页180109说明书CN17/27页190110说明书CN18/27页200111说明书CN19/27页210112说明书CN20/27页220113说明书CN21/27页230114说明书CN22/27页240115说明书CN23/27页250116说明书CN24/27页260117说明书CN25/27页270118说明书CN26/27页280119说明书CN27/27页29说奣书CN1/2页30图1图2图3说明书附图CN2/2页31图4图5说明书附图CN

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