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[fú sù liào]
氟塑料是部分或全部氢被氟的链烷烃聚合物，它们有聚四氟乙烯（）、全氟（乙烯丙烯）（）共聚物、聚全氟烷氧基（）树脂、（PCTFE）、乙烯一三氟氯乙烯共聚物（）、乙烯一四氟乙烯（）共聚物、（）和（）。
氟塑料聚四氟乙烯
商品名“”、“”、“特富隆”、“泰氟龙” 、&4F&等,PTFE是由四氟乙烯自由基聚合而制得的一种全氟聚合物，它具有一CF2=CF2一重复单元线性分子结构，是结晶性聚合物，熔点大约为631℉， 密度为2．13—2．19g/CC（克/立方厘米）。 PTFE具有优异的耐化学品性，其介电常数为2．1，损耗因数低，在很宽的温度和频率范围内是稳定的。它从低温到550V的机械性能都很好。
PTFE抗冲强度高，但拉伸强度、耐磨性、抗蠕变性比其它工程塑料差。有时加入玻璃纤维、青铜、碳和石墨来改善其特殊的机械性能。它的几乎比任何其它材料都低，具有很高的氧指数。
PTFE可制成粒料、凝结的细粉（0．2微米）和水分散液。粒状树脂用于压塑和柱塞挤塑；细粉可以糊状挤塑成薄壁材料；分散液可用作涂料和浸渍多孔材料。在美国市场经销的纯的PTEE产品有 Auimont USA公司的 AI－goflo牌、DU POut公司的Teflon牌、ICI AInericas Inc的 FI牌、HOechstCelanese公司的HOSaflon牌。
PTFE具有非常高的熔体粘度，这妨碍了惯用的熔融挤塑或模塑技术的采用。粒状PTFE的模塑和挤塑方法与粉状金属和陶瓷用的方法相似——先压缩再高温烧结；细粉需与加工辅料混合（如石脑油）形成糊状，然后在高压下挤成薄壁材料，再加热除掉挥发性的加工助剂，最后烧结。
氟塑料聚全氟乙丙烯
FEP是四和六氟丙烯共聚而成的。
FEP结晶熔化点为580 ℉ ，密度为2.15g/CC（克/立方厘米），它是一种软性塑料，其拉伸强度、耐磨性、抗蠕变性低于许多工程塑料。它是化学惰性的，在很宽的温度和频率范围内具有较低的介电常数（2.1）。该材料不引燃，可阻止火焰的扩散。它具有优良的耐候性，摩擦系数较低，从低温到392 ℉ 均可使用。该材料可制成用于挤塑和模塑的粒状产品，用作流化床和静电涂饰的粉末，也可制成水分散液。半成品有膜、板。棒和单纤维。美国市场经销的FEP有DUIPont公司的 Teflon牌、Daikin公司的Neoflo牌、Hoechst Celanese公司的IHoustaflow牌。其主要的用途是用于制作管和化学设备的内村、滚筒的面层及各种电线和电缆，如飞机挂钩线、增压电缆、报警电缆、扁形电缆和油井测井电缆。FEP膜已见用作太阳能收集器的薄涂层。
氟塑料可熔性聚四氟乙烯
PFA是聚四氟乙烯改性 温度可以达到260摄氏度,全氟烷氧基树脂
PFA树脂相对来说是比较新的可熔融加工的氟塑料。
PFA的熔点大约为580 ℉ ，密度为2.13— 2.16g/cc（克/立方厘米）。PFA与 PTFE和FEP相似，但在302℃以上时，机械性能略优于FEP，且可在高达500 ℉ 下的温度下使用，它的耐化学品性与PTEF相当。PFA的产品形式有用于模塑和挤塑的粒状产品，用于旋转模塑和涂料的粉状产品；其半成品有膜、板、棒和管材。美国市场经销的PFA树脂有DUPOut公司的Teflon牌、Daikin公司的Neoflon牌、Ansimont公司的Hthen牌、HOechst Celanese公司的 Hostafl牌。PFA的用途与FEP类似。
氟塑料聚三氟氯乙烯
PCTFE是三氟氯乙烯自由基引发聚合的带有主要是重复一CF(cl)—CF单元线性主链的产物。
PCTFE是结晶性的高分子，熔点为425 ℉ ，密度为2.13g/cc（克/立方厘米）。
PCTFE在室温下对大多数活泼的化学品呈惰性，而在212T以上可被少数几种溶剂溶解，也可被一些溶剂溶胀，尤其是氯化过的溶剂。PCTFE具有优异的阻隔气体的能力，其膜产品的水蒸汽透过性在所有透明塑料膜中是最低的。其电性能与其它全氟聚合物相似，但介电常数（2．3—2．刀和损耗因数稍高，尤其是在高频时。PCTFE可制作厚的（1/8英寸）光学透明制件。
PCTFE虽可用熔融加工，但由于熔体粘度高，有降解趋势导致加工品的性能变坏，故加工困难。
PCTFE树脂可制成用于模塑和挤塑的粒料。膜厚度为 0.001—0.010英寸，亦可制成棒和管。美国市场上经销的PCTFE树脂有3M公司的Kel—FI牌、Daikin公司的Daiflon牌、AlliedlSignal公司的Acfon牌。
氟塑料乙烯三氟氯乙烯共聚物
ECTFE树脂是乙烯和三氟氯乙烯1:1的交替共聚物，熔点为464 ℉ ,密度为1.68g/cc（克/立方厘米）。
此材料从低温到 330T的性能良好，其强度、耐磨性、抗蠕变性大大高于PTEE、FEP和PFA。它在室温和高温下耐大多数腐蚀性化学品和有机溶剂。它的介电常数（2.6）低，在很宽的温度和频率范围内性能稳定。ECTFE不着火，可防止火焰扩散，当暴露在火焰中时，将分解成硬质的碳。
ECTFE可制成用于模塑和挤塑的粒料及用于旋转模塑、流化床涂饰、静电涂饰的粉状产品。可在传统挤塑设备用化学发泡法加工成泡沫状产品，待别适用于计算机用电线的领域。半成品有膜、板、管和单纤维。 Ausimont USA公司销售的ECTFE产品牌号为Halar。
在电线和电缆领域，最重要的应用是用于增压电缆、公共交通车用电缆。火警电缆、阳极保护电缆。注塑产品有塔填料、问和泵零件、接插件、电线接线柱、过滤机壳。ECTFE管的应用有光导纤维的套管、非支撑管、钢管和增强塑料管的内衬。
ECTFE涂料和内村可防止金属被环境侵蚀。膜的应用有理电池和隔离方面的应用。单纤维的应用有消油雾器、编织套管、过滤织物。宽幅（48in）以玻璃纤维作背村的ECTFE片材，可用作耐化学品和强度要求高的槽罐的内衬。
氟塑料乙烯—四氟乙烯共聚物
ETFE是乙烯和四氟乙烯1:1交替共聚物。ETFE熔点为518F，密度为1.70g/CC。 ETFE是一种从低温到356F具有高抗冲性和机械性能好的坚韧的材料。耐化学品性能、电性能和耐候性与 ECTFE相似，与全氟聚合物相近。该聚合物暴露在火焰中会熔化和分解。 ETFE可制成用于挤塑和模塑的粒料，及用于旋转模塑、流化床和静电涂饰的粉末。半成品有膜、棒、管和单纤维。美国市场销售的ETFE有Du Poutl公司的Tefzel牌、Ansimont USA公司的Hyflon牌、Daikin公司的Neoflon牌。在电线和电缆的应用有飞机用挂钓线、公共交通车和计算机上的背板。注塑产品有泵、间和其它化工设备的部件，包装物，塔填料，电器零件。
氟塑料聚偏氟乙烯
PVDF是高分子量的聚合物，它属于结晶性材料，熔点为338F，密度为 1.78g/CC。其强度、耐磨性和抗蠕变性比 PTFE、FEP和 PFA高得多；耐大多数化学品和溶剂，以及氧化剂如液体溴和溴盐溶液；具有良好的耐候性,在空气中不燃烧；与其它氟塑料相比具有很高的介电常数（8—9）和损耗因 数；在 148～302F温度范围具有的性能良好。 PVDF可制成粉状、粒料和分散体系（和中含44%的树脂）。它可用挤塑、注射模塑、传递模塑，也可通过干粉或分散体喷涂技术用作涂料，半成品有膜、板、棒和单纤维。美国市场销售的PVDE有 AtOChem Inc的 Kpor牌、Sovay公司的 Soef牌， Daikin公司的Neoflon牌及 Ansimont公司的 Hylar牌。
氟塑料聚氟乙烯
PVF是高结晶性材料，只能制成膜状，它很坚韧而富于弹性，具有杰出的耐候性，在-94—230F温度范围内性能良好，它具有良好耐磨和耐沾污性，可与胶合板、乙烯基塑料和增强的聚酯及金属箔层合。
氟塑料加工技术
氟塑料氟塑料模压成型
氟塑料模压成型可加工板、棒、套筒、胶带、密封环、隔膜及带有金属嵌件的零件等。
模压成型分预成型、烧结和冷却三个步骤。预成型是将PTFE粉末均匀加入模具内，在常温下加压成密实的预成型品(即毛坯);烧结是将预成型品加热到熔点以上，冷却是从烧结温度降到室温的过程。
有些氟塑料是在熔点温度以上一次加压而成，这种成型模具，叫做热压模，与此对应的PTFE的模具叫冷压模。
模压时应注意压缩比(一殷PTFE为4-6)和成型收缩率(一般PTFE为2.6-4.5%)对制品的影响。
原料最好用悬浮法聚合树脂，粒径为20-500微米的松软细粉末最好。压制过程中必须“放气”，预成型压力为17-35兆帕，保压时间根据毛坯厚度而定，如100毫米厚的毛坯，应保压15分钟。
烧结时应注意：升温速度可采用20-120℃/小时，制品越大，升温速度越慢，悬浮法树脂烧结温度高些，为370-380℃，而分散法树脂烧结温度低些，360-370℃，烧结温度高，收缩率和气孔率随之增大，烧结时间应适当控制。
冷却，一般情况用慢速降温，速度为15-25℃/小时，在特殊情况时，如少数厚度小于5毫米的薄板或推压成型的薄壁管时，才用快速冷却。
有时制品在100-120℃温度下，作4-6小时的退火处理。
氟塑料氟塑料滚压成型
PTFE膜片是滚压成型的，滚压成型可分为单向滚压和多向滚压两种工艺，经过滚压处理，PTFE膜片由原来的不透明自色，变成半透明水晶色。
单向滚压是将重新加热到透明状的膜片，迅速地通过压延机的两个相同旋转着的辊进行加工的。压延倍率控制在1.5-2.5范围内，一般辊筒转速20转/分。
多向滚压是将经过烧结淬火处理的膜片，放在压延机上，进行多方向的压延，逐渐减小膜厚的成型加工方法。其中压延比为2-2.5范围。滚筒的温度应控制在150-200℃，蒸汽加热时，蒸气压力在0.5-0.9兆帕。压延比是一个重要参效， 过大和过小对制品均不好。有时要反复进行多次滚压，才能压好一个产品。
氟塑料氟塑料注射成型
PFA(四氟乙烯和全氟烷基乙烯基醚的共聚物)，即可熔性PTFE，可以注射成型。其加工温度较宽，最高可达425℃，其分解温度在450℃以上，一般控制加工温度范围为330-410℃。
PFA的吸湿性很小，为0.03%，所以不用干燥，注射前，嵌件应预热到140℃左右，注射料筒三段温度为：200-210、300-310、350-410℃，,喷嘴温度略低于料筒最高温度，模具温度为140-230℃，注射压力40-90兆帕，注射速度应稍慢一些，保压时间不宜太长。冷却时间为40-150秒。
氟塑料氟塑料二次加工技术
由子氟塑料的加工特性，使一些制品难于一次成型，还必须经过二次加工才能得到可使用的成品。二次加工技术有：切削、焊接、内衬、吹胀等。
切削：类似于金属的切削方法，设备有车床、钻床、刨床等。注意在切削之前，必须将毛坯体放置24小时后才可进行。
焊接：分热压焊接和热风焊条焊接两种。热压焊接，要在特制的钳具中，加热到327℃以上，同时加压才能焊接住。
热风焊条焊接是采用PFA捍条，加热加压通过PFA而将两件连接在一起。
内衬：一般用聚四氟乙烯和聚全氟乙丙烯(有写成F4和F46)塑料内衬黑色金属管及管配件，可用于化工防腐耐蚀材料。
吹胀：制品为波纹管和热收缩管、热收缩膜等。又分为连续式吹胀和间歇式吹胀。
如F46热收缩管的管坯采用水冷却真空定型方法制备，管材拉伸比为3-7，熔融锥体长度控制在10-20毫米，吹胀模温度80-160℃，吹胀压力0.1-0.2兆帕，牵引线速度80-500毫米/分。其他还有吹胀F4螺旋管。
如PTFE机床导轨软带：用悬浮法PTFE细粒料，捣碎后，过20目筛，青铜粉或铝粉粒度为200目，对于100毫米高毛坯保压5分钟，中间放气三次，烧结时升温速度50-60℃/小时，在320℃时保温1小时，降温至150℃时出炉。毛坯车削前，应预热到80℃，保温一小时后再进行。软带应经萘钠处理，其中萘51克，四氢呋喃100毫升，金属钠适量，厚1毫米以下的软带在萘钠处理液中1-3分钟，然后用90℃热水冲洗。
如PTFE可共混进聚苯、聚酰亚胺、聚对羟基苯甲酸酯，同时填充石墨、二硫化钼、青铜粉等可应用在水工闸门上、氟塑料46可用在耐腐蚀球阀上，其模压温度320-350℃、模压压力3-30兆帕、定型保温温度120-150℃。
又玻璃纤维增强PTFE管作为钢管内衬，可解决管道腐蚀问题，其工艺流程如下：
PTFE树脂→捣碎过筛→但压成型→烧结定型→管外圆车削→检测→表面活化处理→玻璃钢→装法兰→包法兰→固化→法兰头车削→脱芯棒→装垫片→翻边→成品
如聚偏氟乙烯密封圈：加1份吸酸剂，混合球磨24小时，在模板温度为195-250℃压机中，徐徐加压至2.5-3.5兆帕，中间放气1-2次，模温升至180-190℃时迅速移到冷压机在14兆帕压力下冷却，50℃时取出，修除毛边，再放进130℃烘箱，热处理24小时，即可检验包装。
又氟塑料品种发展为：含氟环氧树脂(用于光通讯系统)、全氟弹性体(用于半导休设备)、热塑性氟弹性体(用于医疗、电缆涂层)、全氟聚醚(用于耐高低温的润滑脂)。还有聚氟乙烯进行无溶剂加工，只须添加9份润滑剂、4份热稳定剂、2份其他助剂即可成型加工。
氟塑料性能表
　　成型收缩率
　　断裂拉伸强度
　　断裂伸长率
　　弯曲强度
　　弯曲模量
　　缺口冲击强度
　　熔点温度
　　长期耐热温度
　　热变形温度(18.5kg/cm2)
　　热变形温度(4.6kg/cm2)
　　低温脆性
10mcm/cm℃
　　热膨胀系数
　　介电常数
　　介质损耗系数
　　耐电弧性
　　水汽渗透性比较
　　磨擦系数比较
　　单位体积重量比较
　　　注射成型比较
线缆成型比较
液塑成型比较
浸塑成型比较
　　吹塑成型比较
　耐磨性能比较
　机加工性能比较
氟塑料发展前景
在越来越多的国内含氟塑料制品走出国门的同时，众多国外知名氟塑料加工企业也已经或正准备落户中国。中国氟塑料加工专业委员会秘书长陈生分析说，未来5～10年，中国极有可能成为世界氟塑料制品(特别是低端产品)的生产基地，对国内企业而言，当务之急是及时调整经营策略，提高自身优势以立足市场。
目前国内氟塑料行业的发展是无限商机中有隐忧。据不完全统计，国内拥有氟塑料加工企业近千家，其中部分企业2003年的氟塑料制品产量超过600吨，产值超过5000万元。经过多年的发展，这些企业在研制、加工和应用等方面取得了长足进步，加工设备和工艺有了很大改进，新品不断出现。特别是2008年奥运会场馆的建设，氟塑料加工行业也将整体受益。
但是，陈生指出，近几年国外大批与氟塑料制品加工相关的企业相继进入中国，由于国外先进企业拥有高度自动化的生产设备和高水平的管理机制，使得他们的产品在中国的市场份额将逐步扩大，这势必会对国内现有的加工企业造成冲击。
在分析氟塑料行业发展现状时，陈生认为存在问题不少。表现在聚四氟乙烯半成品偏多，多数企业产品雷同，高技术含量、高附加值产品少。多数企业还延续二十世纪七八十年代的加工工艺，专业技术人员严重缺乏，企业对新产品、新工艺的开发缺乏投入。另外，由于知识产权保护不力，造成不合理竞争，大多数氟塑料加工设备只是在旧设备的基础上翻版改造，很难加工高技术含量的产品。特别与国外企业形成鲜明对比的是，对售后服务认识不足是国内氟塑料加工企业普遍存在的问题。企业没有技术力量和足够的资金支持进行售后服务，无法形成良好的信息反馈渠道，很难开发高性能、高附加值的终端产品。为此，陈生提醒国内企业，应该正视存在的问题，尽快弥补不足，从而获得更大收益。
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龙眼干，也称桂圆干。由鲜果经日晒或人工烘焙而成。日晒制法时间长，且受天气限制，故多用人工烘焙。大量水分蒸发后，干果可以久存。热泵龙眼烘干机烘干工艺：原料选择→剪果→分级→清洗→过摇(磨皮)→初焙→再焙→三焙→剪蒂→再分级→包装。
1、原料选择。焙干用的龙眼，以果大、皮稍厚、肉质厚，制干后摇动不响，肉有皱纹的品种*，如大乌园、大广眼、福眼、乌龙岭等品种用于制干品较好。
2、剪果。原料进厂后用果剪逐粒从果穗剪下，留果梗长约1.5毫米，不要剪太深，以防果壳破裂。
3、分级。用分级机或分级筛按果实大小分为4级或6级。并清除病虫果、裂果、小果。
4、清洗。果实装入竹篓中，浸入清水3—4分钟，洗除果面灰尘等脏物。经过一系列的前提准备，接下来是进行专业烘烤；
初次烘烤。龙眼过摇后，摆放在烘烤架子上，推进烤房烘烤。初次烘烤要用高温烘烤，温度控制在70℃以上，烘烤时间6~8小时，中期温度控制在60℃~70℃，整个烘烤时间大概在三十个小时左右，直到烤房中果壳变硬。
再次烘烤。初次烘烤的龙眼干经放置1―2天后，果核、果肉内部水分逐渐向外扩散，果肉表面比刚烘后较为湿润，须再行烘烤。这时可将初焙龙眼干分成大小果2个等级，分别烘焙。再焙方法与初焙相同，温度控制在60℃左右，烘焙时间约4―6小时。一般龙眼经过再焙烘至果梗用手指轻推就脱落时即可。此时，果肉呈现细密皱纹，深褐色，表面干燥，用手指压无果汁流出，牙咬果核易裂开，断面呈草木灰色，即为烘干适度，一般烘干率为33―36％。热泵龙眼烘干机特点：高效节能环保：能效比高达3.0-4.0，一度电可释放出3-4度电的热能，不需要任何燃料，只需要少量运行电能即可，运行过程不排放任何有害物质； 智能安全卫生：高智能自动化程序，可实现24小时无人看守运行，十几道安全保护措施、水电房分离、阻燃材质烤房等，保证了设备无安全隐患，纯热风烘干方式，使物料跟卫生 烘干速快质好：恒温平衡阶段式去水技术，符合物料物理去水方式，纯热风恒温循环，使物料受热更均匀，烘干速度更快，质量更好 实用性强：可用于各种温度要求在90度以下的物料，如：罗汉果、荔枝、龙眼、柿子、辣椒、淮山等等各类中药材、果脯、海产品、农副产品、食品领域的烘干除湿。龙眼烘干机功能：1、本烘干机温度从10℃至75℃可任意调节选定工作温度，并借助箱内温控系统自动恒温。它适用与烘焙，工业烤箱热处理或其他加热用，也是实验室常备仪器。2、烘干机之工作温度可由室温起至最高温度止，在此范围内可任意选定工作温度，选定后可借箱内自动控制系统使温度恒温。3、本公司烘干机有室内循环风机，促使室内热空气机械对流，使室内温度更为均匀。4、烘干机恒温烘干箱结构精密，控温灵敏准确，操作简单，适用于工矿企业、食品企业、农产品行业、海产品行业等单位实验室对物品进行干燥、烘焙、热处理之用。5、是新一代产品，控温灵活、准确，清晰直观。龙眼烘干机、空气能龙眼烘干机价格、节能龙眼烘干机厂家；
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PFA 塑胶的料筒温度是多少？
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正宗PFA的料筒温度，特别是熔融段，温度要到350-370度。
成型温度在360-400摄氏度
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有关原位杂交的问题
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这个帖子发布于13年零330天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近做的原位杂交一直未出结果,不知道那里出问题.而这个指标的免疫组化已经做出结果了.标本是从医院病理科石蜡块中取的,切片过程中未做任何处理.做前在60度左右的烤箱中烤了近4天(这种处理方法是听其他做过原未杂交的同学说的),然后按照博士德的原位杂交说明书操作的.胃蛋白酶消化时间取了10分和30分两次,杂交过夜时间一般为15个小时.到底哪步关键,请高手指教!迫切!
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试剂盒中杂交液配制&&去离子甲酰胺&&20×SSC&&&&硫酸葡聚糖1&&Denhardt液2&&10%SDS&&鲱鱼精DNA3&&消毒双蒸水加入量：&&5ml&&2.5ml&&1.0g&&500ml&&500&l&&100&l&&400&l终浓度：&&50%&&5×&&10%&&5×&&2%&&100&g/ml&&1加温至50℃在加硫酸葡聚糖； 2在50℃混合，待聚合物溶解后再加入100×Denhardt液（100×Denhardt液配制法：聚蔗糖10g，聚乙烯吡咯烷酮10g，牛血清白蛋白10g，消毒双蒸水定容至100ml）； 3 10mg/ml变性的鲱精DNA2杂交温度
能使50%的核苷酸变性解链所需的温度，叫做链温度或融解温度（Tm）。杂交温度应低于杂交体的Tm20—30℃，原因在于这一温度下的杂交率最好。一般，当杂交液含50%甲酰胺，盐浓度为0.75mol/L左右时，寡核苷酸探针约为37℃。3杂交时间
杂交反应的时间可能随着探针浓度的增加而缩短，但在一个相当大的范围内，杂交反应应在4—6h内完成。但为稳妥起见，一般将杂交反应时间定为16—20h。为了工作安排方便，可将杂交液和标本孵育过夜。然而，杂交时间不要超过24h反应时间过长，形成的杂交体会自动解链，杂交信号反而会减少。杂交反应 1杂交液
杂交液内除含一定浓度的标记探针外，还有较高容度的盐类、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等。杂交液中含有较高浓度的Na+可使杂交率增加，降低探针与组织标本之间的静电结合。甲酰胺可使Tm降低，杂交液中加入适量的甲酰胺可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏及标本的脱落。硫酸葡聚糖能与水结合，从而减少杂交液的有效容积，提高探针的有效浓度，以达到提高杂交率的目的。在杂交液中加入牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等，都是为了阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，以减低背景。原位杂交组织化学概述　　一、核酸分子杂交技术　　1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是70年代末到80年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，核酸自动合成仪的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上（常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交有菌落原位杂交（colony in situ hybridization）、斑点杂交法（Dot blot）、Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（Northern blot）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。　　二、原位杂交组织化学技术的由来及发展　　原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交（In situ hybridization），如上所述，属于固相核酸分子杂交的范畴。但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交。Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段，而Northern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。1969年美国耶鲁大学Gall 和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，Buongiorno – Nardelli和Amaldi,John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位，但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针均采用同位素标记。　　由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学科研工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。Bauman（1981）等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。　　Pezzella（1987）创建了用磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆抗体识别磺基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。本法的优点是磺基化DAN探针标记简便，不需作缺口平移标记，敏感度也较高。但自生物素和地高辛标记探针技术建立后，已有取而代之的趋势。生物素标记探针技术是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。这种生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。另一种叫光促生物素标记核酸技术，该技术是用光敏生物素（Photobiotin）标记核酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素，它们都是由三个部分组成：光敏基团、连结臂和生物素。在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每100～150个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度（Forster et al 1985）。　光敏生物素结构图　　近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起科技工作者的极大兴趣。Boeringer Mannhem Bio－chemisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，可以检测出人基因组DNA中的单拷贝基因。地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色（标记碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景。　　核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等。DNA探针还有单链DNA（Single stranded, ssDNA）和双链DNA（Double stranded, dsDNA）之分。早期应用的主要是DNA探针，继之Temin在70年代研究致癌RNA病毒时制备了cDNA探针（complementary DNA），其基本原理是以RNA为模板，经逆转录酶（reverse transcriptase）又称为RNA指导的DNA聚合酶催化产生的。该酶以RNA为模板，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA，这一途径与一般遗传信息流的方向相反，故称逆转录。CDNA是指互补于mRNA的DNA分子。RNA探针是将特异性的cDNA片段插入含有相当的RNA聚合酶启动子的转录性载体。这类载体包括pSP64和pSP65，它们具有不同的启动子在多克隆位点的各侧。Psp64和pSP65在sP6启动子的多克隆位点的方向是不同的。通过改变外源基因的插入方向或选用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的转录方向，即以哪条DNA链为模反转录RNA。从而可以得到与mRNA同序列的同义RNA探针（Sense probe）和与mRNA互补的反义RNA探针（antisense probe），又称互补RNA探针（complementary RNA probe , cRNA）。通常用同义RNA探针做为反义RNA探针的阴性对照。由于RNA探针是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应极高。有报告认为其杂交率高于DNA探针的8倍。　　DNA合成仪的诞生使制造寡核苷酸探针成为可能，与上述探针不同的是寡核苷酸探针不是克隆性DNA探针，它是由DNA合成仪依照所需杂交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，价格低廉的优点，也可进行放射性与非放射性标记，但其特异性不如克隆性探针强，亦不如其杂交信号高。　　原位杂交组织化学技术在近20年的发展可以说是飞跃的，其突出的特点是由分子遗传学研究提供的探针大量增加，探针生产的可靠性和速率大大发展了，更重要的是非放射性标记物的发展使原位杂交组织化学技术在不久的将来将和现今的免疫细胞化学技术一样成为实验室的常规技术和临床日常应用的诊断技术。新的非放射性标记技术正在继续不断涌现。Coulton（1991）建议将非放射性标记技术更名为亲合复合物标记技术（Affinity – Complex Labelled Probes, ACLP ）。因为“非（non）“在英文里是一个否定的名词，而且根据非放射性标记技术的原理是将一个标记物利用其亲合性，应用直接或间接的方法结合在核苷酸分子上。　　原位杂交组织化学技术在生命科学的研究中可视为一项**性的技术。它使它们的研究从器官、组织和细胞水平走向分子水平。为各个学科的研究带来突破性的进展。其中特别突出的是细胞或组织的基因表达、染色体分析、病毒诊断和发育生物学。　　三、原位杂交组织化学技术的基本方法　　如前所述，由于核酸探针的种类和标记物的不同，在具体应用的技术方法上也各有差异，但其基本方法和应用原则大致相同。大致可分为：①杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；②杂交；③杂交后处理；④显示（visual－ization）：包括放射性自显影和非放射性标记的显色。　　（一）固定　　原位杂交组织化学技术（In Situ Hybridization Histochemistry, ISHH）在固定剂的应用和选择上应兼顾到三个方面：保持细胞结构，最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA却绝然不同，非常容易被降解。因此，对于DNA的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解减少到最低限度，那么，不仅固定剂的种类浓度和固定的时间十分重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。在解释ISHH的结果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对RNA保存所带来的影响，因组织中mRNA的降解是很快的。在固定剂中，最常用的是多聚甲醛。和其它的固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。其它如醋酸-酒精的混合液和Bouin’s固定剂也能获得较满意的效果。对于mRNA的定位，我们常采用的方法是将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1～2h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70℃。如冰箱温度恒定，在-70℃可保存数月之久不会影响杂交结果。在病理学活检取材多用福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号，但石蜡包埋切片由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。同时，在包埋的过程中可减低mRNA的含量。其它固定剂如应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片也可获得满意效果。各种固定剂均有各自优缺点，如沉淀性（Precipitating）固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液等能为增加核酸探针的穿透性提供最佳条件，但它们不能最大限度地保存RNA，而且对组织结构有损伤。戊二醛能较好地保存RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质产生广泛的交叉连接，从而大大地影响了核酸探针的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公认为ISHH较为理想的固定剂。　　（二）玻片和组织切片的处理　　1．玻片的处理玻片包括盖片和载片应用热肥皂刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24h，清水洗净烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在150℃或以上过夜以去除任何RNA酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放。　　由于ISHH的实验周期长，实验程序繁杂，因此，要应用粘附剂预先涂抹在玻片上，干燥后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切片不致脱落。常用的粘附剂有铬矾-明胶液，其优点是价廉易得，但在长周期实验过程中，粘附效果不够理想。多聚赖氨酸液具有较好的粘附效果，但价格昂贵，需进口。近年Vector Lab (U.S.A.)推出一种新的粘附剂叫Vectorband Reagent,每一单位包装可制备500～700张载玻片，粘附效果极佳，价格较多聚赖氨酸便宜，制片后可长期保存应用。目前国内尚无生产，需国外进口。　　2．增强组织的通透性和核酸探针的穿透性此步骤根据应用固定剂的种类、组织的种类、切片的厚度和核酸探针的长度而定。比如用戊二醛固定的组织由于其与蛋白质产生广泛的交叉连接就需要应用较强的增强组织通透性的试剂。增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂（detergent）或称清洗剂Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。这种广泛的去蛋白作用无疑可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但同时也会减低RNA的保护和影响组织结构的形态，因此，在用量及孵育时间上应慎为掌握。　　蛋白酶K（Proteinase K）的消化作用在ISHH中是应用于蛋白消化的关键步骤，其浓度及孵育时间视组织种类、应用固定剂种类、切片的厚薄而定。一般应用酶k 1μg/ml(于0.1mol/l Tris/50mmol/L EDTA, pH8.0缓冲液中),37℃孵育15～20min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。在蛋白酶K消化后，应用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以终止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂。为保持组织结构，通常用4%多聚甲醛再固定。Burns等（1987）报告应用胃蛋白酶（Pepsin）20～100μg/ml（用0.1n HCl 配）37℃、30min进行消化，所获实验结果优于蛋白酶K。　　不少实验工作者在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（acetic anhydride）和三乙醇胺（tri－ethanolamine）中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。有的科研工作者除在室温下浸于上述溶液10min外，还在预热37℃的50%甲酰胺/2×SSC液中预杂交15min，然后用2×SSC，0.30mol/l NaAc/0.030mol/L枸橼酸钠液中浸15min。但Heinz、Hofer等一些著名学者却对此持有异议，根据他们的实验和经验证明，乙酸酐和三乙醇胺液的处理并不能起到减低背景的目的，不能改善ISHH的信/噪比例。　　3．减低背景染色和免疫细胞化学染色一样ISHH实验程序中，如何减低背景染色是一个重要的问题。ISHH中背景染色的形成是诸多因素构成的。杂交后（Posthybridization ）的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。　　预杂交（Prehybridization）是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。　　有的实验室在杂交后洗涤中采用低浓度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗涤一次，以减低残留的和内源性的RNA酶，减低背景染色。　　4．防止RNA酶的污染由于在手指皮肤及实验用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温（240℃）烘烤以达到消除RNA酶的目的。要破坏RNA酶，其最低温度必须在150℃左右。有条件的国外实验室在消毒的玻璃器皿外包以锡箔纸以利于标记和防止取出时空气污染。（在无高温消毒的烤箱时，亦可用国内出产的卫生蒸汽消毒锅）。杂交前及杂交时所应用的溶液均需经高压消毒处理。　　（三）杂交（Hybridisation）　　在ISHH，整个实验周期是比较长的，实验程序也比较繁杂，而杂交在ISHH整个实验中可被认为是“短兵相接”的一步。杂交前的一切准备工作如增加组织通透性都是为了在杂交这一步骤中核酸探针能进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合。因此，杂交是ISHH中关键的而且是最重要的一个环节　。　　杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。国内向正华等采用无菌的蜡膜代替硅化的盖玻片也可获得满意的实验结果。加盖片的目的是防止孵育过程中的高温（50℃左右）导致杂交液的蒸发。因此，也有为稳妥起见，在盖玻片周围加液体石蜡封固的，但科研工作者认为这并不十分必要，因封固的石蜡在高温下融解反易导致杂交液的污染，必要时可加橡皮泥封固盖片四周。硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑不会产生气泡和影响组织切片与杂交液的接触，盖玻片自身有一定重量能与有限的杂交液吸附达到覆盖和防止蒸发的作用。在孵育时间较长时，为保证杂交所需的湿润环境，可将复有硅化盖玻片进行杂交的载片放在盛有少量5×SSC或2×SSC（standard saline citrate, SSC）溶液的硬塑料盒（要能防止高温破坏）中进行孵育。杂交液的成分和预杂交液基本相同，所不同的是加入了标记的核酸探针和硫酸葡聚糖。　　如前所述，杂交前的准备只是为杂交的成功奠定基础，要获得满意的实验结果，在杂交这一实验过程中还须注意以下的环节　。　　1．探针的浓度很难事先确定每一种实验探针的浓度，但要掌握一个原则，即探针浓度必须给予该实验最大的信/噪比值。背景染色的高低也与探针浓度有关。根据国内外实验工作者的经验，认为最佳原则应是应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合度为目的。这和我们在免疫细胞化学试验中选择抗血清的最佳工作浓度的原则一样。　　探针浓度依其种类和实验需要略有不同，根据笔者的经验及所查阅文献，在原位杂交细胞化学中，探针浓度为0.5～5.0μg/ml（即0.5～5.0ng/μl）。根据Heinz 、Hofelt实验室经验，对放射性标记的dsDNA或cRNA探针，其浓度在2～5ng/μl。Conlton认为生物素标记探针，其最佳浓度在0.5～5ng/μl。科研工作者在英皇家研究生院Polak教授实验室应用于放射性标记cRNA探针的浓度为0.5ng/μl，而在非放射性标记（生物素或地高辛）cRNA探针浓度为2.5ng/μl，放射性标记DNA探针浓度为1.0ng/μl。向正华等应用地高辛标记生长抑素cRNA探针获得满意结果，其探针浓度为0.5ng/μl。　　必须强调的是，国内外实验室都证明加杂交液的量要适当，以10～20μl/每张切片为宜。杂交液过多不仅造成浪费，而且液量过多常易致盖玻片滑动脱落，影响杂交效果，过量的杂交液含核酸探针浓度过高，反易导致高背景染色等不良后果。　　2．探针的长度一般应用于ISHH探针的最佳长度应在50～100个碱基之间。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。据报告，长500个碱基的探针，其杂交时间约需20h左右。200～500个碱基的探针仍可应用，如超过500个碱基的探针则在杂交前最好用碱或水解酶进行水解，使其变成短的片段，达到实验所需求的碱基数。　　附：核酸探针水解法（以放射性标记探针为例）　　（1）按下列比例混合　　探针溶解于水160μl无菌蒸馏水加入含标记探针沉淀物的Eppendrof管中　　0.4mol/L NaHCO3　　　 20μl　　0.6mol/L Na2CO3　　　 20μl　　混合后孵育于60℃水浴，其孵育时间由下式推算：　　孵育时间= LO –Lf/K×LO–Lf　　LO：核酸探针原长度（Kb）　　Lf ：核酸探水解后所需长度（Kb）　　K：是一常数0.11Kb/min　　（2）在室温中加入下列配方以终止水解　　3mol/L 醋酸钠　　　　　　　6.6μl(最终浓度0.1mol/L)　　醋酸1.3μl(最终浓度0.5%)　　（3）加下列配方沉淀探针　　7mol/L 醋酸铵100μl　　100%乙醇750μl　　tRNA(10mg/ml)　　　　　　　2μl　　置于-20℃2h后回暖至室温，在14000rpm离心30min。　　（4）小心将乙醇轻轻倾出，待试管内干燥后再用无菌蒸馏水稀释到10ng/μl浓度。　　（5）应用放射性标记测定法测定其放射比活性，然后调到5ng/μl浓度。　　3．杂交的温度和时间杂交的温度也是杂交成功与否的一个重要环节　。概述中曾提到DNA或RNA需加热或变性、解链后才能进行杂交。能使50%的核苷酸变性解链所需的温度，叫解链温度或融解温度（melting temperature, 简称Tm）。原位杂交中，多数DNA探针需要的Tm是90℃，而RNA则需要95℃。这种高温对保存组织形态完整和保持组织切片粘附在载玻片上是不可能的。因此，在杂交的程序中常规的加入30%～50%甲酰胺（for－mamide）于杂交液中。McConaughy报告，反应液中每增加1%的甲酰胺浓度，Tm值可降低0.72℃。因此，可用调节盐浓度的办法来调节Tm。Tm的计算公式有介绍，由公式的列出也表明了它与盐的浓度、探针的长度、甲酰胺的百分比等诸多因素有关。由于盐和甲酰胺浓度的调节等因素，实际采用的原位杂交的温度在Tm-25℃左右，即比Tm减低25℃，大约在30～60℃之间，根据探针的种类不同，温度略有差异，RNA和cRNA探针一般在37～42℃左右，而DNA探针或细胞内靶核苷酸为DNA的，则必须在80～95℃加热使其变性，时间5～15min，（有作用报告在105℃微波炉加热使之变性），然后在冰上搁置1min，使之迅速冷却，以防复性，再置入盛有2×SSC的温盒内，在37～42℃孵育杂交过夜。　　杂交的时间如过短会造成杂交不完全，而过长则会增加非特异性染色。从理论上讲，核苷酸杂交的有效反应时间在3h左右。Barns等（1987）报告用DNA探针杂交，其反应完成时间为2～4h。但为稳妥起见，一般将杂交反应时间定为16～20h，或为简便起见杂交孵育过夜，从现有文献报告看无不良结果。当然，杂交反应的时间与核酸探针长度与组织通透性有关，在确定杂交反应时间应予考虑，并经反复实验确定。　　有科研工作者主张杂交反应的孵育应在黑暗环境中进行，因为光线会促进甲酰胺的电离作用。　　4．杂交严格度（Hybridization stringency）杂交条件的严格度（stringency）表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度。错配对(mismatch）杂交的稳定性较完全配对杂交体差，因此，通过控制杂交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的形成，提高杂交的特异性。所以，杂交的条件愈高，特异性愈强，但敏感性降低，反应亦然。一般来说，低严格度（low stringency）杂交及冲洗条件在Tm -35℃至Tm -40℃之间，高盐或低甲酰胺浓度。在这种条件下，大约有70%～90%的同源性核苷酸序列被结合，其结果是导致非特异性杂交信号的产生。中严格度，Tm -20℃至Tm-30℃的范围。高严格度（high stringency）为Tm-10℃至Tm-15℃，低盐和高甲酰胺浓度。在这种条件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成稳定的结合。麦跃行装用地高辛标记原位杂交技术检测尖锐湿疣中人乳头瘤病毒DNA型别，结果发现在严格条件下（Tm-12℃）各型病毒DNA的检出率和阳性率明显低于非严格条件下（Tm-35℃），其相差非常明显（P&0.001）。因为，在严格条件下只有同源性很强的DNA才被检出，而在非严格条件下同源性较低的DNA序列也被检出。因此，他建议对病毒DNA分型需在高严格条件下进行，而低严格条件则可用于对病毒感染进行筛选。　　由于原位杂交技术多数是在Tm-25℃进行的，不属于高严格范围，无疑会产生非特异性结合导致信/噪比减低。在这种情况下，可用加强杂交后处理洗涤的严格度使非特异性的杂交体减少。由于RNA杂交的稳定性，应用cRNA探针进行细胞或组织的原位杂交时的杂交温度比其它核酸探针要高10～15℃。实验证明，cRNA产生的信号比双链cDNA要强。单链的RNA探针其杂交信号大于双链的cDNA的约8倍。　　5．硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）和甲酰胺（formamide）硫酸葡聚糖是核酸杂交液中仅次于甲酰胺的一种组成成份。在杂交液中，甲酰胺占50%左右，而硫酸葡聚糖占10%左右。它是一种大分子的多聚胺化合物，具有极强的水合（hydrate）作用，因而能大大增加杂交液的粘稠度。硫酸葡聚糖的主要作用是促进杂交率，特别是对双链核酸探针。这是应用硫酸葡聚糖于杂交液中的主要目的。　　甲酰胺的主要作用在上节　已提及，在调节　杂交反应温度方面，甲酰胺起了极为重要的作用，从而有助于保持组织的形态结构。甲酰胺还可防止在低温时非同源性片段的结合，但甲酰胺具有破坏氢键的作用从而具有一种不稳定的作用。　　（四）杂交后处理（post hybridisation treatment）　　杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。在原位杂交组织化学的实验程序中，这也是一个重要的环节　。特别因为大多数的原位杂交实验是在低严格度条件下进行的，非特异性的探针片段粘附在组织切片上，从而增强了背景染色。RNA探针杂交时产生的背景染色特别高，但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。在杂交后漂洗中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。洗涤的条件如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核酸探针的类型和标记的种类不同而略有差异，一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。必须注意的是在漂洗的过程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了背景染色。放射性标记探针杂交后漂洗过程中可用底片曝光的方法检测背景染色（非特异性标记的多少）作为改善漂洗程序的指针。在35S标记的核酸探针在漂洗液中须加入14mmol/L的β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）或硫代硫酸盐（thiosulphate），以防止35S标记的核酸探针被氧化。总之，如何控制漂洗的严格度从而达到理想的信/噪比无既定方案可循，必须从反复的实践中取得经验。　　（五）显示（Visualization）　　显示又可称为检测系统（Detection system）。根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理（详见本章　第二节　）。　　细胞或组织的原位杂交切片在显示后均可进行半定量的测定，如放射自显影可利用人工或计算机辅助的图象分析检测仪（computer – assisted image analysis）检测银粒的数量和分布的差异。非放射性核酸探针杂交的细胞或组织可利用酶检测系统显色，然后利用显微分光光度计或图像分析仪对不同类型和数量的核酸的显色强度进行检测。但利用ISHH做半定量测定必须注意严格控制实验的同一条件，切片的厚度和核酸的保存量如取材固定的间隔时间等。如为放射自显影，核乳胶膜的厚度与稀释度等必须保持一致。　　（六）对照实验和ISHH结果的判断　　和其它实验方法一样，并非ISHH的任何阳性信号都是特异性的，故必须同时有对照试验以证明其特异性。对照试验的设置须根据核酸探针和靶核苷酸的种类和现有的可能条件去选定，常用的对照试验有下列几种（表20-1）。ISHH对照试验一览表核乳胶或非放射性检测系统对照试验Northern 或Southern印迹杂交法*ISHH与免疫细胞化学结合*应用多种不同的核苷酸探针与同一靶核酸进行杂交将cDNA或cRNA探针进行预杂交（吸收试验）*与非特异性（载体）序列和不相关探针杂交（置换试验）将切片应用RNA酶或DNA酶进行预处理后杂交*应用同义RNA探针（Sense probe）进行杂交*以不加核酸探针杂交液进行杂交（空白试验）组织对照用已知确定为阳性或阴性组织进行ISHH对照应用未标记探针做ISHH，进行对照　　从理论上讲，对照试验设置愈多其靶核苷酸特异性确定愈可靠，但现实是不可能的。因此，在上述对照试验中应任选设至少3～4种用以证实ISHH结果的可靠性。在上述试验中，标明*者为比较可靠的对照试验。①Northern 和Southern印迹杂交法证明的方式和用Western印迹法检测抗体（蛋白质）的特异性一样，是比较可靠的。②如果具备相当的免疫组化抗血清，可用结合的免疫组织化学和ISHH法从蛋白质（或多肽）水平和转录水平在相邻切片或同一切片中证明同一种多肽和相应mRNA共存于同一细胞中。③预先将切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技术证明丢失的是DNA或RNA。如同免疫组化的吸收试验一样，事先与特异性的cRNA或cDNA进行杂交。再进行ISHH，其结果应为阴性。④由于同义RNA探针和组织内mRNA序列顺序是相同的，应用其进行ISHH，结果应为阴性。检测系统的对照如乳胶或酶显色系统也应在无标记探针的情况下进行。ISHH的最大优点是它的高度特异性，它可测定组织、培养的单个细胞或细胞提取物中的核苷酸含量。应用高敏感度的放射性标记cRNA探针在理想的ISHH的实验条件下检测mR－NA，其敏感度可达到20个mRNA拷贝/每个细胞。由于双链DNA的稳定性，在用ISHH定位DNA时很少发生丢失，降解。在靶核苷酸序列比较伸展的情况如染色体铺片，长于2kb的探针可以应用。因此，其敏感性高到能够出在染色体铺片上，有时甚至在组织切片上的单个基因拷贝。正因为如此，对ISHH结果的解释应持慎重态度，特别是前人未报告过的新发现。因为如前所述，影响ISHH实验结果的因素太多，比如在外科或实验取材后未及时的固定或冷冻可由于组织中mRNA的降解而导致假阴性结果。另外，在各种类型核酸探针进入细胞、组织和各种器官的能力，又叫可接近性（acessiblity）各异。这些诸多因素都将影响ISHH的实验结果。原位杂交组织化学常用试剂及处理　　一、杂交前准备　　（一）DEPC水是经DEPC处理过的灭菌蒸馏水。　　DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂。原位杂交在杂交及其以前的各步处理中，所有液体试剂都应经DEPC处理。方法是：取市售DEPc 1ml，加入1L待处理水（蒸馏水等）中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPC（DEPC分解为CO2和乙醇）。有些试剂可直接加入DEPC，终浓度一般为0.1%～0.4%，原则上在杂交及其以前的步骤中，所有液体试剂均需用DEPC处理，或用DEPC水配制，包括乙醇的稀释。此外，接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需DEPC水洗涤。　　注意：①DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。②含有Tris缓冲液的溶液中，不能加入DEPC。　　（二）载玻片的处理　　组织原位杂交，常在载玻片上进行，故载玻片的洗涤至关重要，必须保持清洁，并且不能有任何核酸的污染。处理方法如下：　　（1）先经洗衣粉浸泡过夜，次日自来水冲洗后，泡酸数小时以上，取出后再用流水冲洗，双蒸水冲洗2～3次，置160℃以上烤箱中烧烤4h以上，或经15磅高压灭菌20min。经以上处理可清除载片上的核酸酶。　　（2）HCl处理法 　　（三）硅化　　【方法１】（1）将一扎新的盖玻片散开，在通风条件下于0.1mol/L的HCI中煮20min,等其冷却后,倒掉盐酸。　　（2）用去离子水沉漂洗玻片，竖放在架子上自然干燥。　　（3）硅化盖玻片：通风条件下，将单块的盖玻片在二甲二氯硅浣（dimethyldichorsilane,DMDC）液中浸几下，竖入在架子上干燥。　　（4）收集干燥的盖玻片于一可耐热的petri氏盘（或培养皿）中，用去离子水漂洗数次，彻底清洗。　　（5）用铝箔将装有盖玻片的培养皿包好，于180℃烘烤4h过夜。取出待冷至室温后，即可进行后续处理。附：2%DMDC　　配制：按比例两者充分混匀，静止待气泡消失即可使用。　　用途：硅化玻片（载片、盖片均可）。　　【方法2】将经过洗净的玻璃盖片分散开放在一金属网中，并将该网放入一接有真空泵的干燥器中。同时，在干燥器中放一盛有约1m二甲二氯硅浣（dimethyldiorosilane,DMDC）的小烧杯。盖好干燥器（确保密闭），抽真空约5min，然后让空气冲入。取出盛有盖片的金属网架，用锡箔纸包埋，于250℃以上烘烤4h以上，最好过夜。冷却后备用。　　　本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于60℃烧干。【方法3】APES（氨丙基三乙氧基硅浣）法　　【方法4】　　（1）49ml氯仿与1mg二甲二氯硅浣（DMDC）配液；　　（2）倒入每个拟硅化的试管或离心管中，浸泡5min后用乙醇或重蒸水冲洗；　　（3）玻璃器皿使用前位于180℃以上烘烤2h以上，塑料器皿应于60℃烘烤过夜。　　注意：DMDC有毒且高度挥发，应于通风环境操作并戴口罩、手套，避免接触皮肤或吸入。　　（四）载片的包被（粘贴）　　１．沾附剂（1）多聚赖氨酸(poly-L-Lycine,PLL)　　储备液（0～5%）　　　　按上述剂量充分混合，即为浓度为5mg/ml(0.5%)的PLL液。常分装成1ml的包装，-20℃存放。该液为储备液，可反复冻融，无明显影响。用前充分混合。工作液（0.01%）：　　充分混合，静止待气泡消失。　　（2）明胶液　　配法：先称取明胶溶于500～800ml DEPC水中，加热搅拌助溶，待明胶完全溶解以后，加入甲明矾溶解后即可使用。注意，包被玻片时，明胶液温度最好保持在60℃左右，效果最佳。方法同PLL包被玻片。　　2．多聚赖氨酸包被玻片的制备方法（其它包被剂相同）　　（1）将事先准备好的经160℃以上烘烤，并冷却至室温的玻片（载片或盖片），在0.05%（也有用0.1%）的PLL液中上下浸蘸几下，分散开竖放在架子上，于空气中自然干燥，4℃备用。注意：①浸蘸时，务必使整个玻片完全浸于液体中，否则，包被不完全会产生标本脱落现象；②干燥过程中注意避免尘埃污染；③按上法处理的玻片通常可存放在一定时间（室温1月以上，4℃更长），但仍建议尽早使用。　　（2）多聚赖氨酸1mg溶于10ml灭菌的去离子水或1mmol/L的Tris-HCl缓冲液中（pH7.0），将其涂布于玻片上，待干燥后即可使用。该法包被的玻片可用于细胞涂片和切片。　　（3）将PLL工作液滴至盖玻片上5μl/片，用另一盖玻片以推血涂片方法推片，或用另一盖玻片紧贴于其上，相互磨擦以使两盖玻片相对的一面涂布上PLL。该法制备的玻片，只有一面是包被有PLL，故制备时，待其晾干后，应作好记号，然后保存后备用。　　多聚赖氨酸可用于多种核酸杂交，方法简单，结果可靠，有许多其它方法不可比拟的优点。配制好的液体可存放于4℃或室温，但时间过长会解聚而失效，故建议使用时尽量新鲜配制。　　（4）Vectabond粘附剂　　该试剂是Vector公司新近推出的一种新型粘附剂。它与其它粘附剂的主要区别是：一般的粘附剂是通过物理性覆盖在玻片表面，天长日久，可能由于包被不完全或局部脱落而致切片等标本易于脱落。而Vectabond试剂是通过化学性作用，改变玻璃表面的分子结构，使标本贴附牢固，不易脱落，且保持时间长久，耗量小，价格便宜，一个包装7ml可配成350ml工作液使用。操作程序：　　标本（铺片、切片等）→丙酮（5min）→Vectabond试剂工作液（5min）→dH2O(2×5min)→干燥（温箱，数小时过夜）→用铝箔包好，室温备用。　　注意：制备和保存过程中避免污染。　　经上述处理的载玻片一般可存放半年以上（4℃可更长）。　　（五）硅鱼精子DNA的制备　　（1）在50ml灭菌聚乙烯管中加入1g鲑精DNA，加入15ml DEPC水使其浸泡5min至2h；　　（2）加入2.5ml 2mol/L HCl，室温放置，DNA形成白色沉淀，充分振摇至沉淀物相互缠绕在一起，用吸头尖端使之形成一球团状（2～3min）；　　（3）加入5.0ml 2mol/L的NaOH。摇动小管使DNA悬浮、溶解，将小管置50℃15min助溶；　　（4）用DEPC水将混合物稀释至175ml（总体积），充分混合，注意确保管内已无颗粒状；　　（5）加入20ml/l 1mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH7.4）；　　（6）用2mol/L的HCl滴定至DNA溶解pH为7.0～7.5；　　（7）用无菌微孔滤膜过滤液体，去除颗粒。260nm测定溶液的OD值，方法是：取20μl DNA液混合于980μl水中，混匀后测定，吸收值乘以50即为DNA浓度（μg/ml）；　　（8）制备好的DNA液储于-20℃备用，用前取出冻融后煮沸。　　二、关于探针的标记　　（一）cRNA探针的同位素标记1．标记液（转录标记）2．转录缓冲液　　※：用地高辛或生物素标记时，用UTP替代。　　3．标记终止液4．标记探针水解液　　先用dH2O悬浮探针，再加入后两种试剂，轻轻振摇混合，于60℃条件下反应。5．探针水解时间　　注：LO－探针初始长度（kb）　　Lf－探针的终长度（kb）　　K－0.11kb/min　　6．探针水解终止液　　每次加入充分混合，临用前配。　　7．探针沉淀液　　每次加入，充分混合，新鲜配制。　　（二）寡聚核苷酸3’端标记（cRNA探针）　　1．标记反应液　　2．终止液：0.2mol/L EDTA　　3.探针沉淀液　　（三）cRNA探针非同位素标记（地高辛及生物素）1．标记液　　△：生物素标记时为10mmol/L的生物素-11-UTP　　※：为检测标记率而加。　　2．转录标记终止液　　（1）0.2mol/L EDTA：用于地高辛标记法　　（2）生物素标记终止液：　　（四）DNA探针标记常用试剂的配制　　（1）10 ×缺口平移缓冲液：200mmol/l Tris-HCl,pH7.4含50mmol/L MgCl2;100mmol/Lβ-巯基乙醇、1mg/ml BSA。　　（2）缺口平移反应终止液：200mmol/L NaCl;10mmol/l Tris-HCl,pH7.4; 11mmol/L EDTA; 0.5% SDS。　　（3）DNaseⅠ:干粉状DNaseⅠ(u/mg)溶于20mmol/l Tris-HCl, pH7.5中（1mg/ml）,10μl分装，-20℃保存一年。　　（4）10×DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）缓冲液：500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L Mg－Cl2;10mmol/L DTT;0.5mg BSA。　　（5）10×激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl2;20mmol/L DTT; 1.0mmol/L亚精胺。　　（6）10×随机引物标记缓冲液；500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/L β-巯基乙醇；500μg/ml BSA。　　（7）1×加尾缓冲液：100mmol/L二甲胂化钾，pH7.0,1mmol/l CoCl2 0.2mmol/L DTT。　　（8）1mol/L MgCl2:MgCl2 47.60g溶于500ml水中，100ml分装，高压灭菌，室温保存。　　（9）0.25mol/L EDTA(Ph8.0):EDTA 52.02g溶于400ml水中，调pH至8.0，加水至500ml，100ml分装，高压灭菌，室温保存。　　（10）4mol/L醋酸钠：取无水醋酸钠82g溶于200ml水中，用醋酸调pH至6.5，加水至250ml，高压灭菌，或0.45μm膜过滤，室温保存。　　（11）10% SDS：10g SDS（十二烷基硫酸钠）溶于50ml水中，加水至100ml，分装后室温保存。　　（12）20×SSC：取NaCl 175.3g;柠檬酸钠88.2g;加水至1000ml，用10mol/l NaOH调pH至7.0；高压灭菌，室温保存。　　（13）无菌水：100ml去离子水或双蒸水，分装，高压灭菌，室温保存，开瓶后仅限一周使用。　　（14）10×激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;100mmol/L MgCl2;50mmol/l DTT;10mmol/L亚精胺（非必需）。　　（15）T4多聚核苷酸激酶：10u/μl，保存在甘油中，-20℃。　　（16）TE缓冲液（Tris/EDTA）：Tris,10mmol/l pH7.4(0.5ml 2mol/L贮存液)，1.0mmol/l ED－TA,pH8.0(20μl 0.5mol/L)贮存液，加水至100ml，室温保存。　　（17）2mol/L Tris-HCl pH7.4:Tris242.2g溶于850ml，加浓HCl 75ml ,边加边缓慢搅动，至pH7.4,于加水至1000ml。　　（18）1mol/L DTT(二硫苏糖醇)：3.0g DTT溶于20ml水中，分装，于-20℃贮存。　　（19）0.5mol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）：在烧杯中先加入300ml水，加入93.5g EDTA－Na2&#O,充分混匀，加10mol/l NaOH调pH至8.0,加水至500ml。　　（20）10mol/L NaOH：200g NaOH溶于450ml水中，混匀，再加水至500ml。　　（21）5mol/L NaCl：292.25g NaCl,加水至1000ml。　　（22）1mol/L HCl：加86.2ml浓盐酸至913.8ml水中。　　（23）1mol/L CaCl2：147g CaCl2：2H2O,溶于1000ml水中,高压灭菌,室温保存。　　三、固定剂　　进行原位杂交的组织或细胞标本常需经固定处理。尽管许多化学物质对组织/细胞有固定作用，但核酸原位杂交的理想固定液应具备如下特点：①能很好地保持组织细胞的状态；②对核酸无抽提、修饰及降解作用；③不改变被检核酸分子在组织细胞内的定位；④对核酸及探针的杂交过程无阻碍作用；⑤固定液本身对杂交信号无遮蔽、掩盖作用，如不使本底增加等；⑥理化性质稳定、价格低廉。　　1．4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA）　　配法：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.0，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml 2×PBS※，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。　　注意：①配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因PFA有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺激作用；②加热时，温度不宜过高，常为60～65℃，否则，PFA降解失效；③配制好的PFA虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，建议尽早使用。　　附：固定液用PBS的配制：　　配法：按上述比例称取试剂，溶于DEPC水（也可用蒸馏水加DEPC）500～800ml中，过滤后，加水定容至1000ml，高压灭菌。通常配制成10×PBS的储备液，2×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获得。　　除用DEPC水配制PFA外，也有用灭菌蒸馏水或经DEPC处理的0.01～0.1mol/L的PBS配制的，方法及注意事项同上。　　4% PFA是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保持组织及细胞内的RNA，同时对形态保持也较好。通常组织块固定4～12h，载片固定时间在10～15min以内，RNA含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。　　2．甲醛　　①10%甲醛（Formaldehyde,FA）　　量取二者充分混合而可。较适于检测RNA的组织及细胞固定，也可用于新鲜冰片切片后固定。　　②10%福尔马林试剂：　　较适于固定细胞。　　③10%中性福尔马林　　市售甲醛　　　　　　　　　　　100ml　　Na2HPO4　　　　　　　　　　　　　　　　4g　　NaH2PO4　　　　　　　　　　　　　　　6.5g　　DEPC水　　　　　　　　　　　～1000ml　　常用于石蜡样品切片的固定。　　10%的甲醛由于有促进DNA双链分子交联的作用，干扰DNA变性，故不适于DNA杂交。在组织或细胞原位杂交中，可通过使用含50%甲酰胺的杂交液使DNA变性解链而解决。这类固定液在DNA/RNA杂交中有较好的效果。　　3．4%戊二醛效果较40%差。　　4．0.1%戊二醛常用于固定组织，适于新鲜组织冰冻切片及石蜡切片的后固定，常用于检测DNA的原位组织杂交方法。　　5．乙醇/醋酸（或冰醋酸）将乙醇与醋酸按3：1的体积比充分混合即可。该液较适于固定细胞的原位杂交，尤其检测DNA时。　　乙醇/醋酸虽广泛应用于原位杂交中，但RNA保留较差，可本底很低，即背景染色淡。　　6．甲醇/醋酸（3：1）用前按体积比3：1比例充分混合即可。　　7．甲醇/丙酮（1：1）适于培养细胞的原位杂交技术。　　8．4%多聚甲醇-0.5%～1%戊二醛溶液在pH7.4磷酸缓冲液中，用于免疫电镜样品固定。　　四、LB培养基　　（一）液体LB培养基（Luria-Bertani培养基）　　配制：取一1000ml的烧杯，将事先称取好的试剂加入杯内，加H2O约500～800ml搅拌使其溶解完全。用5N的NaOH调pH至7.0,加入H2O定容至1000ml。15磅高压灭20min。　　（二）琼脂糖平板培养基　　　细菌培养用琼脂（或琼脂糖）　　　　15g　　液体培养基（如LB）　　　　　　　　～1000ml　　按浓度比例，将琼脂加入液体培养基（如LB）中，稍加搅拌，用纱布或纸封好瓶口，15磅高压灭菌20min。　　五、小量质粒提取主要液体　　1．溶液Ⅰ　　2．溶液Ⅱ　　3．溶液Ⅲ（3mol/L醋酸钠）　　加热溶解后，再用冰醋酸（约40ml）调pH至4.8，补足H2O至200ml。　　六、杂交前处理　　1．蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K） 蛋白酶K主要用于杂交前标本处理，其作用是使组织达到一定消化，利于检测分子的穿透，从而提高检测方法的敏感性，但各种组织在不同条件下消化程度不一，因此，具体应用时，应根据组织种类、温度确定反应时间及酶的浓度。过度消化可使组织形态结构遭到明显破坏，核酸分子也会受到影响。通常是将其配成储备液（1mg/ml），临用前，再配成工作液（约0.025mg/ml）。配制方法：　　精心称药，将二者充分混合后，分装成小份，-20℃存放，用时再取出冻融，余者弃去。　　（2）工作液（临用前配）：　　取储备液（1mg/ml）按1：40稀释，充分混合，即得约含Pro.K为25mg/ml的工作液。　　（3）关于P-K缓冲液的配制：　　称取上述试剂，充分混合即可。　　②1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0)：　　先将Tris于800ml ddH2O中溶解，用HCl将pH调至8.0,ddH2O定溶于1000ml，高压灭菌，室温备用即可。　　③0.5mol/L的EDTA：　　称取EDTA溶于约600ml ddH2O中，常需60℃持续搅拌以助溶，滴加NaOH至pH接近8.0时，EDTA才开始溶解。待完全溶解后，冷却至室温，NaOH调pH至8.0,ddH2O定溶至1000ml，高压灭菌，室温备用。　　2．甘氨酸　　（1）1mol/L甘氨酸：　　称取甘氨酸75g溶于ddH2O或DEPC水中，最后补足ddH2O定容至1000ml，高压灭菌备用。该液为储备液，-20℃储存。　　（2）甘氨酸工作液（0.1mol/L）：　　将二者按1：10比例稀释，即得甘氨酸工作液。一般要求临用前新鲜配制。　　甘氨酸有终止蛋白酶K作用的作用，以防过度消化。　　3．0.25%醋酸-0.25%醋酸酐　　配制：按上述配方，先以少许DEPC水溶解NaCl，然后加入三乙醇胺及浓HCl。DEPC水定容至约1000ml(997.5ml)，临用前，一边摇动溶液一边加入醋酸酐，充分混合。注意操作时避免浓HCl 溅出，最好在通风条件下进行。　　生物体内有些组织，如神经组织中的蛋白质，对带负电荷的核酸探针较易吸附。经该液乙酰化处理后，可使切片标本表现带上负电荷，有排斥带负电的核酸探针，减少非特异吸附，降低反应背景的作用。　　4．RNA酶溶液取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中，分装成小份（1ml,10mg/ml），-20℃储存。　　临用前，取RNA酶A储备液，用2×SSC溶解配成工作液（0.01mg/ml）.　　5.0.2%取2ml Triton X-100加入998ml PBS中，充分振荡使其充分混合。　　七、杂交用液　　1．SSC（Standard Saline Citrate, SSC）　　通常配成10×，20×，的储备液，如下：　　配制：先称取上述两种试剂，溶于约800ml ddH2O中，滴加10N的NaOH，将pH值调至7.0，补足ddH2O至1000ml，加入终浓度为0.1%～0.2%的DEPC，分装后高压灭菌，可室温保存。　　该液主要用于配制予杂交液及杂交后的各种洗脱液，以保持一定的离子强度。此外，在用于杂交的湿盒内也常用5×的SSC以保持一定湿度。　　2．Denhardt’s液　　通常配成10×，50×或100×的储备液　　配制：称取上述试剂，溶于800ml左右灭菌ddH2O中，定容至1000ml后，过滤后于-20℃保存备用。　　该液用于配制杂交液及予杂交液等。　　3．杂交液及予杂交液 　　※：临用前加；△予杂交液不加　　配制：先以去离子甲酰胺与SSC于室温混合，加入硫酸葡聚糖于50℃促溶，依次加入其它成份。硫酸葡聚糖在室温常需数小时才能完全溶解。有时需旋涡振荡。定容后充分混合。根据使用方便可分装（最好用铝箔将瓶子包好）存于4℃，可达数月。注意，杂交缓冲液在使用前切忌污染。　　变性被打断的无关DNA（常为鲑精DNA或鲱精DNA）可在予杂交及杂交前加入。此外，有许多物质如肝素、多聚腺甘酸、醋酸钠等多种成份，可根据需要加入杂交液中，上述配方所列只是不可缺少的基本成份。　　配制好的杂交液不宜反复冻融，否则易产生硫酸葡聚糖沉淀现象。使用前最好加热至50℃，使其充分溶解后再加入探针分子。至于探针的浓度视实验目的、探针类型及标记方法而异。通常RNA探针分子浓度为0.5～2μg/ml，DNA探针浓度为1μg/ml,此外，如使用35S标记的探针，还需加入终浓度为100mmol/L的二硫苏糖醇（Dithiothreitol,DTT）至杂交液及杂交后的洗脱液中。　　八、杂交后漂洗溶液　　无论用何种标记方法及何种信号显示方法，在杂交后洗脱则是大同小异。在此，归纳几种带有共同性及常用的洗脱液。　　该液常用于杂交后的初次洗脱，故离子强度（张力）较高。　　该液常用于杂交后的第二次洗脱，离子强度较低，经过上述两套洗脱液洗后，有的还可用2×SSC，10%（0.1%）SDS洗脱。　　　　主要是洗去残留的RNA，降低背景。用于以RNA为探针的原位杂交方法中。　　4．Dig标记探针杂交后处理液　　用ddH2O溶液并定容至1000ml。　　用ddH2O溶解并定容至1000ml。　　配制同上。　　左旋咪唑有消除内源性磷酸酶的作用。　　九、原位杂交信号显示　　目前应用原位杂交方法中，信号的显示主要有放射自显影，酶底物及免疫金银等方法，在此归纳有关的主要试剂。　　1．A-B显影液　　称取上述试剂，按配方分别溶于50ml ddH2O中，于显影前，在室温将两者（A液及B液）按1：1混合，稍加摇动促进混合，即可将贴有切片标本的切片放入显影液，于室温避光（可暗室）反应5～15min。显影时间和温度相关，需自己根据情况摸索。终止反应只需将显影液倒出，自来水冲洗即可。倒出的AB显影液可暂时不扔，光镜下观察，若明显显影不够，还可重新或继续显影。AB显影液要求临用前配制，在显影时才将AB二液混合。否则，A液过久会产生黄色沉淀，增加背景。　　AB液用于免疫金银法中，使金标记颗粒信号放大，形成棕黑色沉淀。　　2．DAB-H2O显色液　　　　该液用于标本被标记上辣根过氧化物酶（HRP）的方法。产物为棕黄色。　　3．NBT-BCIP显色液　　　该液用于有碱性磷酸酶标记物的方法中。产物为紫蓝色。　　4．Kodak D-19显影液　　配制：先将500ml水中加温50℃，按上述配方顺序加药，同时充分搅拌，每加一种药完全溶解后，再加另一种药品，否则，所配的显影液易产生混浊而效果差，最后补足水至1000ml充分混合，室温或4℃避光保存。最好包上纸。　　该液用于放射自显影时的显影。　　5．Kodak F-5定影液（酸性坚膜定影液）　　※：28%醋酸为3份冰醋酸和8份水混合液。荧光显微镜标本制作要求　　（一）载玻片　　载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的玻片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。　　（二）盖玻片　　盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光女可激发标本。　　（三）标本　　组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重叠或杂质掩盖，影响判断。　　（四）封裱剂&&　　封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。　　（五）镜油　　一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。　　三、使用荧光显微镜的注意事项　　（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。　　（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。　　（3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。　　（4）检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h。　　（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。　　（6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。　　（7）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”—无或可见微弱荧光。“+”—仅能见明确可见的荧光。“++”—可见有明亮的荧光。“+++”—可见耀眼的荧光。　　四、荧光图像的记录方法　　荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将二者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标，即凭工作者目力观察。作为一般定性观察，基本上可靠的。随着技术科学的发展，在不同程度上采用客观指标记录判断结果，如用细胞分光光度计，图像分析仪等仪器。但这些仪器记录的结果，也必须结合主观的判断。　　荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时摄影记录结果。方法与普通显微摄影技术基本相同。只是需要采用高速感光胶片如ASA200以上。因紫外光对荧光猝灭作用大，如FITC的标记物，在紫外光下照射30s，荧光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微摄影系统装置。流式细胞仪器的操作和使用：　　①打开电源，对系统进行预热；　　②打开气体阀，调节压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；　　③在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；　　④利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，0。和90。散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小；　　⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程；　　⑥样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统；　　⑦因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量更大），因此可关闭气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理；　　⑧将所需结果打印出来。　　在操作和使用中一定要注意如下事项：　　　1）光电倍增管要求稳定的工作条件，暴露在较强的光线下以后，需要较长时间的“暗适应”以消除或降低部分暗电流本底才能工作；另外还要注意磁屏蔽；　　2）光源不得在短时间内（一般要1h左右）关上又打开；使用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常；　　3）液流系统必需随时保持液流畅通，避免气泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要经过过滤、消毒；　　4）注意根据测量对象的变换选用合适的滤片系统、放大器的类型等；5）特别强度每次测量都需要对照组核糖核酸酶保护分析原理：核糖核酸酶保护分析（Ribonuclease Protection Assay，RPA）是一种通量更高，各项指标均优于传统Northern Bloting的mRNA定量检测技术。利用32P-（放射法）或生物素（非放法）标记由多个目标基因的DNA模板体外转录出的长短不一的反义RNA探针，将含过量探针的溶液与样品总RNA杂交，经核糖核酸酶（RNase）处理后，未与探针杂交的单链RNA和过量的游离探针被降解，而目标RNA则因与探针结合形成双链而被‘保护’，则杂交双链RNA的量代表了样本中相应基因的表达量。检测时： 对于放射性RPA，杂交双链进行变性聚丙酰胺凝胶电泳，用放射自显影或磷屏成像系统检测被保护的探针的信号。 对于非放的RPA，杂交双链经过变性聚丙酰胺凝胶电泳后电转移至尼龙膜，UV照射使被保护的RNA探针与膜交联而固定，再用试剂盒提供的链霉亲和素－辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合，这样，再将膜放入暗盒中暴露于X射线胶片或者用CCD照相机检测杂交探针的信号。 根据适当大小的探针片断的信号强度来定量待测样本中该探针RNA代表的基因表达水平。进行RPA/NPA的实验流程： RPA set（即：模板组）提供用于下列研究的相关基因模板：细胞因子、趋化因子、细胞因子受体、细胞表面抗原、凋亡相关、细胞周期调节因子、血管生成相关、细胞毒性、DNA修复、T细胞受体等，适用于人、大鼠、小鼠、猪等物种。还提供多探针RPA的对照RNA。用TBD多探针RPA产品，您就可以…… 从一个总RNA样本中同时定量分析多种不同的mRNA 能比较分析同一样本中不同基因的表达水平 通过管家基因，能比较不同样本中某种mRNA的水平高特异性和灵敏度，准确适用于从培养细胞和冰冻组织按标准操作提取的总RNA，无需纯化 除放射性RPA外，还有通过非放射性的生物素标记的探针 TBD提供的客户订制模板服务：如欲咨询模板订制业务的技术及产品价格，请联系：TBD用户产品&服务E-mail： 或致电灏洋公司022－9)，也可与我公司各地代理商联系。实验结果实例：NPA结果示例（细胞因子多探针模板组）图1：对不同细胞群来源的RNA样品用小鼠 mCK-1b, mCK-2b, mCK-3b多探针模板组进行非放射性的RPA的照片。 RPA结果示例（凋亡多探针模板组）图2：对不同细胞群来源的RNA样品用人 hAPO-1b, hAPO-1c多探针模板组进行放射性的RPA的放射自显影照片。Autoradiograms of protection assays utilizing hAPO-1b and hAPO-1c Multi-Probe Template Sets with RNA samples from various cell populations 推荐杂用干液【NaCl】 5M: 292.2g NaCl加入至终体积 100ml .【NaOH】 10M: (小心操作)200g NaOH溶于450ml水中, 混匀加水至500ml.【TCA】 (三氯乙酸) 贮存液, 10%; 加227ml水到含500g TCA的瓶中, 这是10%的TCA, 用时稀释到10%.【MgCl2】 1M 20.3 g MaCl2&#O 加水至终体积100ml, 高压蒸气灭菌.【MgSO4】 1M:24.6g MgSO4&#O , 加水至终体积100ml, 高压蒸气灭菌.【1M的CaCl2】 147g CaCl2•H2O, 溶于1L水中, 高压灭菌室温保存.【1M DTT(二硫苏糖醇)】 3.09g溶于20ml水中分装,-20℃贮存.【0.5M EDTA】 93.5g EDTA-Na2•H2O, 充分混匀, 加10N.NaOH, 调pH至8.0加水至500ml.【10M醋酸胺】 醋酸胺385.4g与150ml水混合,定溶到总体积500ml.
【10%SDS(十二烷基硫酸钠)】: SDS 100g加水1L密封保存.【SS-酚(盐饱和酚)】 2M Tris pH7.4
β-巯基乙醇
8-羟基喹啉
分装保存,室温下将酚层在通风橱内合并;抽提时用黄色的酚溶液.
注意: 在贮存瓶中酚在上层,很易取到;当用于抽提时,SS-酚肯定在底层.【10%溴酚蓝】 5g溴酚蓝溶于50ml水中,室温保存.【10mg/ml的溴乙锭溶液】: 用于观察DNA在250-310nm激活时能发生荧光,分子量394.32加0.2g溴乙锭到20ml水中,充分混匀,于4℃避光保存.【鲑鱼精子DNA】 (或称鲱鱼精子DNA)
10mg/ml溶于水,也可保存2和5mg/ml贮存液.用干净的剪刀剪下所要的数量,然后将溶液挤压流过23号针头加以剪切,4℃贮存(Sigma DNA钠盐鲑鱼精卵,Ⅲ型).【去离子甲酰胺】 将50ml甲酰胺加到5g混合床树脂中(例如Bio-Rad AG 501-X8).于4℃混合搅拌,然后用Whatman No1滤纸过滤两次,分装,-20℃贮存.【100mMIPTG】 IPTG (异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)23.8mg IPTG溶于1ml水中.【100×Denhart溶液】 10g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)
10g牛血清白蛋白(BSA)
10g水溶性聚蔗糖400(Ficoll)
加水至500ml,过滤灭菌,4℃贮存,用前摇匀【HEPES】
用总量为90ml的蒸馏水,溶解1.6g NaCl﹑0.074g KCL﹑0.037g Na2HPO4•H2O﹑0.2g葡聚糖和1g HEPES,用0.5 NaOH调pH至7.05,再用蒸馏水定溶至100ml,用0.22um滤器过滤除菌,分装成小分,-20℃贮存.【Tris×-100】 1%/ml Triton加99ml水. 【酵母tRNA】
10mg/ml:10mg溶于水;分装于1.5ml小管中,-20℃贮存(用作DNA或RNA沉淀时的携带者).【Xgal溶液】 (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)10%;100mg溶于1ml二甲苯甲酰胺(DMF)中.【二甲苯蓝】 10%:5g二甲苯蓝加水至5ml,溶解,分装.推荐常用缓冲液【TE】 pH7.4
10mM Tris•Cl (pH7.4)
1mM EDTA (pH8.0)
10mM Tris•Cl (pH7.6)
1mM EDTA (pH8.0)
10mM Tris•Cl (pH8.0)
1mM EDTA (pH8.0)【Tris】 2M pH7.4
小心缓慢HCL,不断搅拌至pH7.4
1L【TES】 配100ml
Tris 20mM pH7.4
1.0ml 2M 贮存液EDTA.Na2, 0.1mM
20.0ul 0.5M 贮存液NaCl 10mM
0.2ml 5M 贮存液【TMG】 100ml
10mM Tris pH7.4
0.5ml 2M 贮存液
10mM MgSO4
1.0mM 1M 贮存液
0.01%白明胶
100.0ml【STE】 (TEN)
10mM Tris•Cl (pH8.4)
1mM EDTA(pH8.0)【STET】
10mM Tris•Cl (pH8.0)
1mM EDTA(pH8.0)
5% Triton×-100【TNT】
10mM Tris•Cl (pH8.0)
150mM NaCl
0.05% Tween 20【SSC】 10×
柠檬酸三钠. H2O 0.3M
1M HCL调pH至7.0加水到1L【SSPE】 20×配1L
Na2HPO4&#.2M
EDTA-Na2 0.02M
加40ml 0.5M EDTA 贮存液
用10N NaOH 调pH至7.4加水至1L【TBE】 20×配1L
Tris Base 1M
EDTA-Na2.2&#mM
1L1.&&分子克隆中使用的试剂与常用缓冲液的配制①&&常用缓冲液的pKa值缓冲液&&分子量&&pKa值&&缓冲范围TrisaHEPESbMOPScPIPESdMESe&&121.1283.3209.3304.3195.2&&8.07.477.156.766.09&&7.1-7.97.2-8.26.6-7.86.2-7.35.4-6.8a: 三羟甲基氨基甲烷 b: N-2-羟乙基哌嗪-Nˊ-2-乙磺酸c: 3-(N-马啉代) 丙磺酸 d: N,Nˊ-双（2-乙磺酸）哌嗪e: 2-(N-马啉代) 乙磺酸②&&各种pH值的Tris缓冲液的配制所需pH值（25℃）&&0.1M HCL的体积7.107.207.307.407.507.607.707.807.908.008.108.208.308.408.508.608.708.808.90&&45.744.743.442.040.338.536.634.532.029.226.222.919.917.214.712.410.38.57.02. 20×SSC缓冲液：成分&&配1L&&配4LNaCl 3M柠檬酸三钠&#O，0.3M1M HCL调至7.0加水至&&175.3g88.2g800ml&&701.2g352.9g3200ml3.&&磷酸缓冲液25℃下0.1M磷酸钾和磷酸钠缓冲液的配制pH&&1M K2HPO4(ml)/1M Na2HPO4(ml)&&1M KH2PO4(ml)/1M NaH2PO4(ml)Z5.86.06.26.46.66.87.07.27.47.67.88.0&&8.5/7.913.2/12.019.2/17.827.8/25.538.1/35.249.7/46.361.5/57.771.7/68.480.2/77.486.6/84.590.8/89.694.0/93.2&&91.5/92.186.8/88.080.8/82.272.2/74.561.9/64.850.3/53.738.5/42.328.3/31.619.8/22.613.4/15.59.2/10.46.0/6.8配法：用蒸馏水将混合的两种1mol/l贮存液稀释至100ml4.&&电泳缓冲液① 测序凝胶加样缓冲液98%&&去离子甲酰胺10mM&&EDTA0.025%&&二甲苯青FF0.025%&&溴酚蓝甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合要求，无须再进行处理，不过一旦略呈黄色，则应在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理，并用Whatman 1号滤纸}