关注今日：16 | 主题：409061
微信扫一扫
【求助】制备抗体柱子来纯化抗原
页码直达：
这个帖子发布于8年零323天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
想用一种填料偶联抗体，然后再纯化细胞培裂解液或者细胞分泌上清中的抗原蛋白。因为是第一次接触，没有经验，也差了些资料，但还是有些不明白，所以想请教一下各位高手：第一：柱子：用溴化氰活化的sepharose 4B呢还是其他的？第二：怎么选择最佳的抗体偶联量？第三：抗原洗脱条件要根据什么来摸索?第四：整个实验过程还应该注意什么操作？大家谁有比较完整的方法，请给于帮助，多谢多谢了！
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
收起全部有料回复
[quoteskykiller wrote:&叶一凡 wrote:& &你好，你是不是做过抗体亲和柱纯化抗原？& & 是啊，做过多种，有成功的，也有失败的。呵呵，那一定经验丰富。我现在准备做，很没头绪。能不能跟我详细说说怎么做？ 1、前面Chromatography已说过了，偶联看说明书。2、最佳偶联量无法预测，只有一个个的试。一般用5-10mg/ml，但也有例外，我做的一种抗体柱就是1mg/ml最好。如果抗体经特异性的抗原柱纯化过，偶联量可以少一点。3、抗体柱纯化抗原与抗原的性质关系很大，所以要根据抗原来选择洗脱方法。低pH是最常用，也是最方便的洗脱方法。但如果抗原在低pH下不稳定或易沉淀（很多大肠杆菌表达的基因工程蛋白在低pH时易沉淀），可以试试2-3M的KSCN、NaSCN，或NaCO3溶液，有时候也可以尝试一下低浓度的有机溶剂洗脱，如10-30%的乙二醇，低浓度的尿素也可以尝试。3、抗体柱的使用寿命肯定没有离子交换柱、Ni柱等长，这和抗体柱不能彻底再生以及抗体活性丧失有关。没法预测，只有一次次的做，发现吸附能力明显下降就不用了。4、抗体的选择有人说不能选择亲和力很高的，应该选择中等亲和力的。这我觉得难以下结论，我曾经为纯化一种抗原，偶联过14种不同的单抗柱，没有规律可循。我想应该和抗原抗体的结合方式有关，但这方面我们无法得知。5、抗体柱纯化抗原就是在吸附率和洗脱率之间取得一个平衡。吸附好的抗体柱不一定洗脱率高，洗脱率高的不一定吸附率高。自己摸索吧，祝好运！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
Coupling Ig to CNBr activated SepharoseReagents needed:•&&CNBr activated sepharose (1 g makes ~3.5 ml) from Pharmacia•&&Purified antibody (needs to be very pure and between 1 and 4 mg/ml), dialyzed against coupling buffer•&&Coupling buffer, pH 9.00.1 M NaHCO3&&0.5 M NaCl•&&Blocking buffer, pH 8.0 (make fresh just before use)1 M ethanolamine in coupling buffer (sterile filtered)&&or 1 M Tris-Base, pH 9.0 in coupling buffer (sterile filtered)•&&1 mM HCl, sterile-filtered•&&Low pH Wash&&0.1 M acetic acid&&0.5 M NaCl1)&&Take an OD280 reading of the antibody solution2)&&Swell CNBr Sepharose beads in 1 mM HCl for ~15 min. at room temp.3)&&Transfer gel to sintered glass funnel and wash with 200 ml of 1 mM HCla)&&Be prepared to do the next 2 steps immediately -- there cannot be any pausing in the protocol between steps 4 and 54)&&Wash gel with 5 ml coupling buffer5)&&Using a clean spatula, immediately transfer gel to tube containing antibody solution after the coupling buffer has passed through the gela)&&the ratio of antibody to gel is dependent upon the antigen size.
If the antigen to be purified is large, then you should decrease the amount of antibody used (try ~4 mg antibody/0.286 g gel for 100 kD antigen) and vice versa.
For antigens of ~60 kD, use 6 mg antibody/0.286 g gel.
Also, you can add some tris (or any free amine group) to the antibody solution when coupling low concentrations of antibody to maintain a more uniform coupling of antibody across the bead surface. 0.286 g of gel will swell to approximately 1 ml volume when hydrated.6)&&Rotate tube genetly at room temp. for 2 hours7)&&Spin down beads (tabel-top centrifuge, 2000 rpm for 1 min) and take OD280 of supernatantsa)&&if OD280 is at least 10-fold lower than in Step 1, continue with procedureb)&&if OD280 is not at least 10-fold lower than in Step 1, coupling did not proceed as expectedi)&&this is most commonly caused by not transferring the gel to the antibody solution quickly enough in Step 5c)&&when coupling large amounts of antibody/ml of gel, the OD280 reading may be 3-fold lower instead of 10-fold lower8)&&Wash coupled beads 3x with coupling buffer9)&&Aspirate coupling buffer from beads and incubate with blocking buffer for 2 hr at room temp.10)&&Wash beads 4x, alternating between low pH wash buffer and coupling buffer (2x low pH and 2x coupling buffer) and checking OD280 of first and fourth supernatants (OD280 readings should be minimal ~0.01 or lower)11)&&Pour gel into column (careful - no bubbles in the column!) and wash with 5 column volumes of either sterile-filtered lysis buffer or sterile-filtered PBS-azide12)&&Store column in sterile-filtered PBS-azide看看这个能否有用
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
1.可以.也可选择NHS活化的.2.单抗需要5mg/ml 多抗10mg/ml.3,通常免疫亲和是高pH7-8吸附,低pH2.5左右洗脱.4.不是很难,仔细看说明书或问技术支持即可.也可看一些相关的实验书，通常写的很清楚.
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园【图文】第三章 抗体的制备与纯化技术_百度文库
赠送免券下载特权
10W篇文档免费专享
部分付费文档8折起
每天抽奖多种福利
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
第三章 抗体的制备与纯化技术
阅读已结束，下载本文到电脑
想免费下载本文？
登录百度文库，专享文档复制特权，积分每天免费拿！
你可能喜欢周热销排行
用户评论（0）
在此可输入您对该资料的评论~
添加成功至
资料评价：抗体洗脱液原理【索莱宝吧】_百度贴吧
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&签到排名：今日本吧第个签到，本吧因你更精彩，明天继续来努力！
本吧签到人数：0可签7级以上的吧50个
本月漏签0次！成为超级会员，赠送8张补签卡连续签到：天&&累计签到：天超级会员单次开通12个月以上，赠送连续签到卡3张
关注：969贴子：
抗体洗脱液原理
日益增长的抗体使用，研究目的蛋白种类一日千里，那么膜的再使用能够节约研究时间，推进研究进程，在不影响实验准确的前提下，那么在使用的意义是很明显的。现在这里我来讲一下抗体洗脱液--stripping buffer。在介绍抗体洗脱液的原理前，先来看看抗原抗体结合的一些环境条件吧，通常我们的抗体稀释液选择是：TBST和PBST，这里的两种抗体稀释液的pH值均在7.4-7.8之间。那么问题就来了，为什么抗体稀释液的pH值是这样的呢？抗原抗体的结合反应：抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原决定簇(表位)与抗体超变区的 沟槽分子表面的结构互性与亲合性而结合的。一、抗原抗体的结合力抗原抗体间结合为非共价键结合：静电引力、范登华引力、氢键结合力、疏水作用力二、抗原抗体的亲合性和亲合力亲合性是指抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原表位之间相互适 应而存在的引力，由于抗原抗体的结合 反应是可逆的，若抗体的亲合力高，与抗原分子结合牢固，不易解离；反 之即容易解离。三、亲水胶体转化为疏水胶体大多数抗原为蛋白质，抗体是球蛋白，它们溶解在水中皆为胶 体溶液，不会发生自然沉淀。当抗原抗体结合后，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。再加入电解质，如 NaCl，则进一步使疏水胶体物相互靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。那么我们破坏这些中作用力，就能是抗原抗体复合物解离。抗体洗脱液的原理就是利用强酸环境下，破坏结合力等因素，使得抗原抗体复合物变成抗原抗体单体。说道这里，我想大家了解了stripping buffer的作用原理了吧！（本文转自索莱宝：）
贴吧热议榜
使用签名档&&
保存至快速回贴抗原抗体_百度百科
清除历史记录关闭
声明：百科词条人人可编辑，词条创建和修改均免费，绝不存在官方及代理商付费代编，请勿上当受骗。
抗体： 机体在刺激下，由分化成的所产生的、可与相应抗原抗体抗原发生特异性结合反应的。因为最初有人用电泳证明血清中抗体活性在γ球蛋白部分，故曾把抗体统称为两种(γ)球蛋白。后来证明，抗体并不都在γ区；而且位于γ区的球蛋白，也不一定都具有抗体活性。1964年，举行专门会议，将具有抗体活性以及与抗体相关的球蛋白统称为免疫球蛋白(Ig)。如，、等患者血清中存在的异常免疫球蛋白以及“正常人”天然存在的免疫球蛋白亚单位等。因而免疫球蛋白是结构及化学的概念，而抗体是生物学及功能的概念。可以说，所有抗体都是，但并非所有免疫球蛋白都是抗体。
抗原抗体生物活性
(1)结合特异性抗原：抗体与其他分子区别，就在于抗体能与相应抗原发生结合，在体内导致生理或病理效应；在体外产生各种直接或间接的可见的抗原抗体结合反应。抗体是靠其分子上的特殊的结合部位与抗原结合的。
(2)激活：抗体与相应抗原结合后，借助暴露的点去激活、激发补体的溶菌、溶细胞等免疫作用。
(3)结合细胞：不同类别的免疫球蛋白，可结合不同种的细胞，产生不同的疚，参与免疫应答。
(4)可通过胎盘及粘膜：(IgG)能通过胎盘进入胎儿血流中，使胎儿形成。(IgA)可通过消化道及呼吸道粘膜，是粘膜局部的主要因素。
(5)具有：抗体分子是一种蛋白质，也具有刺激机体产生免疫应答的性能。不同的分子，各具有不同的抗原性。
(6)抗体对的抵抗力与一般球蛋白相同：不耐热，60～70℃即被破坏。各种酶及能使蛋白质凝固变性的物质，均能破坏抗体的作用。抗体可被中性盐类沉淀。在生产上常可用或从中沉淀出含有抗体的球蛋白，再经将其纯化
抗原抗体抗体结构
抗体是具有4条多的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的(L链)。链间由和非联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。轻链有κ和λ两种，重链有μ、δ、γ、ε和α五种。 bio.jewelove.net 整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。可变区位于&Y&的两臂末端。在可变区内有一小部分变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称。高变区位于分子表面，最多由17个氨基酸残基构成，少则只有2 ～ 3个。高变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原。一个抗体分子上的两个抗原结合部位是相同的，位于两臂末端称抗原结合片段)。&Y&的柄部称结晶片段，糖结合在FC 上。
抗原抗体抗体基因重排
抗体的L链是由C、V、J三个编码的，H链由C、V、D、J四个基因簇编码的。V是编码可变区，有300个种类；D编码,有15 ～ 20个种类；J编码连接V、C的结合区，有4～5个种类；C编码恒定区，仅有一种。这些通过多种多样的重排，所合成出的肽链，还要再进一步进行L和H链组合，这样最后生成的抗体种类就非常多了。抗体是发生在分化的时候。
抗原抗体单克隆抗体
(monoclonal antibody，)：在与抗原接触前就已经存在多种多样的与抗原专一性结合的受体，一种细胞带一种受体，进入机体的抗原选择性的结合其中的个别淋巴细胞，使之活化，增殖产生大量带有同样受体的细胞群，分泌同样的抗体。 bio.jewelove.net 当抗原进入体内，在机体中就会诱导出针对不同的多种抗体，如果要把这些抗体一一分开，用现有的生物化学或物理化学方法是根本办不到的。1975年科勒(Koehller)和米尔斯坦(Milstein)将小鼠免疫细胞与肿瘤细胞融合，培养出既能迅速生长繁殖又可分泌特异性抗体的。从而获得针对某一特殊抗原决定簇的单克隆抗体。
抗原抗体抗体的功能
抗体的主要功能从而有效地清除侵入机体内的微生物、寄生虫等异物，中和它们所释放的毒素或清除某些，使机体保持正常平衡，但有时也会对机体造成病理性损害，如、、等一些自身抗体的产生，对人体可造成危害。
抗原抗体抗体规律
(1)初次反应产生抗体：当抗原第一次进入机体时，需经一定的潜伏期才能产生抗体，且抗体产生的量也不多，在体内维持的时间也较短。
(2)再次反应产生抗体：当相同抗原第二次进入机体后，开始时，由于原有抗体中的一部分与再次进入的抗原结合，可使原有抗体量略为降低。随后，迅速大量增加，可比初次反应产生的多几倍到几十倍，在体内留存的时间亦较长。
(3)回忆反应产生抗体：由抗原刺激机体产生的抗体，经过一定时间后可逐渐消失。此时若再次接触抗原，可使已消失的抗体快速上升。如再次刺激机体的抗原与初次相同，则称为特异性回忆反应；若与初次反应不同，则称为非特异性回忆反应。非特异性回忆反应引起的抗体的上升是暂时性的，短时间内即很快下降。
抗原抗体抗体的分类
(1)按作用对象，可将其分为、抗菌抗体、抗病毒抗体和亲细胞抗体(能与细胞结合的，如1型变态反应中的lgE抗体，能吸附在靶细胞膜上)。
(2)按理化性质和生物学功能，可将其分为IgG、IgA、IgM、IgE、IgD五类。
(3)按与抗原结合后是否出现可见反应，可将其分为：在介质参与下出现可见结合反应的完全抗体，即通常所说的抗体，以及不出现可见反应，但能阻抑抗原与其相应的完全抗体结合的。
(4)按抗体的来源，可将其分为和
清除历史记录关闭}