转染细胞表达蛋白多长时间表达量最大(表达蛋白,表达量,转染细胞,转染) - DNA技术 - 生物秀
标题: 转染细胞表达蛋白多长时间表达量最大(表达蛋白,表达量,转染细胞,转染)
摘要: [转染细胞表达蛋白多长时间表达量最大(表达蛋白,表达量,转染细胞,转染)] 转染质粒表达蛋白，是转染后大约48小时表达量最大吗？不同载体，不同细胞，不同蛋白是否有较大差异？谢谢！ 关键词:[表达蛋白 表达量 转染细胞 转染 蛋白 载体 质粒]……
转染质粒表达蛋白，是转染后大约48小时表达量最大吗？不同载体，不同细胞，不同蛋白是否有较大差异？谢谢！
回复楼主可以在24、48、72h各做一次蛋白检测，有文章说48、72h的蛋白表达量都比24h的大，不同细胞系、不同载体、不同蛋白的表达量的时间点差别肯定有的，这要你去摸索转染的最佳条件回复长一点吧72h
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&如何实现质粒的稳定转染？
如何实现质粒的稳定转染？
作者 flybirdfly
小虫现需要将一仅带有氨苄西林霉素基因的质粒稳定转染293T细胞，不知使用何种方法。有文献中是这样做的：将该质粒与pCDNA3以4:1的比例共转染（因为pCDNA3中含有neomycin的基因），然后就可以用G418筛选出稳转的细胞株。另有人说建议用Linear Selection Marker，如Linear Puromycin Marker，使具有嘌呤霉素抗性，然后用抗性培养基多次筛选。我想问一下这两种方法哪个更靠谱一点？请各位虫友不吝赐教
共转pCDNA 3.1是可以的，原则上pCDNA 3.1转染进了，你的目的基因也应该转染了，第二种没做过，但是也是用抗性筛选的吧
看看质粒的真核筛选基因，一般是neo抗性就用G418筛选
都可以，以前实验室常用G418，效果不错。
给你的目的基因换一个稳定表达的载体吧。感觉pCDNA3.1做瞬时转染效果很好，但做稳定转染不是很稳定。个人更喜欢Puromycin作为抗性筛选。
想问一下。。。筛选抗性所用G418 的浓度是多少？？
带有neo基因可以进行，然后利用MTX加压筛选不断一轮一轮的筛选最终也能够进行，我们经常用第二种方式，时间持续较长得到的稳转株也能够实现稳定高表达的生产，可以根据你的情况或时间啊选择一种更合适的。楼上有的说做瞬时转染好，其实也是啊，如果你还没有做过瞬转的话可以先做瞬转看看你的目的基因表达出来的东西性能怎样是不是符合要求，因为瞬时转染生产少量的蛋白满足检测如果后续你需要大量的生产在考虑构建稳定细胞系，比较筛选稳转株需要长时间，要是已经做过就不需要考虑了，
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标题: 三种质粒怎么共转染(质粒,共转染,转染,蛋白)
摘要: [三种质粒怎么共转染(质粒,共转染,转染,蛋白)] 我研究某蛋白对某启动子的影响。需要同时将三种质粒（包括内参、启动子、调控蛋白质粒）共转染到细胞中。试了好多次，转染效率都不高。内参质粒常常测不出东西来。请问各位高手，什么转染剂转三种质粒比较容易？转染三种质粒有什么窍门吗？我用过威格拉斯的转染剂，也用过lipofectime 2000，也用过PEI，效果都不好。在MCF7和Hale细胞中效果都不好。郁闷ing 关键词:[质粒 转染 共转染 蛋白 内参 启动子]……
我研究某蛋白对某启动子的影响。需要同时将三种质粒（包括内参、启动子、调控蛋白质粒）共转染到细胞中。试了好多次，转染效率都不高。内参质粒常常测不出东西来。请问各位高手，什么转染剂转三种质粒比较容易？转染三种质粒有什么窍门吗？我用过威格拉斯的转染剂，也用过lipofectime 2000，也用过PEI，效果都不好。在MCF7和Hale细胞中效果都不好。郁闷ing
回复It is difficult to do co-transfection with more than 2 vectors, since not only transfection efficiency will be a problem, co-transfection efficiency ( percentage of cells transfected by all vectors) will also cause serious trouble.My suggestion is to use a cell line that has high transfection efficiency, such as CHO, 293, or 293T cells, if your experiment allows use of such cell lines. 293T cell is the most easy to transfect cell line I have ever used. Some times the transfection efficiency can go over 90%.Also if expression of one of the vector is too weak, try to increase the percentage of this vector in the tranfection mixture, that certainly will help.I would also suggest first do transfections with each of the vectors alone, make sure that they can be transfected well individually. Because the quality of the vector (correct sequence, correct concentration, high purity etc), can have a direct effect on the expressing of the respective gene.Good luck回复谢谢。我试试293细胞吧
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电话：021-转染6孔板后，怎么收集我的细胞，然后提蛋白_百度知道
转染6孔板后，怎么收集我的细胞，然后提蛋白
我有更好的答案
沉淀重悬于PBS中洗涤转染6孔板后，一般长到十的六次方级别就可以提蛋白了可以用移液器将细胞吸出来并高速离心，裂解后离心收集上清，接着就可以裂解提取蛋白了。可以用超声，酶解等等
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【求助】质粒转染的具体步骤
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这个帖子发布于9年零225天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请教哪位高手有质粒转染细胞的1.试剂2.仪器3.操作步骤，我想做这步却找不到实验步骤，多谢啦！
不知道邀请谁？试试他们
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希望这个对你有用：以Invitrogen的Lipofectamine 2000为例，需要注意以下几点：1、DNA的量：Lipofectamine ~32、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。步骤如下：以24孔培养板为例1、转染前一天细胞换新的培养基2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；c、将a+b的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。加入G418的量最好设几个梯度或者转染前做MTT，找好G418对你所转细胞致死量的浓度。5、等细胞在G418作用下，长满后冻存几支（保种）。再克隆化培养：将细胞消化后计数50个细胞，加入22ml完全培养基中，混匀，分装在96孔板中（200ul/孔）。第二天在显微镜下，寻找孔中有单个细胞的孔并做标记，等做标记的孔长满后，消化、转移到4孔或6孔培养板中，最后转移到培养瓶中培养，冻存，鉴定。6、鉴定成功后，建议马上做后续实验，因为在培养过程或冻存中，转进去的基因容易从细胞中掉下来。
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额，我们实验室之前一直用的是lip2000，后来不怎什么时候，在冰箱里看到了一支诺唯赞的，就试了一下，转染效率很高啊，后来就一直在用了。具体的操作方法是按照他们的说明书来的，大致如下： A.细胞接种：转染前24小时左右对细胞进行转接，接种密度约为0.3～1 × 105 cells/well。过夜培养。B.ExFect(R) /DNA复合物包装 (该步完成后应立即转染)：
在1.5 ml无菌离心管中加入50 μl无血清培养基，并添加适量的转染试剂(2～5 μl/μg DNA, 参见表 一)。c 用移液器轻轻混匀后在室温静置5～10分钟。 在1.5 ml无菌离心管中加入50 μl无血清培养基，并添加适量的DNA (0.8～1 μg DNA/孔, 参见表一)。用 移液器轻轻混匀后在室温静置5～10分钟。 将ExFect(R) -培养基混合物滴加至DNA-培养基混合物中，用移液器轻轻混匀后在室温静置15～20 分钟后，立即转染。注意：ExFect(R)-培养基混合物和DNA-培养基混合物的混合次序非常重要，切勿 颠倒。 转染 注意：ExFect(R)在完全培养基中(基础培养基中添加血清)具有最高的转染效率，因此转染前后不需要 换成无血清培养基。 C.转染 如特殊情况，可在转染开始之前更换新鲜的含血清培养基，以防转染后孵育阶段细胞密度太大、 营养不足导致的细胞死亡。 将步骤B制备的复合物滴加至培养基中。轻轻晃动培养皿以使复合物均匀分布。 过夜培养24～48小时。 注意：如果转染后需要更换新鲜培养基，请于加入ExFect(R) /DNA复合物12～24小时后进行。培养基更换后，孵育24～48小时后再进行后续试验。收获细胞，进行后续实验。注意事项： 因细胞密度随细胞系不同会有很大差别，且细胞密度直接决定转染效率。因此请在转染过程中尽量 保持同样的接种比例，以提高转染重复性。多数哺乳动物细胞应在37℃、5% CO2条件下培养。其他的一些细胞系，例如昆虫细胞，需要在不 同的温度和CO2浓度下进行培养。请根据具体细胞系选择最适培养条件。应避免包装反应体系中存在血清，因血清会干扰ExFect(R)与DNA形成复合物。 如果转染DNA量较大或者当复合物包装时反应体系中出现沉淀，请将包装反应体系调整至1 ml进行。
以上。楼主可以参考一下。
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ALICE的孤独星球 编辑于
4、质粒DNA和其他包装质粒共转染293T细胞产生病毒（即病毒包装）4.1名词解释4.1.1293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系,
被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。4.1.2脂质体：某些细胞质中的天然脂质小体，可作为生物膜，用于捕获外源性物质后更有效地运送到靶细胞，经同细胞融合而释放。4.2共转染的操作步骤第一天：用无抗生素DMEM+10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度第二天：1. 500ul 无血清培养基稀释2ug 表达质粒+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2.G2. 500ul 无血清培养基稀释15ul 脂质体20003. 5min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止20min
4. 从6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。5. 6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+10%FB（从此刻开始算时间）。第三天：1.转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以第四天：1.转染后48和72h分别收获含病毒的上清。2.3000 rpm 离心20min，0.45um滤膜过滤，去除细胞沉淀。3.12000转离心浓缩细胞、分装-80°C贮存。4.滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。4.3病毒包装的原理质粒DNA为能转录出慢病毒遗传物质（RNA），但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，psPAX2为能表达慢病毒外壳的质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜， pMD2.G为慢病毒的膜蛋白质粒，通过 lipofectamine2000进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因RNA与psPAX2、pMD2.G基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质RNA反转录出DNA，该基因再整合到靶细胞的基因组中，完成转染过程，因为质粒DNA只能转录出病毒RNA和表达目的基因却不能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖，故对宿主细胞是无害的并且高效的将目的基因转然到靶细胞基因组中。 5、慢病毒感染细胞5.1流程图
5.2感染步骤1）铺板：将对数生长期的细胞消化重悬后，按1*105/L密度接种于12孔板，生长过夜2）感染：将70-80%铺满12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入PBS浓度梯度稀释的病毒液，混合均匀后即可放入孵箱培养。3) 24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体根据细胞状态来看。 我公司为生物技术服务实验公司，有任何实验操作或其它相关问题，欢迎咨询，我们免费帮大家解答！！
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luozi99 编辑于
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