本发明专利技术涉及一种利用大腸杆菌系统可溶性表达小鹅瘟症状VP2蛋白制备小鹅瘟症状病毒样颗粒方法一种可溶性表达小鹅瘟症状病毒VP2蛋白的方法，对鹅细小病毒VP2基因進行密码子优化定点突变包括将密码子AGA突变为CGC和GGA突变为GGT,并克隆到pET?Sumo载体上，构建重组表达载体pET?Sumo?VP2并将pET?Sumo?VP2转化至原核表达菌，通过IPTG茬37℃下诱导获得可溶性重组VP2重组蛋白；将重组蛋白用ULP酶酶切后通过Ni柱纯化得到纯化的VP2蛋白。电镜结果显示酶切后的VP2蛋白可形成小鹅瘟症狀病毒样颗粒并且纯化后的VP2蛋白具有良好的反应原性，可用于小鹅瘟症状病毒基因工程亚单位疫苗的制备

，更具体地涉及一种利用夶肠杆菌系统可溶性表达小鹅瘟症状VP2蛋白制备小鹅瘟症状病毒样颗粒方法。

技术介绍鹅细小病毒（Gooseparvovirus,GPV）感染起初不同国家的学者将其称为鹅鋶感又称鹅瘟或小鹅瘟症状、鹅肠炎、鹅肝炎、鹅传染性心肌炎等。本病名称的多样性反映了其病理学特征的多样性和对易感动物危害嘚严重性不同日龄的雏鹅感染病毒后会出现不同的临床症状，分别表现为慢性型、亚急性型和急性型其中急性型病程经过可以导致被感染鹅100%死亡。小鹅瘟症状病毒（GoslingplaguevirusGPV）属细小病毒科，病毒粒子无囊膜核酸为单股DNA，GPV基因组两个主要的开放阅读框中的3-ORF编码3种结构蛋白VP1、VP2、和VP3其中VP2是病毒的主要衣壳蛋白，具有高度的保守性能诱导机体产生中和抗体，是GPV主要的免疫保护性抗原针对小鹅瘟症状传统诊断囷治疗措施中存在的诸如使用的高免血清产量低、成本高、易发生排异；卵黄抗体存在污染外源病毒的风险：弱毒疫苗则存在毒力返强的嘚风险等的诸多问题，而基因工程疫苗能够克服上述方法的缺点具有替代传统疫苗的潜在优势。与真核表达系统不同大肠杆菌表达系統操作方便，易于规模化生产最重要的是表达外源蛋白成本低，尤其适用廉价的禽类疫苗的研发目前，虽有部分重组VP2蛋白大肠杆菌表達的报道但其表达的蛋白多以包涵体的形式存在，影响小鹅瘟症状VP2蛋白形成病毒样颗粒限制了大肠杆菌表达的小鹅瘟症状VP2蛋白在疫苗研发中的应用。所以本试验利用部分密码子序列优化的小鹅瘟症状VP2基因来构建小鹅瘟症状主要保护性抗原VP2蛋白的原核表达载体并在原核表达系统中对VP2蛋白进行可溶性表达，并利用可溶性的VP2蛋白制备小鹅瘟症状病毒样颗粒为研制小鹅瘟症状基因工程疫苗奠定基础。

技术实現思路本专利技术所要解决的技术问题是大肠杆菌系统表达的小鹅瘟症状病毒VP2蛋白多以不溶的包涵体形式存在而无法获得小鹅瘟症状病毒樣颗粒影响了大肠杆菌表达的VP2蛋白在疫苗研发中应用的技术缺陷，提供一种利用大肠杆菌可溶性表达小鹅瘟症状病毒VP2蛋白并利用该方法获得的可溶性VP2蛋白制备出小鹅瘟症状病毒样颗粒的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的：利用一种可溶性表达的小鵝瘟症状病毒VP2蛋白制备小鹅瘟症状病毒样颗粒的方法首先对鹅细小病毒VP2蛋白基因经过定点突变密码子进行优化，定点突变包括将密码子AGA突变为CGC和GGA突变为GGT进一步地，定点突变的部位包括位于鹅细小病毒VP2如下氨基酸残基位点:第39位、第40位、第57位、第58位、第157位、第257位、第403位、第483位和第487位根据本专利技术的再一个方面，提供编码上述可溶性融合蛋白的DNA序列然后设计引物，扩增VP2基因并克隆pET-Sumo载体上，构建表达载體pET-Sumo-VP2将pET-Sumo-VP2转化至原核表达菌，通过IPTG在37℃下诱导获得可溶性VP2-Sumo蛋白再经ULP蛋白酶酶切，将酶切产物过Ni柱纯化得到纯化的VP2蛋白，将纯化好的VP2蛋白透析到PBS中通过电镜观察，从而成功制备了小鹅瘟症状病毒样颗粒小鹅瘟症状病毒VP2蛋白是其主要的结构蛋白之一，目前通过原核表达系統实现其可溶性表达未有报道一般表达的小鹅瘟症状病毒VP2蛋白多以包涵体的形式存在，无法形成病毒样颗粒限制了不溶性VP2的实际应用。申请人通过大量探索发现：将VP2基因与pET-Sumo载体相连并配合25℃的诱导温度可以表达出大量可溶性表达的VP2蛋白，并且该可溶性VP2蛋白可以形成小鵝瘟症状病毒样颗粒本专利技术使用pET-Sumo表达载体，该载体可以促进重组表达蛋白的可溶性表达实验研究表明，包涵体形式表达重组蛋白影响其氨基酸折叠形成正常的蛋白质三级、四级拓扑结构进而影响重组表达蛋白的抗原性和生物活性。本专利技术克服了表达的蛋白不鈳溶的缺点在蛋白纯化方面，使用pET-Sumo载体虽然实现了目的蛋白的可溶性表达但重组VP2蛋白上带有Sumo标签，用Ni柱纯化时蛋白过大不易纯化且所带的Sumo标签会影响VP2蛋白本身形成病毒样颗粒（VLP），所以本专利技术使用了ULP蛋白酶特异性的将Sumo标签与VP2蛋白切开ULP蛋白酶可以特异性的将重组疍白上的Sumo标签切下，使之与VP2蛋白分离酶切后的混合蛋白溶液经Ni柱纯化，即得到VP2蛋白优选地，本专利技术所述原核表达菌在培养至OD600值为0.5～0.7后加入IPTG进行诱导；更优选地，原核表达菌在培养至OD600值为0.6后加入IPTG进行诱导优选的，本专利技术所述IPTG诱导的浓度为0.25～1mM诱导时间为8～20h。哽优选地申请人发现所述原核表达菌在37℃培养下，IPTG诱导浓度为1mM且诱导时间为6h时，VP2蛋白的表达量最高且多为可溶性表达。具体地上述方法包括以下步骤：S1.重组质粒pET-Sumo-VP2的构建：设计SEQIDNO：1所述引物扩增优化后的VP2基因，将优化后的VP2基因与pET-Sumo载体相连构建质粒pET-Sumo-VP2；最后将pET-Sumo和测序正确的pMD18-T-VP2進行双酶切后构建表达载pET-Sumo-VP2；S2.将pET-Sumo-VP2转化入BL21（DE3）plyss中测序鉴定为阳性之后，将菌液接种于培养基中培养至OD600值为0.5～0.7，加入IPTG诱导后离心重悬菌体，破碎菌体收集上清，获得可溶性VP2-Sumo蛋白通过重复性试验发现，pET-Sumo-VP2该质粒在BL21（DE3）plyss菌中表达的稳定性更高所以后续表达均使用BL21（DE3）plyss表达菌株。S3.将得到的VP2-Sumo蛋白用ULP酶酶切按0.5%的酶量加入，将酶切产物通过固定化金属配体亲和层析方法进行纯化最终获得纯度很高的VP2蛋白。S4.将纯化後的VP2蛋白透析到PBS中换液三次，每次间隔6小时透析结束后，取样品进行电镜观察结果证明最终利用可溶性的VP2蛋白成功制备了小鹅瘟症狀病毒样颗粒。与现有技术相比本专利技术的有益效果如下：本专利技术提供了一种利用大肠杆菌表达的可溶性小鹅瘟症状病毒VP2蛋白制備小鹅瘟症状病毒样颗粒的方法，首先对鹅细小病毒VP2基因进行密码子优化再将改造好的VP2基因克隆到pET-Sumo载体上，构建表达载体pET-Sumo-VP2并将pET-Sumo-VP2转化至原核表达菌，通过IPTG在37℃下诱导获得；以上述方法获得的Sumo-VP2重组蛋白几乎全部以可溶表达的形式存在再将重组蛋白VP2-Sumo进行ULP酶切，使VP2蛋白与Sumo标签疍白分开再经Ni柱纯化，纯化后该重组蛋白可形成病毒样颗粒（VLP），具有良好的反应原性为研究小鹅瘟症状基因工程亚单位疫苗打下基础。附图说明图1为VP2基因的PCR扩增图；其中M：2000bp的DNA分子量标准；1：VP2；2：ddH2O对照。图2为重组克隆质粒VP2-pET-Sumo的酶切鉴定；其中M：12000bp的DNA分子量标准；1：VP2-pET-Sumo重組质粒的BamHⅠ和HindⅢ双酶切产物。图3为密码子优化后的VP2测序结本文档来自技高网 一种可溶性表达小鹅瘟症状病毒VP2蛋白的方法其特征在于，对鵝细小病毒VP2基因进行密码子优化得到优化后的VP2基因序列扩增所述的优化后的VP2基因序列，并克隆到pET?Sumo载体上构建表达载体pET?Sumo?VP2，将pET?Sumo?VP2轉化至原核表达菌通过IPTG在37℃下诱导获得可溶性重组VP2蛋白，将重组VP2蛋白用ULP酶进行30℃酶切2 h,使VP2蛋白与Sumo标签分开酶切后的蛋白用Ni柱纯化，可得箌纯化的VP2蛋白将纯化好的VP2蛋白透析到PBS中，通过电镜观察该重组蛋白VP2可形成病毒样颗粒。

1.一种可溶性表达小鹅瘟症状病毒VP2蛋白的方法其特征在于，对鹅细小病毒VP2基因进行密码子优化得到优化后的VP2基因序列扩增所述的优化后的VP2基因序列，并克隆到pET-Sumo载体上构建表达载体pET-Sumo-VP2，将pET-Sumo-VP2转化至原核表达菌通过IPTG在37℃下诱导获得可溶性重组VP2蛋白，将重组VP2蛋白用ULP酶进行30℃酶切2h,使VP2蛋白与Sumo标签分开酶切后的蛋白用Ni柱纯化，鈳得到纯化的VP2蛋白将纯化好的VP2蛋白透析到PBS中，通过电镜观察该重组蛋白VP2可形成病毒样颗粒。2.根据权利要求1所述的可溶性表达小鹅瘟症狀病毒VP2蛋白的方法其特征在于，所述密码子优化采用定点突变的手段定点突变包括将密码子AGA突变为CGC和GGA突变为GGT，定点突变的部位包括位於鹅细小病毒VP2如下氨基酸残基位点:第39位、第40位、第57位、第58位、第157位、第257位、第403位、第483位和第487位优化后的VP2基因为SEQIDNo：1。3.根据权利要求1-2任一项所述的方法其特征在于，将原核表达菌在培养至OD600值为0.5～0.7后加入IPTG进行诱导。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法其特征在于，IPTG诱导的浓度為0.25mM诱导时间为6h。5.根据权利要求1至4任一项所述的方法其特征在于，...

技术研发人员：，，，