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反硝化细菌的筛选及应用研究
　　摘　要：从天津市等地的菜园土中筛选出6株具有较强反硝化能力的菌株，可使柠檬酸盐培养基中硝酸盐浓度降低30％～80％，其中以F1401效果最好。对F1401在农田灌溉水中的硝酸盐降解能力进行测定，结果表明，在静置条件下，随着YB培养基培养的F1401菌液投入量的增加，硝酸盐降解效果越明显，并且对于硝酸根浓度为150mg／kg的农田灌溉水，2mL菌液是最佳投入量。 中国论文网 /8/view-9064210.htm　　关键词：反硝化细菌；筛选；应用；农田灌溉水；硝酸盐污染 　　中图分类号：8273.5　文献标识码：A　文章编号：(43―02 　　 　　近年来，反硝化细菌的研究成为污水处理的热点，它作为污水脱氮的一种生物方式，对于控制水体富营养化、处理污水等环境问题有很广阔的应用前景。天津市西青区、北辰区、蓟县、宝坻县、静海县部分地区农田灌溉水硝酸盐含量偏高。降低水体及土壤中硝酸盐浓度对于提高水质和蔬菜品质，增强人体健康都具有非常重要的意义。反硝化细菌的筛选方法有很多，如李平等用琥珀酸钠、重金属等微量元素作为筛选培养基，用合成的人工废水来测定菌株的反硝化能力；孔庆鑫等采用间歇曝气法富集，以KCN作为选择培养基，筛选到一株高效好氧反硝化细菌等。因此，我们试图选择一种试验安全的筛选方法并将其应用于硝酸盐污染的农田灌溉水，为深入研究在硝酸盐污染的水体及土壤中进行生物脱氮提供理论及技术依据。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1.1　材料 　　本试验的土壤样品采白天津、沈阳、哈尔滨等地菜园。 　　初筛培养基1：柠檬酸钠5.0g，KN03 2.0g，KH2PO41.0g，MgSO4+7H20.2g，蒸馏水1L，pH7.2。复筛培养基2：Gihay培养基。　YB培养基3：黄豆芽200g，葡萄糖20g，蒸馏水1L，pH 7.2。 　　 　　1.2　方法 　　1.2.1　分离方法将分散后的土壤样品梯度稀释涂布于初筛培养基上，并将初筛到的菌株进一步分离、纯化。将纯化后的菌株按张玉芹方法接于装有10mL复筛培养基的试管中，28℃培养，7d内观察试管内培养基的颜色及产气特性。将能够使培养基变蓝且能够产气的菌株转移至柠檬酸盐反硝化培养基斜面保存备用。 　　1.2.2　菌株反硝化能力的测定调节柠檬酸盐培养基中NOa-浓度，使其达到150mg／kg，之后分装于250mL三角瓶中，每瓶100mL，120℃灭菌30min。接1环反硝化细菌于三角瓶中，28℃、150r／min连续培养1-4d，定时检测培养基硝酸盐的浓度变化，同时做空白对照。 　　1.2.3　菌株对农田灌溉水中硝酸盐降解能力的测定将采集到的农田灌溉水的NOs-浓度进行调整，使其达到150mg／kg，分装于250mL三角瓶中，每瓶100mL，将2种培养基(初筛培养基1、YB培养基2)培养24 h的菌液1mL分别加入到三角瓶中，同时做3个平行，以不加菌液为对照，设置室温放置、28℃振荡培养两种培养方式培养1～7d，定时检测水中NOs-浓度变化。 　　 　　2　结果与分析 　　 　　2.1　菌株的筛选 　　本试验初筛到55株反硝化细菌，其中有26株能够在7d内使Gihay培养基变蓝且产生较多气泡，说明这些菌株具有较强的反硝化能力。测定这些菌株对柠檬酸盐培养基中硝酸根的降解能力，4d内有6株菌株使硝酸盐降解幅度达到30％-80％左右，尤其编号为F1401的细菌效果最好，2d使硝酸盐浓度降低77.4％，第4天可达到80.84％(表1)。因此，我们将F1401作为目标菌株。 　　 　　2.2　F1401降解能力的测定 　　我们比较了2种发酵液在静置与振荡两种情况下对水中硝酸盐的降解能力。研究表明：虽然菌株F1401对柠檬酸盐培养基中硝酸盐浓度的降解率能达到77％-80％，但加入1mL其培养液对农由灌溉水中硝酸盐几乎没有什么作用，在静置状态下硝酸盐甚至有增加的趋势(表2)。而YB培养液的情况却不同，硝酸盐均有所下降，其中在静置的情况下硝酸盐降解效果最为明显，1d可降解21，09％，此后几天变幅不大。说明YB培养基更适合F1401生长，在静置条件下更有利于硝酸盐的降解。 　　因此，我们考虑静置条件下在YB培养液中加入不同菌液量对农田灌溉水中硝酸盐的降解效果。结果表明，随着加入量的增加，降解效果越显著，当加入量为4mL时，放置1d就能降解84.27％，加入量为3.4 mL时，2d之后灌溉水中均检测不到硝酸盐(表3)。但考虑到如果在实际应用中加入量过高反而对水质有影响，而相对于1mL和1。5mL的降幅比例及降解效果，2mL的降幅及降解效果较高，因此，在100mL农田灌溉水中加入2mL菌液为最佳投入量。 　　 　　3　结论 　　 　　本试验筛选到一株编号为F1401的高效反硝化细菌，其对柠檬酸盐培养基中硝酸盐的降解率可达80.，84％，在静置条件下对硝酸根浓度为150mg／kg的农田灌溉水能够起到很好的降解效果。但对菌株生长条件、需氧条件等方面的鉴定以及实际应用还有待进一步深入探讨。 　　 　　参考文献： 　　[1]李平，张山，郑永良，等，反硝化真菌――细菌优化组合及其脱氮能力研究[J]，环境科学与技术，)：9―10，45. 　　[2]孔庆鑫，李君文，王新为，等，一株新的好氧反硝化菌筛选方法的建立及新菌株的发现[J]，应用与环境生物学报，)：222―225. 　　[3]土壤微生物研究会，土壤微生物实验方法[M]，北京：科学出版社，. 　　[4]张玉芹，刘开启，王革，等，反硝化细菌的筛选及培养条件的研究[J]，农业环境科学学报，)：165―168.
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反硝化微生物生物学特性及其固定化细胞对硝态氮去除的研究
【摘要】：本文的研究分为两个方面：(1) 纯培养反硝化微生物的生物学特性，包括环境条件对反硝化的影响和在模拟自然环境的恒化器中生长情况；(2) 包埋反硝化微生物在处理高含量NO_3~-地下水中的应用。以本实验室从富营养化底泥中分离到的反硝化微生物作为代表菌株，试图全面了解环境条件对反硝化作用的影响，为反硝化微生物在实际应用中处理硝态氮污染水做了一些基础工作。
在批式培养条件下进行正交试验，得出在Giltay培养基中环境条件对反硝化能力的影响，菌株HP1(Pseudomonas alcaligenes)为：Cu~(2+)＞温度＞碳源＞C／N＞pH；菌株H-Su-1(Paracoccus denitrificans)：C／N＞温度＞pH＞碳源＞Cu~(2+)，试验结果说明不同反硝化微生物有自身的独特性。以菌株HP1为研究对象，对各因素的影响机理作了初步研究，得出如下结论：碳源的种类对硝酸还原酶没有明显的影响，对氧化亚氮还原酶活性有影响，不同碳源都有NH_4~+的积累。pH值对反硝化过程有很大的影响，pH6.0时N_2O和NO_2~-的积累比pH7.5时晚，随后的变化趋势也不一致。在所设定值范围内，HP1的最适C／N为8，H-Su-1的最适C／N为10，经过试验证实HP1和H-Su-1都可利用硝酸盐作为氮源进行反硝化作用，证实这两种菌至少可能有两套硝酸还原途径。连续培养时HP1在不同C／N下，都有大量的NH_4~+积累，在C／N为3时还有NO_2~-的积累。Cu~(2+)浓度对亚硝酸和N_2O的还原都有影响，当Cu~(2+)为5mg／L时只有少量的NO_2~-积累，且到24小时后再次降为0。以NO_2~-为电子受体时发现对HP1最适的Cu~(2+)浓度为5mg／L，当超过这个值时反而对酶有抑制作用。菌株HP1对NO_2~-有较高的耐受浓度，36mM时也可进行反硝化作用，当添加到100mM时对反硝化作用有明显的抑制作用。氧气对反硝化微生物反硝化能力的影响主要是在酶表达的水平。分别以加乙炔时N_2O的浓度和不加乙炔时CO_2浓度为指标，测定出菌株HP1进行反硝化的活化能小于厌氧呼吸的活化能，所以当温度改变时，厌氧呼吸产物CO_2释放速率的改变大于反硝化产物N_2或N_2O释放速率的改变。
连续培养是研究水域微生物的基础。测定了HP1分别在碳源、NO_3~-限制时的动力学方程：当NO_3~-限制时，在25℃时的恒化器动力学方程为μ=0.197×S／(0.054+S)；在15℃时为μ=0.136×S／(0.047+S)。当碳源限制时，在25℃时恒化器动力学方程为μ=0.112×S／(1.839+S)；在15℃时为μ=0.102×S／(1.885+S)。为确定不同硝酸盐呼吸细菌对NO_3~-的竞争能力，测定了不同菌对NO_3~-的表观米氏常数Km，添加100μg／mL的氯霉素作为酶合成抑制剂，菌株HP1在25℃和15℃时的米氏常数Km分别为3.03mM、8.95mM。H-Su-1在25℃时的米氏常数为10.46mM，N03-1(Vibrio spp．)在15℃时的米氏常数为5.75mM。在碳源限制条件下进行竞争培养，在稀释速率为0.042h~(-1)和0.096h~(-1)时，HP1的生长都超过了N03-1，且整个过程都有NO_2~-和NH_4~+的产生。在碳源限制条件下，HP1和H-Su-1分别在25℃和15℃在恒化器竞争生长，整个试验过程
HPI的生物量都比H一Su一1高。两组竞争生长试验的结果都与在N氏一下的结果不一样，
说明微生物在环境中是否为优势菌与环境条件有密切关系。
对菌株HPI进行包埋处理，证实包埋后的微生物对02、pH值等环境条件有更强
的杭逆性，表现出比未经包埋的反硝化微生物高的反稍化活性，说明所选择的包埋方
法适合对菌株HPI的包埋。采用延时包埋方法包埋HPI连续处理模拟废水，添加甲醇
为碳源，对NO3一的去除率为80%。
关健词:反稍化微生物;反硝化作用;恒化器;固定化
【学位授予单位】：南京农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2004【分类号】：Q939.9
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