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乙型肝炎病毒 DNA 定量检测临床应用的若干问题与思考
摘要：HBV DNA 检测技术目前已经在临床中普遍应用。但在实际工作中，不少临床医师对如何认识、评价和使用 HBV DNA 检测结果仍存在着一些困惑，甚至可能因认识不足、应用不当导致了错误的诊断和治疗。现就 HBV DNA 定量检测临床应用的基因诊断和临床治疗研究阐述如下。
　　一、如何正确认识和评价DNA定量检测试剂盒的灵敏度
　　任何一种基因检测技术都有一定的灵敏度，即该方法的最低检测限。目前公认的HBVDNA定量检测国际&金标准&是罗氏公司生产的COBASAmpliPrep-COBASTaqMan(CAP-CTM)实时荧光PCRHBVDNA定量检测试剂盒，其血清HBVDNA检测灵敏度为170拷贝／mL(30IU/mL)。有学者将雅培公司生产的HBVDNA定量检测试剂盒与CAP-CTM进行了比较，发现两者灵敏度相似。
　　目前，国产的HBVDNA实时荧光PCR定量检测试剂盒灵敏度为1&10^3拷贝／mL，与国外产品尚有一定差距。虽然某些国产试剂盒声称检测灵敏度可达250或300拷贝／mL，但无充分实验室或临床证据。
　　有研究显示，将24份罗氏公司第一代产品COBASAmplicor试剂盒HBVDNA定量在300-1000拷贝／mL的患者血清，分别采用2个国产HBVDNA试剂盒进行检测，发现后者的漏检例数分别达11例(45.83%)和22例(91.67%)。
　　与国产试剂盒相比，罗氏公司的CAP-CTM检测系统之所以具有较高的灵敏度，除试剂本身的质量及配套的仪器性能等因素外，从技术层面看，尚有其他重要原因：
　　①该检测系统在从血清中分离、提取HBVDNA时，采用的是全自动的HBVDNA提取系统COBASAmpliPrep，且采用的是磁珠吸附柱纯化，尽可能地避免了提取过程中HBVDNA的丢失，而国产试剂盒均采用手工提取，且多为煮沸法、Chelex树脂法等，提取过程中HBVDNA丢失较多。
　　有学者研究发现，即使采用同一检测试剂，血清标本的处理方法对HBVDNA检测结果也有着直接的影响，煮沸法和Chelex树脂法阳性检出率仅为吸附柱核酸纯化法的52.78%和55.56%。在阳性标本中，同一标本的定量值也较吸附柱核酸纯化法低1-2lg拷贝/mL。
　　②该系统用于检测的每份血清标本量较大。CAP-CTM试剂盒用于检测的每份血清量达650uL，而国产HBVDNA检测试剂盒用于检测的血清标本量一般仅为50-100uL，但两者提取到的待测HBVDNA产物容积一般均为50uL。而且，由于反应管体积的限制，进行PCR检测时只能再取其中的2-5uL的HBVDNA提取产物作为PCR检测的模板。
　　在血清HBVDNA含量较低时（1&10^3拷贝/mL以下），在有限的2-5uLHBVDNA提取产物中，能&抓到&多少HBVDNA分子进入到PCR检测反应管，并被仪器&捕捉&到荧光信号，就存在着一个概率问题：进入检测体系的血清标本量越多，&抓到&足够多的HBVDNA分子的概率就越大，荧光仪捕捉到荧光信号的概率也就越高；反之，血清标本量越少，检出概率越低，漏检率也就越高。显而易见，罗氏试剂盒由于增加了进入检测体系的样品容积，其敏感度理论上就比国产试剂盒提高6-13倍。
　　国产HBVDNA定量检测试剂盒的灵敏度偏低可以解释某些临床现象：
　　①CHB或乙型肝炎肝硬化患者多次检测血清HBVDNA&1&10^3拷贝/mL，在除外合并脂肪肝、性肝损害等其他病因后，仍反复出现血清ALT、AST升高；
　　②或在接受治疗后，监测血清HBVDNA已长时间处于不可测水平以下，但血清ALT和AST即使加用&降酶药&后仍持续异常。其中的原因可能就是患者体内存在低水平的HBV复制，但国产试剂盒却未能检测出。
　　鉴于我国大多数乙型肝炎患者的经济承受能力有限，没有必要普遍推广使用高灵敏度、高成本的进口试剂盒，因为目前尚无彻底清除HBVDNA的药物，即使患者血清HBVDNA降到更低的不可测水平，甚至发生血清HBsAg转换，但肝脏中仍然会有HBVDNA或HBVcccDNA存在。
　　在抗病毒治疗的动态监测过程中，只要患者血清HBVDNA持续&1&10^3拷贝／mL，结合生物化学、影像学和（或）组织学等指标，就足以对疗效进行恰当的评价。只有在HBVDNA水平用国产试剂盒检测&1&10^3拷贝／mL，但①患者未经治疗，ALT持续异常；
　　②或在抗病毒治疗过程中，出现ALT持续不能复常，或复常后又反弹；③或肝脏影像学、组织学有进展；④或有肝硬化、癌家族史等高危因素；⑤或HBV血清学标志物阴性、但疑有隐匿性乙型肝炎等少数情况下，可以考虑使用高灵敏度的HBVDNA检测试剂盒。
　　二、如何看待HBVDNA定量检测试剂盒的检测线性范围
　　任何检测方法，只有在一定的范围内才有效，即该方法检测的线性范围。检测线性范围包括检测的上限和下限，下限即为检测灵敏度，上限即为其最高检测浓度，待测标本中，如目标分子的浓度低于检测下限可能导致漏检；如高于检测上限，由于高浓度底物的抑制效应，亦有可能导致误检甚至漏检。
　　影响HBVDNA定量检测试剂盒线性范围的因素有：①定量标准品设置的范围。荧光定量PCR检测时，一般均采用标准曲线法，只有检测数值位于标准品的定量范围内，结果才是有效的、准确的，不能通过统计公式任意加以外推。部分国产HBVDNA定量检测试剂盒说明书上标明检测线性范围为500-1&10^8拷贝／mL，但实际可能只有1&10^4、1&10^5、1&10^6和1&10^7拷贝／mL4个数量级的标准品，显然是不严谨的。
　　如待测标本的检测结果低于1&10^4拷贝／mL或高于1&10^7拷贝／mL，均是不可靠的。②检测试剂的质量，如PCR引物和荧光探针的保守性、通用性，试剂盒所采用的Taq酶的扩增能力、热稳定性，以及反应体系抗干扰系统的设置等，均会直接影响PCR的扩增效率和检测线性范围。
　　HBVDNA检测试剂盒的线性范围越大，表明其检测效能越高。罗氏、雅培和Qiagen公司的HBVDNA定量检测试剂盒的检测线性范围分别为30-1&10^8IU/mL、10-1&10^9IU/mL和20-1&10^8IU/mL。根据作者多年的基因实验室和临床工作经验，多数国产试剂盒的线性范围在1&10^3-1&10^8拷贝／mL，虽检测效能较国外试剂盒小2个数量级，但基本能满足临床需要。
　　建议对于使用国产试剂盒检测结果为1&10^8拷贝／mL或以上的血清标本，实验室技术人员可常规对标本进行1:100-1:1000的稀释，然后再次进行检测。这样能确保血清高载量HBVDNA的样品检测结果更准确，在抗病毒疗效监测中也能更有效地反映患者实际HBVDNA的下降程度。
　　三、如何看待不同实验室之间HBVDNA载量检测结果和单位的差异
　　常会看到同一患者提供的在同一家医院相近时间段（未经抗病毒治疗），或同期在不同医院（实验室），所测得的HBVDNA载量有差异，甚至有很大差异。究其原因，应该包括两个方面：一是检验技术本身固有的&缺陷&，或必然存在的误差；二是试剂、设备和人员技能的差异。
　　由于HBVDNA检测结果是指数形式，且HBVDNA本身易发生突变而影响引物和探针的结合，因此不同厂家的HBVDNA检测试剂盒之间的检测结果不具有可比性。
　　在一项研究中，来自美国9个独立实验室的学者，对67份血清标本分别采用雅培公司的HBVIUO、罗氏公司的CAP-CTM和HighPure-CTM、Qiagen公司的artusHBVTMASR等HBVDNA检测试剂盒进行检测，发现尽管上述试剂盒在检测下限、线性范围、可重复性方面均较好，但①检测结果的中位数以CAP-CTM最高，artusHBVTMASR最低；
　　②检测结果的可重复性以具有全自动DNA提取系统的试剂金较好；③所有试剂盒均有假阳性结果，其中使用手工DNA提的试剂盒发生率较高。
　　鉴于不同方法、不同买验室检测结果之间的差异，欧洲肝病研究会指南特别强调，对治疗过程中HBVDNA的随访监测，同一患者需要采取同一种方法。我国有关核苷（酸）类药物耐药预防与管理的专家共识也明确指出，为确保检测结果的稳定性和一致性，对于在同一地方就诊的同一患者，应坚持采取同一种检测方法进行评估。
　　HBVDNA定量检测结果以拷贝／mL表述较为直观，易于为临床医师和患者理解。但如采用不同厂家试剂盒进行检测，且结果用拷贝/mL表述，其差异较大，不便于比较。
　　为解决这一问题，由9个国家、22个实验室组成的协作组，对3份阳性血清标本采用不同厂家的HBVDNA试剂盒进行检测，并将检测结果进行标准化，最后产生一份来自欧洲的&标准血清&（代号97/746），作为HBVDNA核酸扩增检测技术的标准品，定义为1&10^6IU/mL（5&10^5／反应管），这一标准已被世界卫生组织(WHO)所承认。2006年，该标准血清被一代号为97/750的新标准血清取代。
　　各试剂生产厂家如罗氏、雅培、Qiagen等，均把待测样品的实测值（拷贝/mL），用WHO的标准血清检测结果进行标化后，赋予标准化值，即IU/mL。
　　不同厂家的试剂盒，拷贝／mL与IU/mL的换算系数不同：罗氏公司CAP-CTM试剂盒1IU/mL=5.82拷贝／mL，Qiagen公司的ReaIArtHBVPCR试剂盒1IU/mL=6拷贝／mL，西门子VERSANTHBVDNA试剂盒1IU/mL=5.7拷贝／mL，雅培公司实时荧光定量HBVPCR试剂盒1IU/mL=3.41拷贝／mL。
　　但为便于临床医师计算，目前国内外相关指南均统一采用1IU/mL=5拷贝／mL进行换算。需要特别指出的是，目前部分国产试剂盒的报告单位&IU/mL&与&拷贝／mL&的实际换算系数是1，但为了人为地&与国际接轨&，把报告单位标注成&IU/mL&。
　　四、如何看待与处理HBVDNA定量检测结果的假阴性与假阳性
　　任何检测方法均可能存在假阴性和假阳性。所谓HBVDNA定量假阴性是指标本中存在HBVDNA却未能检测出来，假阳性是指本来不存在HBVDNA却报告检测出阳性结果。
　　造成HBVDNA定量检测假阴性的常见原因有：①HBVDNA检测试剂盒灵敏度较低，使HBVDNA载量较低的标本漏检；②标本采集、运送或保存不当，导致HBVDNA被DNA酶降解、断裂；③标本中存在抑制PCR过程的物质，如肝素抗凝、血脂过高、溶血等；④HBVDNA发生变异，致使PCR检测的引物、探针与HBVDNA靶片段不能有效互补结合，不能形成扩增产物或无法产生荧光信号。
　　作者曾接诊1例HBsAg、HBeAg阳性CHB患者，其未曾进行抗病毒治疗，多次在外院查肝功能均示ALT升高，但同时多次查HBVDNA均&1&10^3拷贝／mL，并排除合并其他病因，该医院同期其他患者的检测结果亦未发现异常。后该患者在解放军第四O四医院复查HBVDNA为5.6&10^6拷贝／mL，HBVDNA测序发现，该患者HBVDNA在外院检测时试剂盒所采用的正义PCR引物3&末端存在两个碱基的突变。
　　造成HBVDNA检测假阳性的原因：①标本被污染；②因操作不当或试剂质量等原因导致扩增曲线不平滑、不稳定，在一定热循环数以后扩增曲线出现折线或&翘尾&现象，被系统误检为阳性信号。
　　后者可导致一种令临床医师和患者特别困惑的现象，即已长时间抗病毒治疗的患者，突然检测到低水平的血清HBVDNA，一般在最低检测限左右，如(1-2)&10^3拷贝／mL，被误以为病毒学反弹或复发，但立即到不同医院或同一医院进行复检，结果HBVDNA低于检测下限。对于此种结果，最好的处理办法是进行重复检测。
　　HBVDNA检测假阳性与假阴性的发现，有赖于临床医师与检验技术人员保持良好的沟通。当临床医师对检测结果有疑问时，应及时向实验室提出，实验室技术人员应采取核对标本是否有误、重新检测、重新抽血、更换检测试剂盒等方法加以复核。
　　五、如何看待HBVDNA检测与免疫学检测之间的关系
　　HBVDNA定量检测是HBV感染的一种病原学诊断手段。与HBV感染的传统病原学诊断手段--HBV血清学标志物检测相比，其优势是高灵敏度，甚至能发现血清学标志物全阴性的隐匿性乙型肝炎。
　　但HBV血清学标志物检测有其独特的优势，可提供基因诊断无法提供的信息：①免疫学诊断不仅可以通过HBsAg和HBeAg来反映HBV的存在与否，还能反映机体对HBV的免疫应答状态。
　　如HBeAg的血清学转换提示机体对HBV的细胞免疫功能有所好转；如单独出现HBeAg的消失而不伴有抗-HBe的出现，则主要反映病毒被抑制而不是免疫功能的好转；如继续出现HBsAg的血清学转换，代表机体对HBV免疫功能的显著好转或痊愈。
　　②免疫学诊断可为基因诊断提供补充信息和线索。例如，同样是未经治疗的HBVDNA载量为1&10^6拷贝／mL的两例CHB患者，如果一例HBeAg阳性，而另一例HBeAg阴性，则预示着患者的HBVDNA可能存在前C区和（或）基本核心启动子区基因变异。
　　③免疫标志物检测可作为抗病毒疗效评价的补充手段。有研究显示，在干扰素治疗CHB过程中，HBsAg定量的快速下降是HBeAg阳性CHB患者HBeAg血清转换的预测因子，对HBeAg阴性CHB实现治疗后病毒学应答(sustainedvirologicalresponse,SVR)和HBsAg消失也有很好的预测作用。
　　因此，我国的相关专家建议中，明确提出把HBsAg定量和HBVDNA的动态变化作为应答指导治疗(responseguidedtherapy，RGT)策略的主要预测、指导指标。
　　④血清HBsAg和HBeAg检测对肝细胞癌有一定的预测作用。中国台湾一项对初治、无肝硬化的2688例患者进行平均14.7年的随访研究显示，HBeAg阳性、高载量HBVDNA均与肝细胞癌的高发病率相关。
　　HBsAg也与肝细胞癌风险具有量效相关性。特别是对于HBeAg阴性、低血清HBVDNA载量者，HBsAg&1000IU/mL者发生肝细胞癌的风险是HBsAg&1000IU/mL者的5.4倍。作者认为，在预测肝细胞癌方面，HBsAg水平可作为HBVDNA的补充。
　　六、结语
　　HBVDNA定量检测应用于临床后，不仅是一种检测技术，更是一种诊断手段。要在临床上正确应用HBVDNA定量检测，临床医师首先需对检测结果的临床价值有正确的认识，并据此进行相应的临床决策，如是否需进行抗病毒治疗或进行HBV宫内感染阻断、是应答不佳还是已发生耐药、进展至肝硬化或肝细胞癌的风险等。
　　其次，临床医师还需对HBVDNA定量检测技术本身有所了解，如荧光定量PCR检测的基本原理及其不同于其他检验技术的基本特点（扩增能力强、灵敏度高，但同时检测结果波动大、室间差异大）等。
　　对本单位所采用的试剂盒的灵敏度、线性范围等则需有恰当的评价，不能为说明书所左右。再次，临床医师还需将HBVDNA检测与其他诊断手段相结合，并与检验技术人员保持有效的沟通，才能对患者的病情做出正确的、全面的评价，避免错误的诊断乃至错误的治疗。
　　总之，临床医师只有不断更新专业知识，不断加深对HBV基因诊断技术的理解，并正确和合理地应用于临床实践，才能造福于广大乙型肝炎患者。
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乙型肝炎病毒基因变异及其临床意义
作者：谢佳新， 殷建华， 何永超， 曹广文　&&&&作者单位：第二军医大学卫生勤务学系流行病学教研室， 上海 200433
乙型肝炎病毒(hepatitis B vius,HBV)感染是导致慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)、肝硬化(liver cirrhosis,LC)和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的重要原因，全球每年由于HBV慢性感染引起的肝硬化、肝细胞癌死亡患者超过47万人。本文主要对乙肝病毒的相关变异及与临床治疗和预后的关系作一介绍。
【关键词】& 肝炎病毒，乙型; 变异; 基因型
Hepatitis B virus variation and its clinical significance XIE Jia?xin, YIN Jian?hua, HE Yong?chao, CAO Guang?wen. Department of Epidemiology, Faculty of Medical Service, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
　　【Abstract】 Hepatitis B virus infection is the major cause of chronic hepatitis B (CHB), liver cirrhosis (LC), and hepatocellular carcinoma (HCC). Over 47 000 people die of LC and HCC caused by HBV infection in the world each year. This article introduces the related variations of hepatitis B virus and the correlation with clinical treatment and prognosis.
　　【Key words】 Hepatitis BVGenotype
　　乙型肝炎病毒属于嗜肝DNA病毒科，其基因组约3 200 bp，是已知真核细胞中最小的DNA病毒。HBV?DNA为环状部分双股DNA，其中长链核苷酸序列与病毒的mRNA互补，为负链;短链为正链。由于HBV的复制是以mRNA为中间体的逆转录复制,而在这一过程中缺乏校对酶的作用，容易发生碱基配对错误,因而HBV基因变异十分频繁，慢性活动型乙肝患者和HCC患者肝细胞每天可以产生1013个HBV颗粒，在外周血中浓度可达1012/ml，半衰期1～1.2 d，每天产生3.2&1010个点突变。随着病情的进展，在免疫压力下HBV常发生变异和选择，一些特异性HBV突变株被选择出来，形成HCC特征性HBV变异，这一过程代表了HBV进化过程。T1653、V1753、T、T1856、T1858和A1896等位点突变可能影响病毒的传播、致病和疾病的转归，尤其是C基因基本核心启动子区(basic core promoter,BCP)的T双突变和前C区(precore,PC)的A1896终止变异影响HBeAg的状态，可能与HBV的持续感染和HCC有关[1，2]，成为乙肝病毒基因变异研究的热点。
　　乙肝病毒感染在临床上可产生不同的肝脏疾病谱，包括无症状的表面抗原携带者、慢性肝炎、肝硬化和肝癌。在慢性感染的过程中HBV病毒基因发生变异的概率很高，并且这些变异在不同阶段肝脏疾病中发生频率不同，提示变异与疾病预后相关，可以作为预测疾病结局的分子标志。相关研究主要有发生在BCP区的Tl762/A1764双突变、发生在翻译水平PC区的A1896终止变异以及preS缺失变异和enhancerⅡ变异。目前，临床上使用核苷类药物如拉米夫定、阿德福韦酯等进行HBV抗病毒治疗，使用这类药物进行长期治疗面临的重要问题便是乙肝病毒的耐药性，特别是发现有患者未用过此类药物但对它具有耐药性以及发生多重耐药现象，在临床引起极大关注，一般认为HBV基因组P区变异与这些耐药性的产生有关。目前已根据HBV核苷酸序列异质性&8%将其分成A?H共8种基因型,其中A、B、C基因型又可进一步分为各基因亚型。HBV基因型存在区域性分布特征,并与临床疾病谱、疾病的进展以及抗HBV治疗反应不同等方面可能相关[3]。随着基因分型技术的完善和对HBV基因型研究的深入，将有利于对基因变异及其临床意义的进一步了解。
　　1 前C/C区基因变异
　　HBV PC/C区基因转录、翻译的终产物为HBeAg，HBeAg阳性表明病毒复制活跃,血清HBV?DNA含量高。既往认为慢性乙型肝炎患者出现HBeAg血清转换后会伴随HBV?DNA水平下降,转氨酶正常,提示HBV复制停止,病情缓解，传染性降低。但是近年来发现部分患者HBeAg转阴后仍保持HBV高水平复制,肝组织炎症继续进展,成为HBeAg阴性慢性肝炎而引起人们的重视。目前，大量研究表明这些病人中部分可能伴有HBV前C区或BCP区变异及联合变异而造成HBeAg表达下降或停止,但HBV仍然能复制和传播。乙肝病毒感染者，特别是慢性乙肝患者,该区基因更易发生变异，最常见的是1896位核苷酸G到A的变异，导致28位密码子TGG(色氨酸)变异为终止密码子TAG，使前C蛋白的翻译终止,从而使HBeAg不能形成，尤其是与T双突变的联合变异可能引起更严重的肝脏疾病[4]。该变异主要在HBeAg阴性、抗?HBe阳性和HBV?DNA滴度较高的活动性肝病中检出，是发生HCC的重要因素之一。Tong关于HCC与ASC中BCP和PC变异比较的研究发现，HCC患者相对ASC有更高的变异频率(A1896和T1762/ A1764分别为77.7%与21.2%,P=0.%与30.2%，P=0.04[5])。因此，对乙肝患者及时进行前C区1896位与BCP区l762/l764位突变的检测，对于预测病情的转归和预后有重要临床意义。近来,不少学者对HBV前C区变异株与临床的关系进行系列研究还发现该变异易引起爆发性肝炎或使慢性肝炎活动加剧[6]。同时，PC区变异在A基因型感染者中很少发生，而在其它基因型感染者中变异频率较高，这可能是因为在基因型B、D、E及部分C型的ntl858为T，与G1896配对形成的&茎襻结构不稳定，易发生G?A替代而形成T?A配对以维持茎襻结构稳定，有利于HBV的复制，而基因型A、F及部分C型的ntl858是C,与G1896组成较稳定的C?G配对，故很少发生G1896A变异。Yuan还报道了A1896变异在C2亚型较C1亚型高(p<0.002)[7]。因此，一般认为PC区Al896变异是基因型依赖的，以B、C、D型为主。
　　2 S基因变异
　　HBV病毒S区基因编码病毒的包膜蛋白,包括S、M和L三种蛋白，它们在病毒的生命周期中有重要作用，具有附着和侵入细胞、促使病毒的装配和分泌、阻断宿主的免疫应答使感染持续等功能。另一方面，该段基因携带与免疫应答有关的B、T淋巴细胞表位，其中a决定簇是提供保护性免疫的免疫源。该区特别引人注目的变异是nt546C&A,它可导致免疫优势表位a决定簇aa131Thr(ACC)&Asn(AAC),另外还有nt587G&A变异使aa145Gly&Arg。据报道,这些位点变异可使用野毒株HBsAg制备的血源性或基因工程乙肝疫苗所产生的抗?HBs对一些变异株的HB ?sAg的亲合力和中和作用明显下降, 从而致使乙肝疫苗阻断母婴传播和HB?sIg预防移植肝HBV再感染失败。因此，在研究具有全面、均衡的免疫效果基因工程乙肝疫苗时应考虑该区基因变异[8]。preS区缺失变异包括preS1、preS2缺失或两者同时缺失，preS缺失变异可影响S蛋白和M蛋白的表达，导致细胞内L蛋白的聚积,在HCC中该变异显著高于ASC和CHB，可能导致预后不好。前S2起始密码变异株造成M蛋白的缺失，与重型肝炎相关，可能是导致严重肝病的因素之一。在我国江苏启东地区开展的研究发现在HCC和CHB中preS缺失变异频率分别是51.1%和18.0%(P<0.01)，preS2启动子区域变异在HCC中也更常检测到，提示该变异发生与HBV疾病预后有关[9～11]，但是由于preS区位于P基因的间隔区,所以对病毒的复制功能没有显著影响,这也是该区高发缺失变异的原因之一。
　　3 X区变异
　　X基因编码含154个氨基酸的X蛋白，该蛋白可反式激活HBV病毒基因,是HBV基因组内结构和功能重叠最明显的区域。因此,X基因在HBV复制、表达及致病中起关键性作用，其变异主要包括BCP变异和X基因羧基端的缺失变异。目前研究BCP变异的重点是T双突变,该变异的出现减少了PC区mRNA而相应地使HBeAg水平下降，但对C区mRNA及病毒其它基因转录无影响。也有报道认为BCP区双突变可以减少前C区和C区的mRNA转录,从而使HBeAg表达受抑制,表现为HBeAg阴性[12，13]。大量研究发现HBV的BCP区T双突变与乙肝预后密切相关,而与HBeAg阳性或抗?HBe阳性状态无关。Jang等进行长达13年的BCP双突变与HBeAg血清转换的队列研究发现出现双突变的病例比未出现者更早出现HBeAg血清转换(6.9和9.4年,P=0.062),出现双突变与最终进展成为HCC也有显著关联(P=0.013)[14]。Ferns报道HBeAg消失后血清或血浆中仍有高水平HBV?DNA的患者比HBV?DNA滴度下降的一组有更高的A1762T和/或G1764A突变率(P=0.031)，除这两个位点外其它变异也更多(P=0.037)[15]。可见,HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者虽然病毒载量较低,但一般处于疾病的较晚阶段,免疫耐受被打破,病毒复制激发病变活动，所以定期监测血清ALT及HBV?DNA水平,积极开展肝组织活检,可以判断HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者的病情,有利于制定合理的治疗方案,对延缓肝病进展有重要意义。
　　Chen在台湾地区人群中的研究发现T在肝硬化患者中有更高的比例(OR=11.11,P<0.001)，认为该突变与肝硬化的发生有关[12]。最近，Kuang等的研究也发现在HBV引起的LC中T双突变比例高达74.3%，在HCC中的比例为55%。据此，他们认为检测患者血浆中HBV的BCP区T双突变有助于肝癌的早期诊断[16]。就B和C基因型之间的变异比较,多数学者认为C基因型的HBV更容易发生BCP区双突变[17]，与文献报道的C基因型更容易引起严重肝病一致。X基因羧基端的缺失变异主要是nt、ntl770?1777、nt和ntl750?1770等8个、20个、21个核苷酸的缺失，该变异导致HBV低水平复制，与HBsAg阳性、HBeAg阴性的无症状携带现象密切相关。
　　4 P区变异
　　P基因区是HBV病毒基因组中最大的一个编码区，编码病毒DNA聚合酶(DNAP),根据基因功能,可将其活性部位在结构上分为A?E共5个区域，该区基因变异与临床治疗密切相关。临床上使用拉米夫定治疗慢性乙肝一定时间后部分病例会产生抗药性而使病情反复，原因在于其C区发生了变异。拉米夫定作用于DNAP活性部位酪氨酸?蛋氨酸?天冬氨酸?天冬氨酸基序(YMDD)，当发生基因变异时，YMDD基序出现氨基酸替换，大多是此区的第552个密码子即蛋氨酸被缬氨酸取代即YVDD变异或被异亮氨酸取代即YIDD变异。另外,B区第528个密码子亮氨酸被蛋氨酸取代即L528M变异，常与M552V合并出现，发生双位点突变。YMDD变异对宿主的危害在于影响拉米夫定的抗病毒活性,从而影响治疗效果。
　　有报道，服用拉米夫定4年后耐药的达到70%，服用阿德福韦5年后29%产生耐药性，服用恩替卡韦1年有1%耐药，服用替比夫定2年有9&22%产生耐药性[18]。这可能是由于HBV变异体会因为应答内源性免疫压力和抗体、抗病毒治疗的选择压力而出现,因而导致耐药。最常见的是长期使用拉米夫定诱发HBVDNA多聚酶编码基因区的点变异而耐药。YMDD变异的检出率随拉米夫定用药时间的延长而增加,治疗1～4年的耐药率分别为14%、38%、49%和66%[19，20]。Al762T/G1764A双突变在LAM治疗过程中对HBeAg的清除有重要作用，在发生免疫清除与产生耐药或复发患者中该变异具有统计学差异。另外，T,G1803和T1846等变异也可能与血清转换有关[21]。阿德福韦酯作为继拉米夫定后抗乙型肝炎病毒又一种核苷类似药物,抗HBV的耐药率低,但随治疗时间的延长耐药率不断升高，治疗1～5年的变异率分别为0%、3%、11%、8%和29%[22]，目前发现的耐药位点主要为rtN236T和rtA181V/T。如果阿德福韦酯发生耐药,可导致HBV?DNA的反弹及肝功能异常,因此对阿德福韦酯耐药的预防及耐药的处理显得尤为重要。
　　由于HBV病毒基因变异产生的耐药性，现有抗病毒药物都不足以清除病毒或在大部分慢性乙型肝炎患者中达不到持续的病毒抑制作用,因此应对耐药机制进行更深入的研究及探索联合药物治疗。
　　5 展望
　　我国是乙型病毒性肝炎的高发区,全国每年死于与乙肝相关肝病约30万例，慢性乙肝成为我国严重的公共卫生问题，同时也给国家带来了沉重的经济负担。虽然近几年对HBV病毒和宿主及其相互作用在分子水平进行大量研究，提高了该病的防治水平，以及对新生儿实施乙型肝炎计划免疫后使儿童感染率下降。但是仍然面临多重难题，应重视在下面三个方面开展更深入的研究。
　　5.1 开展HBV基因变异与宿主乙肝感染有关基因多态性关系的的研究 前面对HBV基因变异和乙肝病变进行了叙述，表明病毒因素所起的关键作用，同时，宿主的遗传因素对乙型肝炎也有重要临床意义，人们已经对乙型肝炎病毒感染相关的易感或拮抗基因如HLA、TNF?&、MBP、VDR等的多态性进行了大量研究并证实了它们的相关性。另外,HBV病毒基因变异对宿主基因多态性的作用可能影响该基因的表达，其相关性和作用机制需要进一步的研究。
　　5.2 建立中国的HBV基因组标准序列 人类感染乙型肝炎病毒其基因变异可能影响病毒的传播、致病和疾病的转归。根据基因序列差异进行HBV基因型分型方法的日趋完善，将有助于发现新的HBV基因型及开展流行病学调查，了解HBV各基因型毒力的强弱和致病性的关系。但是，由于病毒基因组多位点的变异和大量变异株的出现，在不同民族、种族和地区人群中感染HBV病毒的基因序列存在差异，因此，建立我国乙肝病毒基因组的标准序列具有重要意义。
　　5.3 对乙型病毒性肝炎患者实施个性化治疗 HBV基因组不同的变异可导致病毒对不同抗病毒药物产生耐药性，针对这些变异研发快速诊断试剂盒，可以及时为临床用药提供依据，提高临床治疗效果，减轻患者负担。
【参考文献】
& 　　[1] Tanaka Y, Mukaide M, Orito E, et al. Specific mutations in enhancer II/core promoter of hepatitis B virus subgenotypes C1/C2 increase the risk of hepatocellular carcinoma [J]. J Hepatol, ):646?653.
　　[2] Chu CM, Yeh CT, Lee CS, et al. Precore stop mutation HBeAg positive patients with chronic hepatitis B：clinical charactcristics and correlation with the course of HBeAg?to?anti?HBe seroconversion [J]. J Clin Micrnhiol， ):16?21.
　　[3] 谢琴秀,许家璋,李平，等. 江苏地区乙型肝炎病毒基因分型及其临床意义 [J]. 疾病控制杂志, ):171?173.
　　[4] Truong BX, Seo Y, Yano Y, et al. Genotype and variations in core promoter and pre?core regions are related to progression of disease in HBV?infected patients from Northern Vietnam [J]. Int J Mol Med, ):293?299.
　　[5] Tong MJ, Blatt LB, Kao JH, et al. Basal core promoter T and precore A1896 gene mutations in hepatitis B surface antigen?positive hepatocellular carcinoma: a comparison with chronic carriers [J]. Liver Int, ):.
　　[6] Yoo BC, Park JW, Kim HJ, et al. Precore and core promoter mutations of hepatitis B virus and hepatitis B e antigen?negative chronic hepatitis B in Korea [J]. J Hepatol， ):98?103.
　　[7] Yuan J, Zhou BP, Tanaka Y, et al. Hepatitis B virus (HBV) genotypes/subgenotypes in China: mutations in core promoter and precore/core and their clinical implications [J]. J Clin Virol, ):87?93.
　　[8] Wu L, He JW, Yao X, et al. A novel hepatitis B virus variant S 129 (Gln—>Leu): lack of correlation between antigenicity and immunogenicity [J]. J Med Virol， ):424?430.
　　[9] Cao Z, Bai X, Guo X, et al. High prevalence of hepatitis B virus pre?S mutation and its association with hepatocellular carcinoma in Qidong, China [J]. Arch Virol， ):.
　　[10] Chen BF, Liu CJ, Jow GM, et al. High Prevalence and Mapping of Pre?S Deletion in Hepatitis B Virus Carriers With Progressive Liver Diseases [J]. Gastroenterology, ):.
　　[11] Chen CH, Hung CH, Lee CM, et al. Pre?S deletion and complex mutations of hepatitis B virus related to advanced liver disease in HBeAg?negative patients [J]. Gastroenterology, ):.
　　[12] Chen CH, Lee CM, Lu SN, et al. Clinical significance of hepatitis B virus (HBV) genotypes and precore and core promoter mutations affecting HBV e antigen expression in Taiwan [J]. J Clin Microbiol， ):.
　　[13] Laras A, Koskinas J, Hadziyannis SJ. In vivo suppression of precore mRNA synthesis is associated with mutations in the hepatitis B virus core promoter [J]. Virology， ):86?96.
　　[14] Jang JW, Lee YC, Kim MS, et al. A 13?year longitudinal study of the impact of double mutations in the core promoter region of hepatitis B virus on HBeAg seroconversion and disease progression in patients with genotype C chronic active hepatitis [J]. J Viral Hepat, ):169?175.
　　[15] Ferns RB, Gilson RJ, et al. Presence of hepatitis B virus core promoter mutations pre?seroconversion predict persistent viral replication after HBeAg loss [J]. J Clin Virol, ):199?204.
　　[16] Kuang SY, Jackson PE, Wang JB, et al. Specific mutations of hepatitis B virus in plasma predict liver cancer development [J]. Proc Natl Acad Sci USA, ):.
　　[17] Sakugawa H, Nakasone H, Nakayoshi T, et al. Preponderance of heatitis B virus genotype B contributes to a better prognosis of chronic HBV infection in Okinawa [J]. Japan J Med Virol, ):484?489.
　　[18] Degertekin B, Lok AS. Monitoring antiviral resistance in patients receiving nucleus tide analog therapies for hepatitis B: which method should be used? [J]. J Hepatol, ):892?894.
　　[19] Liaw YF, Leung NW, Chang TT, et al. Effects of extended lamivudine therapy in Asian patients with chronic hepatitis B [J]. Gastroenterology, ):172?180.
　　[20] Leung NW, Lao CL, Chang IR, et al. Extended lamivudine treatment in patients with chronic hepatitis B enhances hepatitis B e antigen seroconversion rates: results after 3 years of therapy [J]. Hepatology, ):.
　　[21] Chen CH, Lee CM, Lu SN, et al. Comparison of sequence changes of precore and core promoter regions in HBeAg?positive chronic hepatitis B patients with and without HBeAg clearance in lamivudine therapy [J]. J Hepatol, ):76?82.
　　[22] Angus P, Vaughan R, Xiong S, et al. Resistance to adefovir dip?ivoxil therapy associated with the selection of a novel mutation in the HBV polymerase [J]. Gastroenterology, ):292?297.
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