当前位置： &流式细胞术，对照设置 流式细胞术，对照设置 作者 zisejiguan 大神好。最近在做流式，由于是新手，好多东西不明白。我在检测我做的稳转细胞系中细胞阳性率有多少，也就是纯不纯。阴性对照怎么设啊，我用的是没有转入目的蛋白的细胞染的一抗和二抗，效果很不理想啊。不知道是不是对照设的有问题 另附上实验方法，看看步骤是不是哪里需要改进的。 1.& & & & 收集细胞，Staining Buffer清洗细胞，最后剩100μL，涡旋重选细胞 2.& & & & 加入100μL固定液(4%多聚甲醛)，室温孵育20min 3.& & & & 加入500μL破膜液（0.1%皂素），300-400g，室温离心5min，弃上清 4.& & & & 500μL破膜液重悬细胞 5.& & & & 300-400g，室温离心5min，弃上清 6.& & & & 100μL破膜液重悬细胞，加入一抗，孵育1h 7.& & & & 加入500μL破膜液，300-400g，室温离心5min，弃上清 8.& & & & 重复步骤7 9.& & & & 100μL破膜液重悬细胞，加入荧光偶联抗体孵育30min 10.& & & & 加入500μL破膜液，300-400g，室温离心5min，弃上清 11.& & & & 重复步骤10 12.& & & & 用适量流式染色Buffer（PBS）重悬，上流式细胞仪分析。 PS:&&Staining Buffer：1%BSA or 5%FBS的1×PBS Fix Buffer：4%多聚甲醛的1×PBS& && &&&0.22μm滤器过滤 二抗：30min 为什么不用直标的抗体？你用的是二抗带荧光的？ 我觉得直接用细胞做阴性对照也可以，不需要用一抗和二抗染色 引用回帖:: Originally posted by linshangyan at 我觉得直接用细胞做阴性对照也可以，不需要用一抗和二抗染色 如果他是用的二抗偶联的荧光，那至少得有只加二抗不加一抗的对照，排除非特异染色， 24小时热帖 下载小木虫APP 与700万科研达人随时交流流式细胞术学习指南 &&&&第一章流式细胞仪的结构和原理 第 1节流式细胞术发展史 纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同 科研领域科学家的心血。从流式细胞术的发明、改进、革新，到今天在各个领域应用的拓展， 每一步都是诸如生物学、生物技术、计算机科学、流体力学、激光技术、高等数学、临床医 学、分子生物学、有机化学和生物物理学等学科知识综合运用的结晶。现代流式细胞术更是 由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学技术和定量荧光细胞化学，使其在生物学、临床 医学、药物学等等众多研究领域中的应用有了更加突飞猛进的发展。临床流式细胞术发展趋 势可归纳为：①流式细胞仪从单纯大型仪器发展为适应各种实际应用的便携式、台式、高 分辨率、高质量分选的研究型流式细胞仪；②对流式细胞术检测荧光参数，从采用荧光单 色、双色分析发展为多色分析，目前最多可同时检测 15 种荧光信号；③从检测参数的相 对定量发展为绝对定量；④从检测参数的手动人工分析发展为计算机软件的自动分析；⑤ 所采用的荧光试剂，从非配套试剂发展为配套的试剂盒试剂。而这一切，就要求我们流式细 胞仪使用者和科研人员一定要不断地有意识地学习上述各门学科知识，只有这样才能更好地 将流式细胞术应用到生物医学的临床实践和基础科学研究工作中去。 流式细胞术的发展简史： 1930年 caspersson 和 thorell 开始致力于细胞的计数； 1934年 moldaven是世界上最早设想使细胞检测自动化的人，他试图用光电仪记录流过一 根毛细管的细胞数量； 1936年 caspersson等引入显微光度术； 1940年 coons 提出用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白； 1947年 guclcer运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器； 1949年 wallace coulter 提出在悬液中计数粒子的方法并获得专利； 1950年 caspersson用显微分光光度计的方法在紫外线（ uv）和可见光光谱区检测细胞： 1953年 croslannd-taylor应用分层鞘流原理，成功地设计红细胞光学自动计数器； 1953年 parker和 horst描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形； 1954年 beirne和 hutcheon发明光电粒子计数器； 1959年 b型 coulter计数器问世； 1965年 kamemtsky等提出两个设想，一是用分光光计定量细胞成份；二是结合测量值对 细胞分类； 1967年 kamemtsky和 melamed在 moldaven的方法基础上提出细胞分选的方法； 1969年van dilla，fulwyler及其同事们在los alamos，nm(即现在的 national flow cytometry resource labs),发明第一台荧光检测细胞计； 1972年 herzenberg研制出一个细胞分选器的改进型，能够检测出经荧光标记抗体染色的 细胞的较弱的荧光信号； 1975年 kochler和 milstein提出了单克隆抗体技术，为细胞研究中大量的特异的免疫试剂 的应用奠定了基础。 从此，大量厂家不断研制生产出各具特色的流式细胞仪，流式细胞术进入了一个空前飞 速发展的时代。科学家们、仪器制造商们又纷纷将流式细胞仪的研究焦点转向染料的开发、 细胞的制备方法和为提高电子信号的处理能力上来。进入 21世纪，流式细胞术作为一门生 物检测技术已经日臻完善，成为分析细胞学领域中无可替代的重要工具。 2节流式细胞仪结构和工作原理 流式细胞仪（ flow cytometry ,fcm）是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。概括来说， 流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分 析和分选的技术。从开始设想到第一台仪器问世，科技工作者们进行了不懈的努力，随着各 项相关技术的迅速发展，fcm技术已经成为日益完善的细胞分析和分选的重要工具。 流式细胞仪分为三大类： 一类为台式机，临床型，其特点为：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简 便，易学易掌握，见图 1-2-1临床型台式流式细胞仪 （左：bd facscalibur—2l，4f；右： coulter epics xl/xl-mcl—1l，4f 中：partec，cyflow—1l,3f） 第二类为大型机，科研型，其特点为分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并 可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和 类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科学研究应用，见图 1-2-2、1-2-3。 1-2-2大型科研型流式细胞仪 （左：bd，facsdiva—14f，four-sorting；右：coulter epics altra—4l,8f； 中：partec，cyflow space―2l，6f） 第三类为新型流式细胞仪，随着激光技术的不断发展，仪器选用 2-4根激光管，最多检 测十三个荧光参数，加上散射光信号可达到 15个参数的同时分析。并且可以实现高速分选， 速度达到 50,000个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。 1-2-3目前最新型流式细胞仪 （左上：partec，cyflow ml―fsc,2xssc,fl1~fl13；右上：coulter，cytomicstm fc 500 左下：facsaria，fsc，ssc，fl1-fl13；右下： bd，bd lsr，4l，10f） （一）流式细胞仪的结构 fcm的结构一般分为 5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统； (highlight) ③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统； (squiggly) ⑤细胞分选系统。见图 1-2-4。 (text) 图 1-2-4流式细胞仪的光路结构 1、流动室与液流驱动系统 flow chamber 或 flow cell）是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流 动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为 430×180μm的长方形孔，供细胞 单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时 间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精 度。 流动室内充满了鞘液 (highlight) ，鞘液的作用是将样品流环包，鞘液流是一种稳定流动，操作人员 无法随意改变其流动的速度，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，使样品流不会脱离 液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光 信息，见图 1-2-5 fcm的流动室和液流系统 细胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法，流速和压力的关系服从 bernoulli方程， 即 p=(1/2)pv（勿略高度的变化），可见只要压力恒定，就可得到恒定的鞘液流流速，从而 可确保每个细胞流经激光照射区的速度不变。 (text) 从图 1-2-5可以知道，真空泵产生压缩空气，通过鞘液压力调节器加在鞘液上，一恒定 的压力（压力的大小由工厂设定），这样鞘液以均速运动流过流动室，在整个系统运行中流 速是不变的。而改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。但是，这并不是提高样 本流的速度，而是改变了细胞间的距离，样品流变宽，细胞间距离缩短，这样单位时间内流 经光照射区的细胞数就增加。 这种情况应在具体实验中引起注意，由于激光焦点处能量分布为正态分布（见图 1-2-5）， 中心处能量最高，因此当样本速率选择高速（hi）时，处在样品流不同位置的细胞或颗粒， 受激光光照的能量不一样，从而被激发出的荧光强度也不相同，这样就会造成测量误差。当 (highlight) 在测量分辨率要求高时（ (squiggly) 如 dna分析）应选取用低速（ low）。 2、激光光源与光束成形系统 目前台式机 fcm，大多采用氩离子气体激光器。激光（ light amplification by stimulated emission of radiation , laser）是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照， 是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，这是因为由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的 时间仅为 1微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间 和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。 激光光束在达到流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约为 22×66μm即短 轴稍大于细胞直径的光斑（见图 1-2-6）。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证 样品中细胞受到的光照强度一致，须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处， 台式机 fcm的光路调节对使用者是封闭的，即安装时由工程师调试完毕后，无需使用者作 任何调节，所以使用者操作十分方便。 3、光学系统 fcm的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信 号送入到不同的电子探测器（见图 1-2-6）。 在 fcm的光学系统中主要光学原件是滤光片（ filter），主要分成 3类：长通滤片 （long-pass filter, lp）、短通滤片（ short-pass filtr, sp）及带通滤片（band-pass filter, bp）。 （1）长通滤片：长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。如 lp500 滤片，将允许 500μm以上的光通过，而 500μm以下的光吸收或返回。 （2）短通滤片：与长通滤片相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或 返回。如 sp500滤片，将允许 500μm以下的光通过，而 500μm以上的光吸收或返回。 （3）带通滤片：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数， 一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。如 bp500表示其允许通过 波长范围为 475μm-525μm。 图 1-2-6流式细胞仪的光学系统 4、信号检测与分析系统 当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，受激光激发，产生代表细胞内不同物质、 不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间 360度立体角发射，产生散射光和荧 光信号。 （1）散射光信号：散射光分为前向角散射（forward scatter,fsc）和侧向角散射（sidescatter,ssc）， (squiggly) 散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理 参数或称固有参数（见图1-2-7）。 ①前向角散射：前向角散射与被测细胞的大小有关，确切说与细胞直径的平方密切相 (highlight) 关，通常在 fcm应用中， (squiggly) 选取 fsc作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒， 以避免对被测细胞的干扰。 ②侧向角散射： (highlight) 侧向角散射是指与激光束正交 90o方向的散射光信号，侧向散射光对 细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。 以上两种信号都是来自激光的原光束，其波长与激光的波长相同， (squiggly) 目前采用这两个参数 组合，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中 (highlight) 淋巴细胞、 (highlight) 单核细胞和 (highlight) 中性粒细胞三个细胞 群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。 前向角散射 侧向角散射 图 1-2-7流式细胞仪的散射光图 （2）荧光信号：当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。 (squiggly) 一种是细胞自身在 激光照射下，发出微弱荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后， 受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析，就能了解所研究细胞 参数的存在与定量(图 1-2-8)。 激光 freq 图 1-2-8激光的作用原理 荧光染料可选用的荧光素多种多样，由于它们分子结构不同，其荧光激发谱与发射谱也 各异。选取染料或单抗所标记的荧光素，必须考虑仪器所配置光源的波长。目前台式机 (squiggly) fcm 常配置的激光器波长为 488nm，通常可采用的染料有 (squiggly) 碘化丙锭 (propidium iodide，pi)、藻红 蛋白 (phycoerythrin，pe)、异硫氰酸荧光素（ fluorescein isothiocyanate，fitc）、pe-cy5等。 (text) ①荧光信号的线性测量与对数测量 荧光信号的线性测量与对数测量主要由电子线路来完成。当携带荧光素的细胞与激光正 交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管 （pmt），pmt将光信号转换成电信号。有些厂家不采用 pmt，而采用线性放大光电转换 器，其优点是降低成本提高线性度，但其最大缺点是响应速度慢，造成仪器分析细胞速度降 低，最高速度不可能超过 3 300个细胞/秒。如果样本流速超过此速度会导致数据损失，因此 高档仪器不采用此种方法。电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。 线性放大器，即放大器的输出与输入是线性关系，细胞 dna含量、rna含量、总蛋白质含 量等的测量一般选用线性放大测量。但在细胞膜表面抗原等的检测时，通常使用对数放大器， 如果原来输出是 1，当输入增大到原来的十倍时，输出为 2；当输入增大到原来的 100倍时， 输出为 3 等。在免疫样品中，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍。如 用线性放大器，将无法在一张图上清晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来。 ②荧光信号的面积和宽度 (highlight) 所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量， (squiggly) 一般对 dna含量测量时，采 用面积(fl2-a)，这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映 dna的含量， 当形状差异较大，而 dna含量相等的两个细胞，得到的荧光脉冲高度是不等的。经过对荧 光信号积分后，所得到的信号值就相等。 (squiggly) 荧光信号的宽度（如 fl2-w）常用来区分双联体细胞，由于 dna样本极易聚集，当两 个 g1期细胞粘连在一起时，其测量到的 dna荧光信号（ g2m期细胞相等，这 样得到的测量数据 g2m期细胞比率会增高，影响测量准确性。 (squiggly) 通过设”门”（gate）方法，将 双联体细胞排除。其原理是 (highlight) 双联体细胞所得到的荧光宽度信号（ fl2-w）要比单个 g2m细 胞大，因此设 ”门”后才能得到真正的 dna含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的 高度峰和面积峰也可做同样分析。 ③光谱重叠的校正 当细胞携带两种荧光素（如 fitc）受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时， 理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到另一种荧光。但由于 目前使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射峰值各不相同，但发射 谱范围有一定重叠。要克服这种误差的最有效方法是使用荧光补偿电路，利用标准已知样品 或荧光小球，可合理设置荧光信号的补偿值。采用双激光立体光路技术，就是为了减少各种 荧光间相互干扰。其原理是在光路上的光电倍增管前放上一小孔，作为空间滤波器，排除其 它杂散光信号，从而确保光源程序间互不干扰。因此可以避免有第 488nm）激发出 的 fl1、fl2、fl3和第 635nm）激发出的 fl4间的补偿。当然， fl1、fl2和 fl3 是来自同一点光源，它们之间的补偿是不可避免的。 5、fcm测量数据的存贮、显示和分析 fcm数据的存贮的方式均采用列表排队（ list mode）方式。因为目前 fcm所采用 的都是多参数指标，荧光参数标记物如是 list mode方式可大量地节约内存和磁 盘容量。当一个细胞被测 4 个参数，那么获取 10000个细胞，所占容量为 4×10000个（字 或双字）。同时当只检测 1个参数时（如 dna），可灵活的关闭其它 3 个参数，节省 3/4的 空间。数据文件虽然有易于加工处理分析的优点，但缺乏直观性。数据的显示通常有一维直 方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。 （1）单参数直方图： 细胞每一个单参数的测量数据可整理成统计分布，以分布直方图（distribution histogram） 来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值。其单位是道数，横坐标 可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数，见图 1-2-9 dna含量直方图和抗原表达直方图 左图较低道数处细胞峰为 g1期细胞，道数为 g1期细胞两倍的是 g2m期细胞，二者之 间是 s期细胞。右图 100-101（m1）为阴性细胞，而 m2）为阳性细胞。 （2）双参数数据的显示 双参数数据的显示是用于表达来自同一细胞两个参数与细胞数量的关系，常用的表达方 法有二维点图（ dot plot）,等高线图（ contour plot）,二维密度图（ density plot）。在二维图中， x坐标为该细胞一参数的相对含量，而 y坐标为该细胞另一参数的含量。从双参数图形中 可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。在左下图为 ssc组成 的点图，从图中可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞区分开，从而可 以分别分析各细胞亚群的统计数据。右下图是通过设‘门’分析（ gating analysis）得到的 fl2散点图，设‘门’可以是单参数设‘门’，也可以是双参数设‘门’，通过设 ”门” 可以调出其它参数的相关信息，被调出的信息同样也可以是单参数和双参数。图 1-2-10(左) 就是通过细胞的前向角和侧向角散射光双参数点阵图，设”门”圈出标本中的淋巴细胞群体， 再调出免疫荧光的散点图图 1-2-10（右）。 散射光图双色标记荧光图 图 1-2-10双参数免疫荧光点阵图 （二）流式细胞仪的主要技术指标 1、荧光测量灵敏度：灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标，一般以 能检测到单个微球上最少标有 pe荧光分子数目来表示，一般现在 fcm均可达到 600个荧光分子。 2、仪器的分辨率：分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数 cv（coeffeient of variation）值来表示： cv=d/m×100%(d-是分布的标准误差，m-是分布的平均值 如果一群含量完全相等样本，用 fcm来测量，理想的情况下， fcm测量曲 线表示为图 1-2-11（左），但是在整个系统测量中，会带入许多误差，其中样本含量本身的 误差，样本在进入流动室时照射光的微弱变化，再加上仪器本身的误差等，实际得到的曲线 为图 1-2-11（右）。 1-2-11仪器分辨率的显示— cv值越小则曲线分布越窄越集中，测量误差就越小。一般的 fcm在最佳状态时 cv 值&2%。cd值的计算，除采用以上计算公式外，还可以用半高峰宽来计算。半高峰宽指在 峰高一半的地方量得的峰宽，m代表峰顶部的荧光道数；它们与 cv值的的关系式如下： cv=半高峰宽/m×0.% 上述公式是建立在正态分布条件下，而实际情况所得测量数据分布常常是非对称图形， 故采用半高峰宽所计算得到的 cv值要明显小于前公式得到的 cv值，这在实际工作中应引 起注意。 3、前向角散射光检测灵敏度：前向角散射光检测灵敏度是指能够测到的最小颗粒大小， 一般目前商品化的 fcm可以测量到 0.2-0.5μm左右。 4、fcm分析速度：分析速度以每秒可分析的细胞数来表示。当细胞流过光束的速度超 过 fcm仪器响应速度时，细胞产生的荧光信号就会被丢失，这段时间称为仪器的死时间 （dead time）。死时间越短，我们说这台仪器处理数据越快，一般可达 3 000个/s-6 000个/s， 大型机已达每秒几万个细胞。 5、fcm分选指标：分选指标主要包括：分选速度、分选纯度及分选收获率。分选速度 指每秒可提取所要细胞的个数，目前台式带分选的仪器，它的分选速度为 300个/s，大型机 的 fcm最高分选速度可达每秒上万个细胞。分选纯度是指被分选出的细胞所占的百分比， 一般台式机和大型机的分选纯度均可达到 99%。分选收获率是指被分选出细胞与原来溶液 中该细胞的百分比。通常情况下，分选纯度和收获率是互相矛盾的，纯度提高，收获率降低； 反之亦然。这是由于样品在液流中并不是等距离一个接着一个有序的排着队，而是随机的。 因此，一旦两个不同细胞挨得很近时，在强调纯度和收获率不同的条件下，仪器会作出取或 舍的决定。因此，选择不同模式要视具体实验要求而定。图 1-2-12为两种细胞分选原理示 意图。 1-2-12细胞分选示意图 （左：通道式分选；右：电荷式分选） (三) 流式细胞仪补偿设置 众所周知，流式细胞是通过内置的激光器发射的激光激发荧光染料，通过荧光将 488nm 或其他波长的光转变为另一波长的光；并通过光电倍增管将光信号转变为电信号，并由计算 机统计处理变为可读数据。 现在流式细胞上常用的荧光素有： 激发波长发射波长 fitc 488nm 525nm pe 488nm 575nm pe-tr 488nm 615nm pe-cy5.5 488nm 667nm pe-cy7 488nm 767nm（以上五种荧光染料可在 coulter xl或 bd calibur或 partec,pas,cyflow，cytomation,moflo 机型上使用） apc 633nm 660nm apc-cy 633nm 767nm (以上二种染料可在装有双激光的流式胞仪上使用。如 coulter,altra或 bd calibur或 cyflow ml或 cytomation, moflow) 以上列出了各荧光素的激发及发射波长的峰值，但实际上各荧光素的激发或发射波长是 正态或偏态曲线，即有很宽的范围。如下图，为 ftic，pe的发射波长，可以看到两者的发 射波长均为偏态分布，fitc受激后多数将光源转变为 525nm左右的光； pe多数将其转变 为 575nm左右的光。故在流式细胞仪中对 525nm附近的光，对 左右的光。如果此时同时使用两种荧光染料，就会出现发射光谱相互叠加的现象。 1-2-13受激光照射后 pe分子发射光谱互相干扰图 根据上图中 pe发射波长的叠加情况，在流式细胞仪检测光信号时， pe荧光探 测器便会误检由 fitc发射的 575左右波长的光；此时计算机会将此部分信号计入 pe荧光 信号中，从而引起错误。同样 pe受激后也会发出小部分 525nm左右的光，进入 fitc荧光 探测器中。此时就需要进行一系列仪器设置，人为地去除该部分干扰。 现在商业提供的荧光直标抗体上所结合的 fitc、pe等荧光分子性状十分相近，其发射 光的光谱分布也十分稳定。通过一系列调节，可以推算出漏入其他荧光探测器的信号占本探 测器信号的百分比；一但设定该值，计算机会在其他探测器中减去根据本探测器的信号乘以 百分比后的数值。如图： 1-2-14 fitc无 pe荧光检测补偿调节示意图 1-2-15 pe无 fitc荧光检测补偿调节示意图 其他荧光的补偿调节原理也同上图，如做 fitc、pe、pe-cy5三色荧光分析原则上需要 调节的补偿有：fitc-%pe，pe-%fitc，pe-cy5-%fitc，pe-cy5-%pe，fitc-% pe-cy5， pe-% pe-cy5六组补偿，即有 23种组合。 由于在进行补偿之前的信号都已经过放大电路处理，所以 525nm或其他波长的光信号 可被转化为任何强度的电信号。同时又因为补偿电路在放大电路的后面，故补偿过程中的百 分比数值将由两个部分决定：原荧光探测器的信号与漏进其他探测器的信号。补偿最终要达 到的效果是：漏进其他探测器的信号 -原荧光探测器的信号 x n%=0。由此补偿的百分比数值 将随着各灾光探测器的放大倍数（电压）变化而变化。特定电压对应于特定的补偿参数。 要确定补偿中百分比数值，需运用以上调节补偿的基本原理并结合特定的标本来实现。 如现进行 fitc、pe双色分析，先准备该试剂的阴性对照管： a：iggfitc/iggpe，通过调节电压，使阴性群体落在 pe双阴性区。（注：在 进行调补偿时，必须将原补偿全部归零） 图 1-2-16 pe和 fitc分子的阴性对照 阴性对照在此处的作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数，即归零。荧光阴性对照实 际为没有特异性的、与抗体蛋白亚型一致的动物免疫球蛋白。由于化学键、生物键及分子之 间的吸引作用，这些蛋白会与标本中的细胞结合，在流式细胞仪上可检出一定的信号。当荧 光特异性抗体与标本结合时，会产生两部分信号：非特异信号（即同阴性对照的信号），和 特异性结合信号。所以我们只认为大于阴性对照的信号才是由特异结合而引起的信号并将其 归入统计范围。 b： fitc标记抗体 1-2-17未调补偿的双参数直方图 上图为未调补偿的双参数直方图。如在理想情况下（没有荧光干扰），因为检测管中只 含有 igg阴性对照（如同 a管一样），所以仍将没有何任信号出现。但实际情况 并不如此，在 pe坐标上出现了阳性信号。这个信号就是由于 fitc荧光漏入 pe探测器中而 引起的。此时就要取一合适百分比与 fitc信号相乘后去抵消 pe中的信号。（此时电压已通 过阴性对照设定，绝对不可变动！） 通过调节补偿参数如下图： 1-2-18 a管 fitc荧光信号补偿的调节 打个比方，通过 fitc、pe的荧光信号设为零；此时检测 fitc标记抗体与 pe 阴性对照，fitc信号假设为 1000，漏入 pe的信号为 200。在补偿调节 1号位时，补偿数 字为 5%，通过计算得出 pe信号：200-0；此时 1号位的补偿不足。同理 2号位 的补为 pe信号为：200-；补偿仍显不足。3号位的补偿为 pe信号为： 200-，补偿调节良好。 4号位补偿为 pe信号为： 200-1000x30%=-10，此时补偿调节过头， pe的信号会比原来的本底还低。补偿调节不足或 过头都会造成不准确的结果，所以要避免以上两种情况的出现。 pe的信号恰好全部减除时，即 pe信号与原来本底相同时，此时的补偿 便是正确的；即 fitc单阳性细胞的 pe的平均荧光强度与双阴性细胞 pe荧光强度一致。 1-2-19 fitc/pe双阴和 fitc单阳荧光示意图 fitc阳性细胞，通过调节补偿需将 pe中的信号恢复至与其本底一至。由上图可 知，调节荧光补偿首先要知道双阴性细胞的情况；即通过 a管调节电压确定阴性范围。其 次，在检测 fitc标记管中，必须存在阳性细胞和阴性细胞；只有这样才能有本底参照将 的信号降至与本底一至而不会过多或过少地调节补偿。 同理，如检测 c管：fitc阴性对照/pe标记抗体，可将 fitc中荧光去除。但 前提条件是在 c管中要存在 fitc/pe双阴性细胞和 pe单阳性细胞。 1-2-20 fitc/pe双阴和 pe单阳荧光示意图 在流式细胞上，当 pe单阳性细胞的 fitc平均荧光强度与双阴性细胞的 fitc平均荧光 强度一致时，补偿便调节完毕。 在做多色分析时，必须做荧光之间的补偿。方法如上，先准备各种标记的荧光阴性对照， 调节确定合适的放大电压。逐管加入各种荧光标记的特异性抗体与其他荧光的对照，然后调 节特异性荧光对每个荧光的补偿。 在日常工作中，我们可以用 cd4/cd8，或 cd3/cd4/cd8多色抗体来调节荧光补偿。现 将其原理及方法解释如下。 在人外周血中，存在有 t、b、nk等白细胞。当加入 cd3-pe-cy5/cd4-fitc/cd8-pe 三色荧光抗体时，会出现以下几种情况： cd3-/cd4-/cd8-细胞群：如 cd3+/cd4-/cd8-细胞群：如 cd3+/cd4+/cd8-细胞群：如辅助型 cd3+/cd4-/cd8+细胞群：如杀伤型 由此可知，无论对于哪一个荧光参数都存在阴性细胞群及单阳性细胞群；这就满足了调 节补偿的基本要求。已知不存在 cd3-/cd4+和 cd3-/cd8+阳性细胞，又已知 pe-cy5对于 fitc的干扰很小，所以不用考虑 cd3-pe-cy5荧光对 cd4-fitc、cd8-pe荧光的干 扰（不会有假阳性存在）。补偿调节如下： 1-2-21 cd3-pe-cy5、cd4-fitc和 cd8-pe荧光相互干扰的补偿 在许多实验中，会用到某一标记物进行设 ”门”情况。此时最终观察的单参数结果而非双 参数，所以往往会忽略其中补偿的问题。在这种情况下调节补偿的方法又略有不同，只要清 楚地理解补偿的形成及调节原理，便能解决问题。详细的方法见有关章节涉及设 ”门”的实验 方案。 第二章流式细胞术样品制备及分析技术 第 1节样本单细胞悬液的制备方法 一、新鲜实体组织样本的制备 fcm对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特 点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。尽管标本制备已 形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。在实体组织分散为单个细 胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。所以， 在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。现在已有专门的样 本制备仪（见图 2-1-1），但有些标本仍需要人工进行细胞分散。目前常用的分散组织细胞的 方法有如下 3种。 图 2-1-1流式细胞术自动细胞分离器（ bd，medmachine） （一） 酶消化法 1、作用原理： 对实体组织分散的作用原理主要有 3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维 等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质 物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有：蛋 白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。 胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽 的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞内和细胞 间不同组分有特异作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。 2、注意事项： ①酶需要溶解于适当的溶液中，而这些溶液不致于造成酶效价降低；②要注意酶的使 用浓度和消化时间；③要注意酶活性的 ph值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋 白酶在中性溶剂中活性不佳等；④要随时注意影响酶活性的其它因素，如酶的生产批号等。 3、方法学程序 （1）将适合于酶消化的组织置于离心管中； （2）将选好的酶溶液 1-2ml加入盛有被消化组织的试管中； （3）一般消化 20-30 min（恒温 37℃或室温），消化期间要间断振荡或吹打； （4）终止消化，收集细胞悬液，以 300目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速离心除去 细胞碎片； （5）将制备好的单细胞悬液进行进一步荧光染色后上机检测，或保存备用。 （二）机械法 机械法分散实体组织，用手术剪刀剪碎组织、用锋利的解剖刀剁碎组织或用匀浆器制成 组织匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用 300目尼龙网滤出单细胞悬液；采用搓网法也能获 得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以机械法常与其它方法配合使用。 1、剪碎法： （1）将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水； （2）用剪刀将组织剪至匀浆状； （3）加入 10ml生理盐水； （4）用吸管吸取组织匀浆，先以 100目尼龙网过滤到试管中； （5）离心沉淀 1000 rpm,3-5min，再用生理盐水洗 3遍，每次以低速（ 500-800 rpm）短时 离心沉淀去除细胞碎片； （6）以 300目尼龙网滤去细胞团块； （7）细胞用固定液固定或低温保存备用。 2、网搓法 （1）将 100目，300目尼龙网扎在小烧杯上； （2）把剪碎的的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直 到将组织搓完； （3）收集细胞悬液， 500-800 rpm离心沉淀 2min； （4）固定细胞或低温保存备用。 3、研磨法 （1）先将组织剪成 1-2 mm3大小组织块； （2）放入组织研磨器中加入 1-2 ml生理盐水； （3）转动研棒，研至匀浆； （4）加入 10ml生理盐水，冲洗研磨器； （5）收集细胞悬液，并经 300目尼龙网过滤，离心沉淀 500-800 rpm，1-2 min，再以生 理盐水洗 3 遍，离心沉淀； （6）固定或低温保存细胞悬液，备用。 （三）化学处理法 1、作用原理 化学处理法是将组织细胞间起粘着作用的钙镁离子置换出来，从而使细胞分散开来。 2、试剂的配制 （1） 0.2%edta配制：称 edta 0.2g，加入 100ml，封装高压消毒。置 0℃-4℃保存； （2）胰酶加 edta配制：胰酶 pbs（ph7.0）200ml，浓度 0.125%，edta 0.2g 加 pbs（ph7.0）100ml，浓度 0.2%。各取 40ml混合，分装置冰箱保存，用时过滤即 可使用。 3、实验方法 （1）将组织切成薄片，置入试管中； （2）首先加入 5ml，室温下 0.5h，离心弃之； （3）再加入胰酶 37℃恒温水浴振荡器内 30min； （4）用 300目尼龙网过滤，离心沉淀 1000 rpm，5min。再以生理盐水洗 2-3次； （5）细胞固定或低温保存备用。 以上几种分散细胞的方法都是目前对实体组织解聚的常用的方法。实验证明，用化学试 剂方法处理组织导致细胞成活率低，细胞产额低，细胞碎片和细胞聚集的量不稳定；化学试 剂可单独使用，也可与其它方法结合使用；机械法常常造成严重的细胞损伤，单细胞产量低； 酶学法、化学法对实体组织的分散解聚较理想，但对所测化学成分有不良影响。所以要根据 实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，才能获得理想的样本和更好的 fcm检测结果。 （四）注意事项 1、新鲜组织标本应及时进行处理保存，以免组织在室温下放置时间过长，产生中心组织 坏死以及细胞自溶，影响 fcm测定结果； 2、根据实验目的选择最隹的固定方法，以免由于固定剂的原因，造成 fcm检测结果的 不稳定； 3、酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、 ph值、浓度等方 面对酶消化法的影响。 4、需注意不同组织，选择相应的方法；如富于细胞的组织——淋巴肉瘤、视神经母细胞 瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，就不一定采用酶学法或化学法； 往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞； 5、在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤——食管癌、乳腺 癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好，因为胶原酶具有在 ca2+、mg2+存在或在血清状态下 不发生活性降低的特性。 二、组织活检、内窥镜取材标本单细胞悬殊液的制备 正常组织、瘤组织和淋巴结等活检组织以及内窥镜（胃镜、食管镜等）取材标本，由于 材料较少，制备起来比较麻烦。但其制备方法与实体组织基本相似。 1、取材后立即放入盛少许 pbs液青霉素小瓶中； 2、另取一只小烧杯，杯口用 300目尼龙网盖住并用线绳固定好，并用 pbs液湿润；取新 鲜组织标本置尼龙网上；因标本量较少，尤其是内窥镜取材只少要取 3、在操作前，先将剪刀用 pbs液浸润一下，然后开始剪碎组织； 4、先剪几下，视基本无组织块存在时，用原来装标本的青霉素小瓶中的 pbs液，冲洗细 胞均浆并过滤于小烧杯中；如果这时仍有可见组织块，再用剪刀剪碎，再加适量该 pbs 液冲洗，直至网上无组织块为止。这样可尽量多的收集细胞； 5、细胞加固定液或低温保存，备用。 三、石蜡包埋组织样本的制备 石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立，扩大了流式细胞术的应用范围。对大量临床随访 资料通过病理包埋组织的流式细胞术分析，可以重新得到深入研究和利用。现将常用的石蜡 包埋组织制备单细胞方法介绍如下。 1、实验方法： （1）把石蜡包埋组织切成 40-50um厚的组织片 3-5片，或用乳钵研成 0.5mm直径大小颗粒 状，放入 10ml的试管中； （2）加入二甲苯 5-8ml, 在室温下脱蜡 1-2 天，视石蜡脱净与否，更换 1-2 次二甲苯，石 蜡脱净后，弃去二甲苯； （3）水化：依次加入 100%、95%、70%、50%梯度乙醇 5ml，每步为 10 min，去乙醇，加 入蒸馏水 3-5 ml，10 min 后弃之； （4）消化：加入 2 ml 0.5%胰蛋白酶（ ph 1.5-2.0）消化液，置 37℃恒温水浴中消化 30 min， 在消化期间，每隔 10min用振荡器振荡 1次； （5）消化 30 min后，立即加生理盐水终止消化； （6）经 300目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第 2次消化； （7）收集细胞悬液，离心沉淀 1500 rpm ,再以生理盐水漂洗 1-2次，离心沉淀 500-800 rpm 去碎片； （8）保存细胞备用。 2、注意事项 （1）一定将石蜡从组织中脱干净，一般脱蜡第 1遍应在 12小时左右，第 2遍为 30min左 右。检测是否将石蜡已脱净的方法:是弃去二甲苯，加入无水乙醇，如果无絮状物浮 起，即可视为蜡已脱净；反，则蜡尚未脱净； （2） 消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞核被消化； （3） 切片不可过薄或过厚，过薄细胞碎片过多，影响分析结果；过厚造成脱蜡不理想。 （4）消化后的组织应先用眼科剪刀剪碎，然后再加胃蛋白酶消化， 30min，37℃，然后用 尖吸管吹打成悬液状； （5）消化后的组织悬液经过过滤后可能细胞数很少，这样就要将组织片放在 300目尼 龙网上，用底部圆滑的试管磨碎，再用 pbs液冲洗一下；如此反复，就能得到较多 的单细胞悬液。 四、外周血单个核细胞样本的制备 血液是天然的单个细胞分散的细胞悬液，血细胞在生理状态下呈分散的游离状态。它是 流式细胞分析的理想样品。血液中的主要细胞成分为白细胞、红细胞和血小板；而其中白细 胞主要成分又分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。但在血细胞中一般检测单个核细胞较为多 见。 1、外周血细胞样本制备方法的选择 一般检测细胞大分子成分—— dna、rna、蛋白质含量、基因表达蛋白等，多采用淋 巴细胞分离液分离法制备单个核细胞悬液。这样可以从血液中分离出单个核细胞——淋巴细 胞、单核细胞、幼稚血细胞和肿瘤细胞等。外周血免疫细胞、细胞因子、某些基因蛋白、细 胞表面标志检测可采用溶红细胞法。 2、单个核细胞样品制备程序 （1）取外周血2ml，肝素抗凝，用生理盐水将血稀释成4 ml ,混匀； （2）将稀释后血液沿试管壁徐徐加入 4ml淋巴细胞分离液到液面之上，勿用力过大，以免 造成血液与分离液混合，保持清晰的分层状态； （3）离心2000rpm,30min,室温18-20℃，离心后可见试管内的血液清楚的分为4 层，上 层为血浆层，中层为分离液层（单个核细胞所处于血浆层和分离液层中间），底层为 红细胞层，红细胞层上为粒细胞层； （4）用吸管将上层与中层之间的淋巴细胞层吸出收集到另1 试管中，用生理盐水洗2 遍， 每次均以 1500 rpm ,10 min ,弃上清后即得到高纯度的单个核细胞悬液； （5） 用适当的固定液固定或置低温冰箱保存待用。 五、骨髓细胞单细胞悬液的制备 1、制备方法 （1）无菌抽取骨髓液 0.5 ml； （2）将骨髓标本滴入 1000u/ml肝素抗凝的 1 ml pbs液中； （3）再加入 pbs液稀释至 10ml； （4）用吸管吸取 5 ml稀释骨髓液徐徐加入盛有 4 ml的人类淋巴细胞分离液液面之上； （5）在以上条件下，骨髓有核细胞分层在 pbs-人类淋巴细胞分离液之间形成的界面上； （6）吸取有核细胞层，加入到 10 ml pbs液中，混匀； （7）以 1000 rpm离心 5 min ，弃上清；收集骨髓细胞，加固定液或置低温冰箱备用。 2、注意事项 （1）抽骨髓液时，先将注射器针头、针筒、针栓用肝素浸润，抽取时力量适中； （2）在吸取淋巴细胞层时尽量少吸分离液，量应掌握在 300 ul左右，这样有利于洗去多 余的分层液； （3）溶红细胞的方法：以等量的蒸馏水加入到沉淀中，轻轻摇动片刻，见粉红色出现， 立即加入大量生理盐水，混匀，离心，去除上清即可。 六、培养细胞的单细胞悬液的制备 1、培养细胞的特征 一般细胞培养分为悬浮培养和贴壁培养，由于细胞的增殖，都有可能形成大小不等的细 胞团块或连接成片。如果两个或多个细胞粘连在一块或细胞碎片过多都将影响 fcm结果， 进而导致实验失败。所以，制备合格的培养细胞单细胞悬液十分重要。 2、培养细胞样品的制备程序： （1）将培养细胞用 0.04%乙二胺四乙酸二钠盐（ edta2na）或 0.29%胰酶消化 3-7min，（根 据室温情况而定），至光镜下见到贴壁细胞间出现筛状间隙为止），弃去消化液，加 pbs液； （2）用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中； （3）短时低速离心，即 800-1000 rpm，5 min； （4）弃上清，加 ph 7.4的 pbs液 5-8ml，低速短时离心，800-1000prm，3-5 min ；重复 2- 3次，以去除细胞悬液中的细胞碎片； （5）加少许 pbs液，将沉淀细胞轻轻吹打均匀。加固定液或低温保存待用。 七、脱落细胞样品单细胞悬液的制备 在临床工作中，可以收集到大量自然脱落细胞，这些细胞标本经过简单处理，便可成为 较好的单细胞悬液，提供流式细胞术分析。主要包括脱落细胞、胸腹水细胞、尿液、内镜刷 检细胞等。 1、食管拉网细胞的单细胞悬液的制备 将食管拉网器上的细胞洗脱到 20 ml pbs液中，以 1500 rpm离心后，再用 pbs液洗 2次，离心 500-800 rpm, 1-2 min，弃上清； 再加入 pbs液 5 ml，以 300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清； (3)加少许 pbs液混匀沉淀细胞，加固定液或低温保存，备用。 2、尿液脱落细胞的单细胞悬液的制备 （1）用一清洁器皿收集 24小时尿液，置 4℃冰箱中自然沉淀 2小时，轻轻倒去上清液， 留下少许带细胞的沉淀物，用吸管移至 10-20 ml离心管中； （2） 500 rpm离心 10min，去上清； （3） 加 pbs液 8-10 ml，以 1000 rpm离心 10 min ，去上清；重复再洗 1 次； （4） 再加 5 ml pbs液混匀，用 300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清； （5）再加少许 pbs液，混匀。加固定液或低温保存，备用。 3、胸、腹水脱落细胞的制备 （1）抽取胸、腹水 50-100 ml，加入 1000 iu/ml肝素液 1 ml，放盐水瓶中置于 4℃冰箱 中静置 6-12 h，弃去上清； （2） 将底部 10-20ml用长吸管移入试管中，用 pbs液洗 3 次，以 1500 rpm离心沉淀 5 min； （3）再加 5 ml pbs液混匀，用 300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清； （4）加少许 pbs液，混匀；加固定液或低温保存，备用。 4、冲洗液细胞样品的制备 （1）用 300-500 ml生理盐水冲洗膀胱,冲洗一定时间后,吸出冲洗液放入容器中于冰箱 内置 6-12 h； （2）取沉淀液 20-40 ml ,离心沉淀并以生理盐水洗 2 次, 吸上清； （3）加 10 mlpbs液，混匀；以 300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清； （4）过滤后 1000 rpm,10 min，离心沉淀，去上清；加固定液或低温保存备用。 第 2 节样品的荧光标记和检测分析 一、荧光标记原理 定量细胞荧光染色，要求细胞成分染色的均匀性，保证染色做到染料分子数与被染的某 种参量成一定的量效关系。在流式定量分析中，掌握好荧光染色液的浓度非常重要。为了更 好地说明这个问题，可以用下式表示： f=q(i-eεcl) 式中 f表示荧光强度， q表示光量子产额，i表示激发光强度，ε表示消光系数， c表示染 色浓度，l表示浓度厚度。当激发光增强时，荧光强度相应按比例增加；当荧光强度达到 1.0时，继续增强光密度，荧光不仅不会增加，还会造成结合到细胞上的荧光素发生猝灭现 象。一个荧光分子发射的荧光，有可能被邻近的分子吸收淬灭。由于这种淬灭现象，如果再 增加荧光染料浓度也不会使荧光强度增大。 1、荧光染料与细胞参量结合的方式 （1）共价键结合：dna链的连结之间被打开，形成与荧光染料分子共价键结合，这种结合 方式不十分稳固，冲洗过多易造成荧光分子丢失。例如异硫氢酸盐荧光素 (fluorescein isothiocyanate, fitc)、藻红蛋白（phycoerythrin, pe）等这些荧光染料。 （2）嵌入性结合：荧光染料分子直接嵌入到核酸分子的碱基对之间。这种方式结合紧密、 稳固，不易造成荧光分子的丢失。如碘化丙啶（ propidium iodide, pi）、溴化乙啶（ bromide, eb）等。 （3）结构亲合结合：以静电力结合，带正电核的荧光分子与带有负电核的核酸结构中的磷 酸基相互吸引而结合。这种方式结合极弱，易造成荧光分子丢失。例如吖啶橙与核酸单链结 合时，派若宁 y与单链核酸结合均系静电力结合方式。 2、荧光素发射荧光的基本原理 当应用流式细胞术对细胞表面或内部抗原进行检测时，除必要的抗体外，各种荧光素也 是必不可少的。它包括：单标记抗体荧光素、双标记抗体荧光素、三标记抗体荧光素，…… 等。荧光素发射荧光基本原理是：荧光素受到一定波度（激发波长）的激光激发后，其原子 核外的电子由于吸收了激光的能量，由原本运动处于基础态轨道跃迁到激发态轨道上运动， 然后当电子由激发态重新回到基础态时，释放出能量并发射出一定波长（发射波长）的荧光。 不同荧光素用不同的激发光波长的激发光来激发,所以要选择正确的激光器。例如，ascade blu 需用紫外线激光器，fitc和 pe等的激发波长均为 488nm，所以可用产生可见光的氩离子 激光器，而 pc5等的激发波长在红光范围，需使用发射 630nm波长红光的氦-氖激 光器。 另外，各种荧光素的发射波长也十分重要，据此可以确定其检测所需光电倍增管性质。 如 fitc，被激光激发后发射绿光，检测时要使用第一光电倍增管（即 pmt1）；pe则发射 橙色光，需用第二光电倍增管（即 pmt2）；pc5和 percp等，发射的是深红色光，这时需 选择第三甚至第四光电倍增管（即 pmt4）,等等。 3、常用荧光素的基本生物学特性： 主要荧光素包括：pi、eb、fitc、pe、pc5、percp、cy5、cy7、apc等。单色或双 色分析时，最常用的荧光素是 eb：都具有嵌入到双链 rna的碱基对中并有与碱基对结合的特异性。 为了获得特异的 dna分布，染色前必须用 rna酶处理细胞，排除双链 rna的干扰。 eb不能进入完整的细胞膜，因此又可以用于检测死活细胞。 eb各种理化性质相似， 但 eb的发射光光谱峰向长波方向移动，因而在作 dna和蛋白质双参数测量时，pi 的红色荧光和 fitc的绿色荧光更易于区分和测量。另外， dna分布的变 异系数（cv值）低，所以 pi 得到更广泛的应用。 （2） fitc：为一种小分子荧光素，其效率，即荧光强度，取决于溶液的 ph值，因此在 使用 fitc时，应注意溶液的酸碱度。 （3） pe：其分子量较大，为 240kd，故可能会对其它大探针产生空间位阻。但 pe的化 学结构非常稳定，有很高的荧光效率，并易与抗体分子结合。这里需要注意的是 pe作为天 然染料，因来源程序不同，可能造成荧光素结构上的微小差别，导致其特征的不一致。因此 用不同公司生产的 pe可能会得到不同的结果。 （4）其他荧光素单激光束三色荧光分析时，要求单激光激发，所选择的三种荧光素的发 射光波长应该有所不同。除 fitc（发射绿光），pe（发射橙光）外还应选择发射红光或深 红光的藻红蛋白-花青素（ phycoerythin and texes red tandem，pc5）、叶绿素蛋白（ chorophyll protein，percp）或藻红蛋白-德克萨斯红（phycoerythin and texes red tandem， ecd）。因为这些荧光素在受到 488nm的蓝光激发后，均发射出红色光或深红色的发射光。 ecd是由在空间结构上互补的两个荧光素分子通过共价键结合而成，组成一个荧 光分子。pc5由 cyanin 5 组成， texes red 组成。它们前一个分子的发 射光波谱与后一个分子的激发光波谱相重合，这样当前一个分子受激光激发后，产生的发射 光可直接激发后一个分子，最后由后一个分子的发射光体现出整个组合的荧光特性。因此， 从组成上说是两个分子，但表现为一个分子的物理性质。② percp是一种生活于深海区域 的鞭毛虫中发现的色素，其功能为将可渗透入深海的蓝光传递至鞭毛虫的叶绿素发色集团， 进而发出红光。需注意的是 percp为一单个分子。③别藻蓝蛋白（ allophycocyanin，apc） 和花青素 5（cyanin，cy5）这两种荧光素的激发光波长要求在 630nm左右，需第二激光束 来激发。各种荧光标记的抗体与细胞结合的的原理模式见图 2-2-1,常用染料的激发光及发射 光波长见表 2-2-1荧光标记抗体与细胞结合原理模式图 表 2-2-1常用荧光染料的激发光和发射光波长分布 荧光染料激发光.发射光.应用 indo-1 (unbound) 335 490 calcium flux indo-1 (bound to calcium) 335 405 calcium flux hoechst 0 dna analysis dapi 359 462 dna analysis alexa350 350 442 phenotyping percp 470 670 phenotyping r-phycoerythrin 480 578 phenotyping green fluorescent protein (gfp) 488 510 reporter molecule yo-pro-1 488 510 apoptosis analysis fitc 488 525 phenotyping fluorescein diacetate 488 530 cell viability alexa488 488 530 phenotyping sytox green 488 530 dna analysis snarf-1 488 530-640 ph measurement fluo-3 488 530 calcium flux dsred 488 588 reporter molecule pe-cy5 (tricolor, cychrome) 488 670 phenotyping pe-cy7 488 770 phenotyping ecd 488 620 phenotyping propidium iodide 495 637 dna analysis rhodamine 123 515 525 membrane potential yellow fluorescent protein (yfp) 519 534 reporter molecule lds-751 543 712 nucleated cell detection 7-aminoactinomycin d 546 655 dna analysis alexa 546 546 573 phenotyping cy3 550 565 phenotyping cmxros (mitotracker red) 560 610 mitochondrial membrane potential texas red 596 615 phenotyping to-pro-3 643 661 dna analysis alexa 647 647 667 phenotyping apc-cy7 647 774 phenotyping allophycocyanin (apc) 650 660 phenotyping 4、定量荧光染色的评价标准 特异性，荧光染料是否和所研究的细胞成分为特异性结合； 在相同实验条件下，荧光强度与检测的细胞成分呈严格的正相关关系； 使用荧光显微镜检查，荧光的分布是否具有一个核形态结构，荧光分布是否一致，并 可看到一个粗大的荧光颗粒 fcm分析评价，以 dna含量分析为例，在组方图上第一个峰（ g0/1细胞峰）与第 二个峰（g2m期细胞）是否成倍数关系。 5、影响样品荧光标记的因素：定量细胞学的荧光染色易受多种因素影响，以至导致不正确 的实验结果。其主要因素如下： ⑴温度的影响：在一般情况下，荧光染色的环境温度对结果有明显影响。因为温度升高， 可造成溶液粘滞性增加，溶剂和荧光染料分子动力加大，使荧光猝灭（随荧光染料浓度增加， 荧光分子被邻近分子所吸收而荧光量子产额降低的一种现象）的可能性也随之加大，这就使 荧光分子和其它分子之间相互碰撞机率明显增加；因此影响了荧光分子发光量子的产额。温 度升高时，荧光量减弱。一般在 20℃以下，荧光分子发光产额的变化不明显，基本保持恒 定。 ⑵ ph值的影响：荧光分子在溶剂中基本上处于离子化状态。因此，溶剂中的氢离子浓 度对荧光强度的影响是极大的。荧光染料发光最好条件是在溶剂中处于离子化或极化状态。 每一种荧光染料分子发光量的产额最高时均有最适 ph值，以保持荧光分子与溶剂间的电离 平衡。如果 ph值发生改变，可能造成荧光光谱的改变。也可造成荧光强度的降低。 ⑶荧光染料浓度的影响：在荧光染色过程中，必须保证使用的荧光染料浓度与荧光强度 呈严格的正相关关系。但是，每种荧光染料在溶液中随浓度增加，其发光功能都存在一种猝 灭现象。这主要是缔合分子的形成，缔合分子本身具有猝灭作用，是因为缔合分子中的电子 共振作用，而消耗了激发分子的能量而参与猝灭作用。所以，当溶剂稀释荧光染料分子之间 的相互作用完全消失时，荧光量子的产额最大，发射的荧光强度最强；当溶液浓度增加时， 荧光分子之间就发生碰撞效应，缩短了电子处于激发状态的时间，使得非辐射跃迁几率增加， 从而引起荧光量子产额下降。同时，荧光染料分子浓度过高，也容易产生内滤光效应。所以。 选择合适的荧光染料浓度，对于荧光定量检测技术是十分重要的。 ⑷杂质对细胞荧光染色的影响：杂质对荧光的猝灭作用，是由于溶剂中含一些不发光 物质。这些物质存在，使荧光分子受光激发后与其它分子相互作用，使荧光分了光量子产额 减少而造成猝灭现象；还有些杂质可以与荧光分子结合形成新的化合物，使吸收光谱发生改 变，使荧光量子产额降低。 ⑸细胞固定剂对细胞荧光染色的影响：一些插入性荧光染料在应用中需要使用一些固 定剂时，有些固定剂与细胞某些物质结合，干扰了插入性荧光染料与细胞成分的结合，造成 荧光发射强度的改变。如染色细胞 dna时应用醛类（戊二醛、甲醛等）固定剂，可使荧光 强度降低 50%左右；而醇类固定剂则相对影响较小。因此，对荧光定量检测中，细胞固定 剂的选择也是十分重要的。 ⑹其它影响因素：溶剂的性质、浓度对荧光的猝灭也有一定的影响。例如，光神霉素在 盐水溶剂中，nacl 1.9%以上时，对荧光强度有明显影响， 0.9-1.8%浓度时，荧光强度相似； &0.9%浓度时，荧光强度减弱。 因此在利用荧光染色技术检测细胞某种成分含量时，为了得到正确的测量值，就必须对 能影响荧光强度的众多因素进行严格控制，才能得到满意的结果。 二、细胞破膜剂的应用 1、细胞破膜剂应用的意义：用流式细胞仪检测细胞 dna、内抗原，如与细胞凋亡有关的 p53蛋白、bcl-2蛋白、及细胞内因子 il-4、ifn-r等，均需要首先使流动的、完整的细胞膜 产生可通透抗体的小孔，即所谓的破膜过程。破膜的好坏直接影响荧光染色的效果和结果的 分析，特别是在细胞内外抗原同时检测时，尤其重要。 2、细胞破膜剂的种类： （1）选择破膜剂的原则：①能保持细胞的形态，在用前向角 (fsc)/侧向角 (ssc)分析时， 能准确定位不同细胞种类；②细胞膜表面抗原的抗体结合能力保持良好，细胞表面抗原检 测可靠性高；③能同时准确地检测细胞内外的抗原。 （2）几种常见的细胞破膜剂： ① 0.05% 皂角素（ saponin）,② 0.1%曲拉通（ triton x-100）， ③ 70%乙醇（ ethanol）。 3、几种破膜剂对细胞形态的影响的对比：①经 3种破膜剂处理后，外周血细胞的散射光 图对比发现，用皂角素破膜，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞 3群细胞可清晰分辨，其相对百 分比与未处理的血细胞相似；而用 triton x-100和乙醇处理者，淋巴细胞和单核细胞群很难 分开，尤其是乙醇处理时，单核细胞与粒细胞已完全重合在一起，这主要是皂角素可较好的 保持细胞形态，而其它两种破膜剂会使细胞皱缩的结果；②破膜剂影响抗原的表达：以 cd8抗体标记为例，比较 cd8标记后再破膜和破膜后再标记 cd8，结果发现：表面抗原标 记后，细胞再破膜，几种破膜剂对 cd8表面抗原的表达均无明显影响；如果先破膜，后标 记，triton x 100和乙醇破膜则使表达 cd8抗原细胞比例和每个细胞上抗原表达量急剧下降； 而皂角素对这两个指标均无明显影响。对 fas的研究还发现， triton x-100和乙 醇对其表达有显著影响，使其表达率下降；这三种破膜剂对细胞内 il-2检测结果影响不大； 检测 ifn-r时，皂角素与乙醇相似，而用 tirton x-100，则其表达率显著降低；检测 tnf-α 时，皂角素的敏感性显著高于另外两种。总之，皂角素是比 triton x 100及乙醇更理想细胞 破膜剂。 三、溶血剂的应用 溶血，裂解红细胞是流式细胞术分析白细胞的先决条件。溶血不好，白细胞群不能很好 分开。所以，溶血好坏直接影响检测结果。为此，必须对溶红细胞过程进行全面了解并严格 控制溶解红细胞的条件。 1、溶解红细胞的基本原理：首先，使溶血剂进入血细胞，包括红细胞和白细胞；然后，加 入比溶血剂渗透压低的溶液，这样使细胞内外渗透压不等，使渗透压低的溶液能充分进入细 胞内。又因为白细胞膜抗性较好，能保持细胞完整形态；而红细胞膜抗性较差，当低渗透溶 液进入红细胞后，最后将红细胞膜涨破，从而达到溶解红细胞的目的。 2、使用溶血剂的注意问题：①溶血剂与血细胞充分混匀；②溶血时间不宜过短或过长 5-15 min，见血液完全透明后方可；③采用不同厂家溶红细胞液，严格按各厂家说明 书上步骤进行操作。 3、溶红细胞液制备方法 红细胞溶解液主要用于有核细胞表面标志性蛋白抗原的检测。它是目前应用最广泛的 制备单个核血细胞悬液的重要方法之一。各厂家均有商品上市，如联科生物公司生产的 caltagcal-lyse溶血剂。同时，各实验室也自行配制，具体配制方法如下。 碳酸氢钾（khco3）1.0g 氯化铵（nh4 cl） edta-na2 0.037g 加双水至 1000ml，即为工作液。 第三节免疫细胞的样品制备和分析 一、基本原理： 机体免疫状态是机体是否罹患疾病的重要指标，目前多采用流式细胞术来监测机体的免 疫状态，其中最重要的指标是 t、b和 nk淋巴细胞的水平。其中 t细胞又主要包括 th和 ts细胞亚群 (highlight) 。cd3细胞代表外周血中总的成熟 t细胞，理论上应约等于 cd4+细胞和 cd8+ 细胞的总和。但我们检测患者 t细胞及其亚群时，往往出现 cd4+加 cd8+细胞之和大于 cd3 的情况。这是因为 cd4+细胞其实包括两面部分： cd3+/cd4+细胞（真正的 th细胞）和 cd3-/cd4+细胞（非 th细胞）；cd8细胞也包括两部分细胞：cd3+/cd8+细胞（真正 ts细 胞）和 cd3-/cd8+细胞（非 ts细胞）而后者又可以分为两组：一组为 cd3-/cd8+/cd（16+56） +细胞（即 nk细胞的一部分）；另一组为 cd3-/cd8+/cd（16+56）-（一群未知细胞）。由 此可见，真正的 th细胞是 cd3+/cd4+细胞，真正 ts细胞是 cd3+/cd8+细胞若使用 cd4 或 cd8单标单抗或 cd4与 cd8双标抗体来检测 th和 ts，而不用 cd3抗体进行限定，测 出的结果必然会偏离真实值。尤其当患者 nk细胞明显增加时，会使 cd4细胞和 cd8细胞 的总和远大于 cd3+细胞因此，一定用三色荧光标记才能分析真正的辅助性 t细胞和抑制性 t细胞 (highlight) 。首先在淋巴细胞中识别出 cd3细胞，然后在 cd3细胞中再区分 cd4+和 cd8+细胞。 自然杀伤细胞（nk），又称裸细胞，因其表面没有类似 t细胞和 b细胞的表面标志，后来 随着免疫力学的发展，发现 nk细胞的一些表面标志，如 cd16 (highlight) 、cd56等，但单用 c在先和 cd56的抗体无法正确鉴定出 nk细胞，因此必须使用 cd（16+56）抗体。这里还有一点必 须引起足够重视，即 nk细胞一定是 cd3阴性表达细胞。所以 cd3-/cd（16+56）+细胞才 是真正的 nk细胞。根据是否表达 cd8 ，又可将 nk细胞分为 cd3+/c左+/c在先+56）+ 细胞（前面已提及，这部分细胞在 nk细胞中所占比例较小，因此一般不会影响 cd8的比 例）和 cd3-/cd8-参政+56）+细胞（这 nk细胞的主要成分）。b细胞的表面标志是 cd19， 理论上 cd3-/cd19+细胞才是真正的 b淋巴细胞。但实际检测中， cd3+/cd19+细胞很少， 可以忽略不计。所以 cd19+细胞就是 b淋巴细胞。 ` 利用抗原抗体特异性反应原理，将不同单克隆抗体设法带上各种荧光染料作为荧光标记 （荧光探针），而这种荧光探针与单克隆抗体能牢牢结合；当细胞被激光器发射的激光照射 后，细胞膜的抗原抗体复合物上的荧光探针可以发射出不同光谱的继发荧光，带荧光探针的 单克隆抗体与细胞表面相应抗原的结合的继发荧光量转换成电信号，这就代表了细胞表面的 抗原量；这些荧光通过流式细胞仪的识别和分辨，从而实现对细胞表面抗原的定量检测。细 胞免疫反应一般分两种：直接免疫反应，即细胞表面抗原与带荧光探针的单克隆抗体特异结 合的免疫反应；间接免疫反应，细胞表面的抗原与单克隆抗体结合，带荧光的第二抗体又与 抗体结合，也使这个抗原-抗体复合物也带上荧光探针。 图 2-3-1同型对照用于设定十字门的位置。 要求：双参数直方图左下区域，即 r3区的细胞需为总细胞数的 98%-99%。因此，图 2-7-1之 1a的 r3区中包含的细胞过多 (99.95%)，而图 1b则细胞过少 (97.52%)。图 1c的十字 门位置适当。有时在右上区域(r2区)的对角线位置处会出现额外的细胞群，即通常所说的 “火箭峰”，这时，十字门的交叉点应该设在 r3区中接近阴性细胞群的位置(如图 1d)。只有 在这种情况下，才允许 r3区中的细胞群比例低于 98%. 二、淋巴细胞亚群分析： 1、双色分析方案：见表 2-3-1 cd45-fitc/cd14-pe cd3-tc-cd4-pe- cd8-fitc cd3-fitc/ cd16+56-pe control igg2a-fpt 表 2-3-1双色法检测外周血 t、b、nk细胞试剂组合 tube number fitc pe use 1 cd45 cd14光散射坐标设门 2 cd3 cd19总 t和 b淋巴细胞 3 cd3 cd4总 t和 cd4阳性 t淋巴细胞 4 cd3 cd8总 t和 cd8阳性 t淋巴细胞 5 cd3 cd16 and cd56总 t和 nk细胞 2、三色分析方案：见表 2-3-2 管 a：cd45/cd14 确定 fs cvs ssc 中淋巴细胞门位置（详见下），此管对于自配溶 血剂用户必做此质控管。 管 b：阴性对照管，用来设置各 pmt电压和阴性区域。 管 c：cd3/cd4/cd8三色检测管，监调节荧光补偿之用。 管 d：cd3/cd16+56/cd19三色检测管。 表 2-3-2三色法检测外周血 t、b、nk细胞的试剂组合 number fitc pe pe-cy5 use 1 cd45 cd14 x光散射坐标设门 2 cd8 cd4 cd3 (highlight) t细胞及其亚群 3 cd3 cd16 and cd56 cd19 nk细胞及 b细胞 cd45和 cd14在白细胞上有着不同的表达，固它们可用来在光散射坐标上区分淋巴细 胞群体或其他细胞。一个适当的分型方案应能够提供最精确地、明确地区分出各类细胞亚群。 方案中所选抗体应能够最大限度地反应出整个标本中细胞的信息，提供样本管之间的对比质 控来保证各个测定管之间的结果的一致性。方案设计中不仅要检测阳性标本，还要包括阴性 群体来作阳性标本荧光强度的对照。美国疾病控制中心制定了一套检测 t淋巴细胞亚群的 方案，可作为参照来检测样本。 3、用 cd3/cd19区分 t淋巴细胞和 b淋巴细胞 在多色免疫分型分型中，阴性细胞群体不仅用来区分阳性细胞群体，它还可以从双阳性 细胞中区分出单阳性细胞。鉴于此，简单的同型对照细胞并不能完全作为设定荧光阳性界线 的参考细胞群。在 cdc推荐的淋巴细胞分型方案中，对照细胞群体运用的是相互没有交叉 的 t、b淋巴细胞。 ① cd3是 t细胞特异性抗原，cd19则可用来识别 b细胞。如运用 cd3/cd19双标试剂， 应没有 cd3和 cd19双阳性细胞群体存在。因此当运用 cd3/cd19双染色时，只会出现单 阳性细胞，通过此管可设定机器设制，为后续要观察双阳性细胞的检测管作对照。 ② cd3、cd19阳性表达为独立的阳性细胞群体。如出现双阳性细胞均视为假象。这样就 可不用同型对照来设定阴性或阳性界线。其中单阳性细胞群体提供了设定阳性界线的标准。 此外在 cd3/cd19检测时，还会有双阳性细胞群体的存在，这些是 nk细胞。这些细胞又提 供双阴性群体的对照。（有时检测时会出现双阳性细胞，这是由于 t细胞和 b细胞粘附时同 时通过仪器的检测区而造成的双阳性结果） ③ cd3/cd19不仅可用来设定标本的荧光的阴性和阳性界线，它还可用来检查仪器的补 偿设置和非特异性结合。在用这个组合进行检测时，会出现三群彼此独立的细胞群，如细胞 分群不清或位置发生偏差则要对样本进行仔细分析。 4、运用 cd3/cd4来鉴定 cd4+t淋巴细胞 如同其他许多单克隆抗体一样，抗 cd4抗体并不是完全只与辅助/诱导性 t细胞发生反 应，它还会与单核细胞结合。因此如要鉴别 cd4+的辅助/诱导性 t细胞则需要加入第二种 抗体来区分辅助/诱导性 t细胞与单核细胞。 (1) 首先用 cd3来区分全部 t细胞。cd3/cd4双阳性的为真正的辅助 /诱导性 t细胞。这 此细胞主要是 hiv病毒感染对象。在 hiv感染后，随着疾病的发展出现免疫抑制后，这群 细胞会明显下降；在临床中，对 hiv的鉴测主要依靠检测这群细胞的数量。 (2) cd3-/cd4+细胞群体是由单核细胞组成的。这些细胞相对于 cd4+和 t细胞来说弱表 达 cd4，在光散射参数的位置分布也较广。 cd3/cd4抗体组合能完全区分将 cd4阳性辅助 /诱导性 t细胞与 cd4阳性的单核细胞相区分开来。因为 cd4+t细胞能与单核细胞完全分 离，固在光散射坐标上设淋巴细胞 ”门”时，”门”可设得大一些，即使包含了单核细胞或其他 细胞都不会影响检测值。 (3) 此管也可检测补偿及非特异性结合情况。cd3+/cd4-细胞群体应明显地与 cd3/cd19 中 cd3+细胞群位置相重合。 cd3/cd8鉴定 cd8+t淋巴细胞 cd8的表达不只限于 t-细胞毒性/抑制细胞，这种抗原在部分 nk细胞上也能检测到， 故 cd3一起来鉴定 t-细胞毒性/抑制细胞。 （1）同时表达 cd3/cd8的细胞群才是真正的 cd8+t淋巴细胞， cd8的表达 包括弱阳性和强阳性部分。cd8的表达经常与阴性细胞群体相延续。因此 cd8阳性细胞检 测群依赖于仪器灵敏度，正确补偿的建立，以及恰当地设定阴性细胞群体。 cd3-/cd8+细胞包括一部分 nk细胞和少数粒细胞。这些细胞弱表达 cd8+，由于 缺少 cd3，易于从 cd3+/cd8+ t淋巴细胞相区别。 （2）双标试剂可以用来检查补偿设制和非特异性结合情况。双阴性细胞可视作内部的阴 性对照。cd3阳性群体应与 cd3/cd19、cd3/cd4中的 cd3阳性群体处于同一位置。 （1） cd16(fcriii)表达于大多 nk细胞上,但也表达于中性粒细胞上.这种抗原在 nk细胞 的表达比较弱并在 nk细胞活化时丢失,。 （2） cd56表达于大多数的（但并不是全部） nk细胞上, 也表达于一些 t淋巴细胞上。 与 cd3联合使用 cd3+/cd56+ t淋巴细胞和 cd3-/cd56+nk细胞。 （3）联合使用三种单抗能最完全的鉴定所有的 nk细胞. nk细胞或表达 cd16,或表达 cd56,但它们不表达 cd3。cd16和 cd56联合使用,根据荧光强度可将 nk从双阴性细胞 中区分出来。这样运用该组试剂，nk细胞可形成独立的群体与其他细胞相区分。 7、样本检测中的内部质控： cd3的检测数量 cdc推荐的方案来检测淋巴细胞亚群，这个方案中的检测管能够提供很好批间 质控： （1）因为所有测定管中都含的 cd3，所每管中的 cd3数量的差异不应超出实验室中可 接受 cv值范围。如去除实验室 cv影响，测定管中 cd3的最高值与最低值不应相差 3%以 上。如差值大于 3%则要对数据作进一步分析，找出原因。 （2）一般来说，每个测定管中 cd3的数量是极为相近的。如出现偏差，要着重检查形态 学”门”（fsc vs ssc）中的位置，其中细胞数量或形态是否一致；极有可能偏差是由于 ”门” 的位置不一致造成的。此外，要确保所加试剂量前后一致，阴性对照界线设置要正确。 （3）如在排除上述原因后，差异仍大于 3%，则标本要弃用。 8、淋巴细胞亚群数据分析及质量控制 使用以上试剂可供区别出 t、b、nk细胞： （1）t细胞 nk细胞百分比总和应等于 100%的淋巴细胞，但在实际中由于在 fscvs ssc中淋巴细胞设”门”中，会混入细胞碎片及单核和粒细胞，所以很难达到 100%的 比例。 （2）如运用 cd14/cd45设门来确定淋巴细胞 ”门”，则 cd3细胞百分比 +cd19细胞百分 比+cd3-/（cd16+56+）细胞百分比应等于 cd45/cd14中淋巴细胞百分比± 5%，最大不得 超过±10%。 9、外周血免疫细胞检测的实验程序 （1） 取 100μl 1000u/ml肝素抗凝静脉全血，置于 fcm测量管中； （2）直接标记法：加入带荧光标记的鼠抗人目的单克隆抗体试剂10μl，充分混匀，在 4℃冰箱中反应 30 min； 间接标记法：加入不带荧光标记的鼠抗人目的单克隆抗体试剂 10μl，充分混匀， 反应 30 min；再加入带荧光标记的羊抗鼠抗体，反应30 min； （3） 再加入 2 ml溶红细胞液，充分混匀，在4℃冰箱中反应5-10 min； （4） 以1500prm离心5min，去上清； （5） 用生理盐水洗 1遍，收集细胞，上机检测。 10、外周血免疫细胞检测的注意事项 人体免疫细胞的检测，主要通过细胞表面标志——血细胞表面分化抗原的免疫分析来实 现的。在分析免疫细胞时注意以下几点： （1）细胞分化抗原——细胞表面标志的表达方式：可以采用两种方式来表达，即细胞荧光 强度和阳性细胞百分比；①细胞荧光强度表达，即在细胞分布的直方图上，细胞巅峰所处 荧光道数；②阳性细胞百分比表达，即在检测细胞中，所有标记阳性细胞占检测细胞的百 分比。 （2）样品检测的同型对照和正常对照：只有设同型对照和正常对照，才能增加样品检测结 果的准确性和客观性。同型对照是指：所应用的单克隆荧光标记抗体 (染色试剂)——即携带 特异性单克隆荧光抗体的免疫球蛋白的空白对照，即只带荧光标记相同的免疫球蛋白，以此 作为对照并在分析样品时，减去同型对照的阳性结果。样品正常对照是指：未加任何处理的 正常组织细胞 ,作为实验对照样品 ,在分析细胞时，只有与正常对照相比，才能得出检测细胞 的异常程度或处理后样品的变化趋势。 第四节 dna含量检测样品的染色和分析 dna 含量检测是流式细胞仪最早，且目前仍然是其最为广泛的应用指标之一。恶变肿瘤 细胞一般多出现异倍体，有很多研究证明 dna含量分析对人肿瘤的诊断预后有很高的价值。 dna含量分析还可提供细胞周期信息，所以它也可作为细胞生物学的一种有用工具。尤其对 细胞毒性药物的研究很有价值。dna含量常和某种细胞周期相关蛋白同时检测，来分析细胞 处于某一特定周期阶段。 使用一些核酸染料和 dna结合可对 dna进行定量分析，但这只能反映细胞周期中的某一 静态情况，而用 brdurd脉冲标记（pulse-labelling）细胞及其抗体的使用或结合连续标记 brdurd和 hoechst33258染料则可以观察细胞循环过程中的一动态变化过程。 在生物细胞中，dna含量是比较恒定的参量，但 dna含量随着细胞增殖周期各时相的不 同而发生明显的变化。g0期细胞被认为是不参与增殖周期循环的一群细胞，即为静止细胞， 其细胞 dna含量为较恒定的 2c值，g1期细胞与 g0期细胞 dna值相同，均为二倍体 dna 含量，当细胞 dna倍增结束，进入 g2期，最终进入 m期，在 m期分裂为两个子细胞之 前，g2和 m期细胞的 dna含量均为恒定的 4c值，即为四倍体细胞群。 一、dna含量样品的制备： pi或 eb荧光染色方法，目前市场已有试剂盒出售，十分方便；但也可以自行配制试剂。 用 pi综合染液做细胞 dna含量一步法染色程序如下：① pi综合染液的配制：（100ml） pi 5mg、rnaas 2mg、1.0% triton x 100 0.5ml 、生理盐水 5 ml、枸橼酸钠 100mg、加 蒸馏水至 100ml，调 ph 7.2～7.6，置 4℃冰箱中避光保存备用。②将单细胞悬液或加固 定液细胞悬液离心沉淀弃之，用 pbs洗涤 2 次，调细胞浓度为 1×106，加 2 ml pi综合染 液；③置 4℃冰箱，染色 30 min；④离心洗去 pi染液，加少许 pbs液，上机检测。 二、细胞 dna含量的分析 (modifit lt 2.0)细胞周期分析软件 ) 1、dna倍体分析的理论依据： 在生物细胞中，dna含量是比较恒定的参量， dna含量随着细胞增殖周期各时相不同 而发生变化。g0期细胞被认为是不参与增殖周期循环的 1群细胞，即为静止细胞，其细胞 为恒定的二倍体 dna含量（ 2c）；g1期细胞具有增殖活性，参与细胞周期循环， g1期细胞 与 g0期细胞 dna含量相同，均为 2c；当细胞进入 s期后，dna含量逐渐增加，从 2c→ 4c，一直到细胞 dna倍增结束，进入 g2期，最终进入 m期。在 m期分裂为 2个子细胞 之前，g2 和 m期细胞的 dna含量均为恒定的 4c，即为四倍体细胞。 荧光染料和细胞 dna分子具有特异性结合，且有一定的量效关系：① dna含量多少与 荧光染料的结合成正比；② 荧光强度与 dna分子结合荧光素多少成正比；③ 荧光脉冲与直 方图的通道值成正比。因此，fcm-dna定量分析1个细胞增殖群时，可将二倍体 dna含量分 布组方图分为三部分，即 g 0/1、s、g 2m。g0/1和g2m细胞峰的 dna分布均为正态分布，s期可 以认为是一个加宽的正态分布。 癌组织都应该含有一定比例的正常二倍体细胞：① 癌组织源于正常组织，可能残存一 些同源组织正常细胞；② 癌组织的血液供应和支持组织往往是从正常组织延伸过来的，存 在一些纤维母细胞、血管内皮细胞及血细胞等；③ 机体免疫监视功能，大量浸润的淋巴细 胞、巨噬细胞等。且在癌组织 dna直方图上（见图 2-4-1），异倍体峰前总可以见到 1个或 大或小的二倍体峰位的 g0/1细胞峰。另外，显微图象分析仪做倍体检测时，都采用组织中淋 巴细胞做对照。 图 2-4-1肿瘤组织细胞 dna直方图 （dna异倍体 g0/1细胞峰前有 1个小的 dna二倍体细胞峰） 2、dna倍体的命名原则： 流式细胞术分析肿瘤细胞 dna倍体时，应根据 dna直方图、 g0/1峰峰位和 dna指数 （dna index, di）来确定 dna倍体类型。 dna倍体分为单干系和多干系，来自单个细胞 突变后的肿瘤，发展为 dna单干系肿瘤，可能为二倍体或者是单异倍体肿瘤；来自多个细 胞突变后形成的肿瘤或者肿瘤在发展过程中出现多克隆 dna干系细胞的肿瘤为多克隆肿 瘤。另外，在同一个肿瘤的不同区域、或原发肿瘤和继发、或转移灶、或随肿瘤病程发展、 或经治疗的肿瘤灶，其 dna倍性可能有所变化，这种倍体类型的差异，称为 dna倍体异 质性。 3、dna倍体分类的分析参数： dna指数（dna index，di） 被分析细胞 g0/1期细胞峰顶荧光道数 正常二倍体 g0/1期细胞峰顶荧光道数 细胞周期各时相细胞比例：静止期 /dna合成前期（ g0/1期）、dna合成期（ s期）、 dna合成后期 /有丝分裂期（g2m期）； ③增殖活性：包括 s期细胞比例（s-phase fraction，spf）和增殖指数（proliferous index, spf = ×100 % g0/1+s+g2m pi = ×100 % g0/1+s+g2m ④细胞凋亡指数 (apoptosis index, ai)：dna二倍体细胞 g0/1峰前亚二倍体峰细胞占 分析细胞的百分比（%）。 4、细胞 dna倍体具体分类方法： 用 fcm检测肿瘤细胞 dna含量时，是以肿瘤组织中 dna二倍体细胞作内部参考细胞 来计算肿瘤细胞 dna指数（ di）；以 di值和 dna干系数量不同对肿瘤组织 dna倍体分 类如下： 单克隆 单异倍体 肿瘤起源学说 异倍体 非整倍体 多异倍体多克隆 图 2-4-2 dna倍体分类与肿瘤克隆起源 （1）二倍体（ diploid, d）：在组织细胞中只有 1个 dna干系细胞，di=1.00； （2）近二倍体 (near-diploid, nd)：在组织细胞中有 2个 dna干系细胞，其中 1个干系细 胞 g0/1峰峰位在 dna二倍体细胞峰位上，di=1.00；而另一个 dna干系细胞， di≠1.00， 但在 0.90-1.10之间，该细胞峰为近二倍体细胞。 （3）四倍体 (tetraploid, t)：在组织细胞中有 2个 dna干系细胞，其中 1个 dna干系细 胞 g0/1峰峰位在 dna二倍体细胞峰位上，di=1.00；而另一个 dna干系细胞，di值在 1.90-2.10之间，该细胞峰为四倍体细胞。 （4）非整倍体 (aneuploid, an)：在组织细胞中有 2个 dna干系细胞，其中 1个干系细胞 g0/1峰峰位在 dna二倍体细胞峰位上， di=1.00；而另一个 dna干系细胞的 di为 &0.90 或 &1.10，但除外 t细胞，该细胞峰为非整倍体细胞。 （5）多异倍体 (multiploid, m)：在组织细胞中有 3个或 3个以上 dna干系细胞，除有 1 个 dna干系细胞 g0/1峰峰位在 dna二倍体细胞峰位上，di=1.00外；还有 2个或 2个以上 dna异倍体干系细胞，这些细胞群被称为多异倍体细胞。 5、dna倍体异质性分析 （1）基本概念：肿瘤 dna倍体异质性，是指在恶性肿瘤的不同部位组织中， dna克隆 干系分布明显不同者，存在 dna倍体异质性，该肿瘤为 dna异质体肿瘤；肿瘤不同部位 组织的 dna克隆干系相同者，则为 dna同质体肿瘤。当然， dna倍体异质性分析也适用 于对肿瘤原发灶和浸润灶、肿瘤原发灶和转移灶、肿瘤原发灶和复发灶之间 dna倍体的关 系分析，即 dna倍体异质性分析。 （2） dna倍体克隆干系的判断标准：在不同肿瘤组织中，在细胞 dna直方图上，原则 上其异倍体 g0/1期细胞 di值之差≧0.2以上时，或 di值之差虽然不大于 0.2,但可分为明显 2个细胞峰者,均为不同克隆细胞；其 di值之差小于 0.2时，则为同一克隆细胞。 dna倍体 同质体包括：dna二倍体同质体肿瘤， dna近二倍体同质体肿瘤， dna四倍体同质体肿 瘤，dna非整倍体肿瘤和 dna多异倍体同质体肿瘤。而 dna异质体肿瘤则包括： dna 二倍体与各种 dna异倍体的组合或各种异倍体类型之间的组合。 （3） dna倍体异质性分析的临床意义： dna倍体异质性是恶性肿瘤的的重要生物学特性 之一。如果患者是 dna异质性肿瘤，这表明它是多克隆起源的、肿瘤恶性度更高；而且在 肿瘤治疗时，增加了治疗的难度和复杂性；在肿瘤预后上，增加了肿瘤的危险性。 6、细胞动力学分析方法进展 （1）第 1代细胞周期分析方法：dna合成与有丝分裂来确定细胞周期的时相和细胞动力 学——采用同步化细胞氚标记胸腺嘧啶核苷掺入法，通过放射自显影技术，分析 dna合成 期及各时相时间。 （2）第 2代细胞周期分析方法：利用细胞 g0/1、s和 g2m期细胞核糖核酸含量（ dna和 rna）分布不同的的特征性差异，检测非同步化的活性大分子含量的变化——以 dna或 dna/rna荧光探针染色，用流式细胞术检测细胞周期各时相细胞比例。后来以 brdu、 pcna、ki67等方法标记进入细胞增殖细胞的方法——便于细胞复制与分期分析。 （3）第 3代细胞周期分析方法：细胞周期分子调控制机理（细胞周期检测点等）、多元 化的细胞周期归宿（如静止、分化、凋亡、增殖）联系在一起。近年，一些细胞周期调控基 因产物的发现（包括：cdks、cyclins、ckls,等）。细胞周期的新理论与新技术包括： ①突破经典的以 dna合成、有丝分裂为标志的细胞周期分析模式，转向以时相性驱 动分子机制为基础的细胞周期分析（cyclin e+a技术）； ②细胞周期检测点的分析（ cyclin域值技术）； ③真正意义上的细胞增殖分析（双 cyclins技术）； ④细胞周期时相性细胞凋亡的分析（ pa技术）； ⑤细胞增殖与细胞凋亡同步分析（即调亡 /增殖比率分析）（cyclin/sub-g1技术） ⑥非时相性 cyclins分析（双光源三参数 cyclin分析技术，分选后 westerm blot技术）。 新一代细胞周期分析理论与方法为细胞生物学、肿瘤细胞生物学、新药研究提供新技 术平台；又揭示了生物学里更深的科学问题。 第五节细胞凋亡的检测和分析 细胞凋亡（apoptosis，apo），又称细胞程序性死亡（ programmed cell death ,pcd），是 指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主 动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程（见图 2-5-1）。细胞凋亡是生物体中 一种普遍存在的现象。胚胎形成、衰老和损伤细胞细胞的清除、自身反应性 t淋巴细胞的 清除以及肿瘤的发生、发展和转归等都与细胞凋亡有关。另外在干细胞最终分化成成熟的血 细胞的一系列过程中，并非每个细胞都能够走到终点，相当一部分细胞甚至绝大部分细胞都 会在中途凋亡；胸腺的 95％存活不到成熟 t细胞阶段；相当数量的原始和幼稚红细 胞在骨髓中发生“原位溶血 ”；这些生理或病理过程都与细胞凋亡密切相关。 在细胞凋亡过程中细胞形态学的变化 在细胞坏死过程中细胞形态学的变化 4-8-55细胞坏死和细胞凋亡的形态学比较 细胞凋亡在形态和生化上有其明显的特征。在形态上，早期细胞核固缩、染色体边集在 核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折、卷 曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏。最明显的特征是 mg2+依赖的骨源性核酸酶 的激活，使细胞核染色体从核小体间断裂，形成由大约为 180～200bp或其多聚体组成的寡 核苷酸片断，琼脂糖凝胶电泳上形成特征性的 “梯状带”。凋亡细胞形态上的改变影响它们 的光散射特性。在流式细胞仪上，前向角散射光与细胞大小有关，而侧向角散射光反映的是 光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小， 故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。 2-5-1细胞凋亡调控示意图 此外，细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧 向角散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前向角散射光增大；侧向角散射光在细 胞坏死时也增大，因此可根据前向角散射光和侧向角散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需 要注意的是，根据前向角散射光和侧向角散射光判断凋亡细胞的可靠性 ,将受被检测细胞形 态上的均一性和核胞浆比率影响较大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡 的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主 要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处 理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。 检测细胞凋亡的方法很多，常见的有电镜或光镜下的形态观察、细胞 dna提取物的 dna ladder电泳实验、细胞核小体相关 dna片段的检测等。根据细胞凋亡过程中的时相 变化，流式细胞术用于细胞凋亡检测的方法主要有如下几种： 1、早早期细胞凋亡的流式细胞术检测：半胱氨酸蛋白酶 3（caspases-3） caspases-3又称半胱氨酸蛋白酶 3，是细胞凋亡信号传导通路中的 ice蛋白酶家族的重 要成员，在细胞凋亡发生的早期被激活。ice家族主要通过两种途径来引起细胞凋亡的发生： ctl）活化后大量表达 fas配体(fas l)，fas l和靶细胞表面的 fas结合， 通过 fas分子胞内段的死亡结构域，激活 caspase 8，再激活一系列 caspases，引起死亡信 号的逐级转导，最终激活内源性 dna内切酶，使核小体断裂，并导致细胞结构毁损，细胞 凋亡。② ctl细胞颗粒胞吐释放颗粒酶，可借助穿孔素构筑的小孔穿越细胞膜，激活另一 个 caspases10, 引起 caspases级联反应，使靶细胞凋亡。不管是由 caspase 8还是由 caspase 10 启动的 caspases 级联反应，都要经过 caspase 3而向下逐级级联。因此，临床常用 caspase 3 来检测早早期的细胞凋亡。 图 4-8-16细胞凋亡信号传递系统示意图 2、早期细胞凋亡的流式细胞术检测： annexin v-fitc/pi法： 正常细胞膜磷脂的分布是不对称的，膜内表面含有带负电的磷脂（如磷脂酰丝氨酸， ps），而膜外表面含有占绝大多数的中性磷脂。在细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞 膜内部的磷脂酰丝氨酸（ps）迁移到细胞外层表面，巨噬细胞就是通过识别凋亡细胞表面 细胞的磷脂酰丝氨酸将凋亡细胞或凋亡小体吞噬，保护机体避免因细胞内部暴露引起的炎症 反应。 annexin v是一种对 ca2+依赖，对 ps有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针 识别细胞膜表面是否有 ps，从而识别凋亡细胞。由于坏死细胞也可能在细胞膜表面出现磷 脂酰丝氨酸，又在细胞凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其初期。凋亡细胞对 所有用于细胞活性鉴定的染料（如 pi）有拒染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞 pi着染而产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此， 在细胞凋亡的早期 pi不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。在流式细胞术 双参数散点图上左下象限显示活细胞，为（ annexin v-/pi-）；右上象限是非活细胞，即坏死 细胞，为 annexin v +/pi+；而右下象限为凋亡细胞，显现 annexin v +/pi-。 2-5-2细胞凋亡的 annexin v-fitc/pi检测法 3、晚期细胞凋亡的流式细胞术检测： dutp缺口末端标记法（ tdt mediated x-dup nick ending end labeling, gavricli等首先报道，它实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方 法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生 物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养细胞和从组织中分离的 细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定 法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。 细胞凋亡时，核酸内切酶活化，双链 dna会出现许多不对称的断裂点，即产生一系列 3'-oh的末端。外源性荧光标记的脱氧核苷酸末端转移酶（terminal deoxynucleotidyl tranferase, tdt）能够催化外源性荧光素或酶标记的 dutp连接到 3'-oh末端，用流式细胞术 检测。该方法首先采用蛋白酶 k消化法或渗透法对标本细胞进行打孔，后将标本与 biotin标}