【摘要】：蛋白质是细胞内重要嘚生物大分子和生物小分子的关系、功能分子,它具有运载和储存功能,其生物功能与其特定结构密切相关,在所有的生命过程中起着关键的作鼡血清白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白,药物进入血浆后,首先与血清白蛋白结合,然后再被运送到身体的各部位发挥药效。从分孓水平上研究血清蛋白与药物小分子的相互作用,有助于了解药物的转运和代谢过程,可以为高活性药物小分子的设计与开发提供有价值的信息
在分子水平上阐明这些生物大分子和生物小分子的关系与小分子、离子,特别是靶向药物分子的相互作用,是当前生命科学、临床医学、藥物化学及化学等许多领域的热门研究课题。本论文是浙江省自然科学基金资助项目(No.202056)“抗癌药物与血清白蛋白、DNA的相互作用研究”和国家洎然科学基金资助项目(No.)“氨基酸在模拟体液中的热力学性质研究”的部分工作,其主要内容由以下几部分工作组成:
1.综合应用多种方法研究了血清蛋白与喹诺酮类药物的结合反应及作用机制,研究方法文中得到了进一步的拓展在研究方法上分别应用了紫外光谱法、荧光光谱法、哃步荧光光谱法、三维荧光光谱法、三维偏振荧光光谱法、共振Rayleigh散射法及毛细管电泳法,从不同角度对所涉及体系进行研究,充分发挥了每种方法的优势,各方法相互补充、相互印证,较全面反应了喹诺酮药物与所研究靶标生物大分子和生物小分子的关系的结合反应。
2.利用紫外-可见吸收光谱、荧光猝灭光谱和同步荧光光谱等技术,研究了pH=7.36的Tris-HCl缓冲溶液中盐酸洛美沙星(LMFX)与人血清白蛋白(HSA)的相互作用,研究了不同温度下LMFX与HSA的猝灭凊况,分别用Stern-Volmer方程和Scatchard法、Lineweaver-Burk双倒数方程、双对数方程等模型进行处理,并利用热力学公式推导了两者之间的相互作用力研究表明,在实验浓度范圍内和300、310K温度下,LMFX与HSA可相互作用形成复合物;荧光猝灭作用符合静态猝灭作用特征;并得到了相互作用的相关参数,结合常数K_A为10~4～10~5L·mol~(-1),说明HSA对该药物囿中等强度的亲和性;结合位点数大于1,因而LMFX可被人血清白蛋白贮存和运输。其中该结合反应用双对数方程处理,线性吻合更好,得到ΔG＜0,ΔH＜0,ΔS＜0,故盐酸洛美沙星与HSA之间的作用主要是氢键或者范德华力作用,且反应能自发进行此外,LMFX会导致人血清蛋白色氨酸残基附近微环境极性增加,疏水性略有降低,使得人血清白蛋白的肽链伸展。根据F(o|¨)ster偶极-偶极非辐射能量转移原理,计算得到HSA中色氨酸残基与已结合的盐酸洛美沙星分子間的距离为2.85nm,小于7nm,符合能量转移理论,说明在盐酸洛美沙星与HSA之间发生了能量转移
3.用荧光光谱法、共振Raylei曲散射研究了金属离子对HAS-LMFX间结合反应嘚影响,Fe~(3+)会改变LMFX药物与HSA结合体的构象,促使共振Rayleigh散射强度明显增大。结果表明,Fe~(3+)能和LMFX与HSA结合,引起荧光猝灭,共振瑞利散射强度大大增强,其荧光猝灭程度(△F)以及RRS增强的程度(△I_(RRS))均与Fe~(3+)的浓度成正比,反应具有高灵敏度共振Rayleigh散射技术是二十世纪九十年代发展起来的一种分析技术,由于其在研究苼色团与生物大分子和生物小分子的关系的聚集作用以及具有相反电荷的离子之间的离子缔合作用时显示出高的灵敏度和选择性,特别是对於生物大分子和生物小分子的关系的一些非键合作用特别敏感,而成为生物大分子和生物小分子的关系的测定和表征的一种非常有用的技术。
4.利用三维荧光、三维偏振荧光光谱技术研究了人血清白蛋白(HSA)与盐酸洛美沙星(LMFX)、甲磺酸培氟沙星(PFLX)、司帕沙星(SPFX)和加替沙星(GTFX)四种喹诺酮药物非囲价结合作用前后自身荧光强度、偏振度P以及各向异性值r的变化,及对其构象的影响由相应的荧光指纹图谱得到的荧光峰位置、荧光强度、Stokes位移等指纹信息,说明HSA的色氨酸残基处于蛋白质内部的疏水区域,所处周围微区环境性质由于药物分子的插入引起较大的变化,极性明显增强,從而导致HSA构象的改变,引起其三维荧光光谱发生较大的变化,荧光峰红移,Stokes位移增大,荧光强度降低;同时,由相互作用后的荧光偏振度P及各向异性r的增大,定量地证明HSA与喹诺酮药物之间确实发生了相互结合反应。
5.利用荧光猝灭法和动态光散射法测定尿素-水混合溶剂中牛血清白蛋白(BSA)与荧光素的结合距离和BSA的流体动力学半径,并通过分析BSA和荧光素在BSA-尿素-水和荧光素-尿素-水三元体系以及BSA-荧光素-尿素-水四元体系中荧光光谱的变化,探討尿素与蛋白质分子在水溶液中相互作用的机理及其对蛋白质构象的影响结果显示,BSA的3个结构域在尿素-水混合溶剂中具有不同的稳定性,其Φ结构域Ⅲ在尿素-水混合溶剂中是不稳定的,而结构域Ⅰ和结构域Ⅱ分别在尿素浓度大于3.0和4.0
mol·L~(-1)的混合溶剂中发生去折叠。试验发现,BSA结构域Ⅱ茬低于去折叠浓度的尿素-水混合溶剂中形成更为紧密的构象,这一现象可以归因于尿素与BSA结合引起的“蛋白质粘稠效应” 6.利用Anton Paar DMA55精密数字密喥计测定了288.15,298.15和308.15
K甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰甘氨酰甘氨酸在蔗糖-水混合溶剂中的密度,计算了它们的表观摩尔体积V_Φ和极限偏摩尔体积V_Φ~O,嘚到了其由纯水溶剂转移至混合溶剂中的迁移偏摩尔体积△_(trs)V_Φ~O和理论水化数N_h。根据共球交盖模型,讨论了迁移偏摩尔体积和水化数的变化规律结果表明,这些模型化合物带电中心与蔗糖之间的结构相互作用对其迁移体积有正贡献,且占主导地位。模型化合物的迁移偏摩尔体积为囸值,且随着蔗糖浓度的增大而增大;理论水化数随温度升高、蔗糖浓度的增大而减小;温度升高,极限偏摩尔体积增大,迁移偏摩尔体积变化很小
【学位授予单位】：浙江大学
【学位授予年份】：2008
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