判断题：酶的天然底物就是亲和力最大的底物 该题是对是错？求高手指教，顺便把理由说下，先谢谢了_百度知道
判断题：酶的天然底物就是亲和力最大的底物 该题是对是错？求高手指教，顺便把理由说下，先谢谢了
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1&#47该题我认为答案是对的。因此，Km值最小则1/Km最大也就是亲和力最大;Km可以近似的表示酶对底物的亲和力大小，关于天然底物的定义是：Km值最小的底物成为该没的最适底物也就是天然底物
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生物化学 酶习题
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第九章 酶促反应动力学习题
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第九章 酶促反应动力学习题
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单项选择题一种酶作用于多种底物时其天然底物的Km值A．最小B．最大C．居中D．与其他作用物相同
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&&&&Chapter2&&&&酶的结构与功能&&&&生命科学学院张林生&&&&&&&&在生物化学发展历史上，酶学是个经久不衰的主题，其一：代谢途径及其调控机制的阐明有赖于关键酶的分离、纯化及其动力学和调控的研究；其二：许多酶又是研究蛋白质、核酸和聚糖结构与功能的重要工具。随着生物化学和分子生物学相关领域以及其它学科的发展，尤其是结构生物学、蛋白质组学、基因工程、蛋白质工程和免疫学的理论和技术向酶学的渗透，为酶学发展注入新的活力。&&&&&&&&当前，酶学发展主要有两大方向：即分子酶学和应用酶学。分子酶学重点研究酶的分子生物学，酶的分子结构、作用机制和调控，酶的合成、分拣、转运和定位等。应用酶学则包括酶法分析、酶工程、组织酶学、药理酶学、食品酶学等。&&&&&&&&酶的提纯&&&&?&&&&双水相萃取法--Two-aqueousphaseextraction&&&&1.1%右旋糖苷+0.36%甲基纤维素&&&&右旋糖苷0.39%甲基纤维素0.65%右旋糖苷1.58%甲基纤维素0.15%&&&&人生长激素提取&&&&不均一相用于分离的体系:PEG/DextranPEG/Dextran硫酸盐PEG/硫酸盐PEG/磷酸盐&&&&?人生长激素的分离?用PEG400/磷酸盐体系从大肠杆菌细胞碎片中提取人生长激素，当pH=7，菌体含量为1.35%的干细胞，混合5~10秒后，就可以达到萃取平衡，生长激素在上相，进行三级错流萃取，回收率可达81%,纯化系数8.5。&&&&&&&&酶的提纯&&&&?&&&&反胶束(reversedmicelle)萃取法&&&&反胶束是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的一种聚集体临界胶束浓度--CMC:胶束形成的最低表面活性剂浓度&&&&&&&&反胶束(reversedmicelle)萃取法&&&&?&&&&AOT:丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠&&&&&&&&?pH9.0，核糖核酸酶a不被AOT萃取?CKCl=0.5mol/L，细胞色素c不被AOT萃取，正萃取?pH=11.5，溶菌酶不被AOT萃取&&&&&&&&反相层析中的离子配对试剂的作用&&&&反相层析中的离子配对试剂的作用&&&&&&&&?疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。?疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。?在吸附层析中，高极性物质在层析柱上吸附较牢，洗脱时发生拖尾现象和保留时间长的问题。如果在支持物上涂上一层高碳原子的疏水性强的烷烃类，洗脱液用极性强的溶剂，如甲醇和水的混合物。则被分离样品中的极性强的物质不被吸附，最先洗下来，得到较好的分离效果。?这种层析法与普通的吸附层析法相反，故称为反相层析。&&&&&&&&2.1.酶促反应动力学&&&&?&&&&化学热力学说明反应的起点和终点，解决反应的方向和限度。动力学研究反应速度及各种因素如何定量地影响反应速度。酶仅在热力学允许的范围内加速反应进程，或将耗能反应与放能过程相偶联。&&&&?酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学。&&&&&&&&化学动力学基础&&&&?化学反应的两个基本方面:?反应进行的方向、可能性和限度，属于化学反应热力学范畴。?反应进行的速率和反应机制，属于化学动力学的研究范围。G并不与反应速率正相关&&&&&&&&反应速率及其测定&&&&?反应速率是以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来表示。&&&&&&&&反应级数&&&&?一级反应:不管底物浓&&&&度是多少，半衰期恒定&&&&?二级反应:半衰期与&&&&底物浓度成反比&&&&v=k&&&&?零级反应:半衰期与初浓度成正比&&&&&&&&2.1.1单底物酶促反应动力学&&&&底物浓度对酶反应速率的影响&&&&substratesaturationcurves&&&&&&&&?LenoreMichaelisandMaudL.Mentenproposedageneraltheoryofenzymeactionin1913consistentwithobservedenzymekinetics.?Theirtheorywasbasedontheassumptionthattheenzyme（E）anditssubstrate（S),associatereversiblytoformanenzyme-substratecomplex,ES&&&&&&&&?2.1.1.1Michaelis—Menten方程：&&&&&&&&d[ES]?k1[E][S]?k?1[ES]?k2[ES]?0dt[E][S]k?1?k2?[ES]k1k?1?k2[E][S]?Km?k1[ES]k2[ES]k2[ES][ET][ET][E]?[ES]k2[E][S]/Km?[ET][E]?[E][S]/Km&&&&&&&&&&&&?max[S]&&&&Km?[S]&&&&&&&&&&&&?max[S]&&&&Km?[S]&&&&当Km?[S]1?max2当Km》[S]&&&&&&&&?max[S]&&&&Km&&&&?K[S]&&&&一级反应&&&&当K《m[S][S]&&&&?max[S]&&&&max&&&&零级反应&&&&&&&&?Baseonthreeassumption:&&&&–Steadystateassumption–InitialVelocityAssumption–[S0]?[ET]assumption&&&&1当?max2Km?[S]&&&&Km值就代表反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度&&&&&&&&米氏方程必须满足的条件：9.21&&&&?1.Thereactioninvolvesonlyonesubstrate,orifthereactionismultisubstrate,theconcentrationofonlyonesubstrateisvariedwhiletheconcentrationofallothersubstratesisheldconstant.?2.ThereactionES→E+Pisirreversible,ortheexperimentislimitedtoobservingonlyinitialvelocitieswhere[P]=0.?3.[S]0[ET]and[ET]isheldconstant.?4.Allothervariablesthatmightinfluencetherateofthereaction(temperature,pH,ionicstrength,andsoon)areconstant.&&&&&&&&2.1.1.2Km和Vmax的意义&&&&?（1）米氏常数是酶的特征常数之一，每一种酶都有它的Km值，Km值只与酶的结构和所催化的底物有关，与酶浓度无关。?（2）判断酶与底物亲和力的大小。Km值小，表示用很低的底物浓度即可达到最大反应速度的一半，说明酶与底物亲和力大。可用1／Km近似地表示亲和力，1／Km愈大，酶与底物的亲和力愈大，酶促反应愈易进行。?（3）判断哪些底物是酶的天然底物或最适底物（即Km值最小的底物）。?（4）判断正逆两向反应的催化效率。如一个反应的正逆方向由同一个酶催化，则Km值较小的那向反应催化效率较高。?（5）求出要达到规定反应速度的底物浓度，或根据已知底物浓度求出反应速度。&&&&&&&&2.1.1.3催化常数（Catalyticconstant,Kcat）或转换数（turnovernumber,TN）常用Kcat/Km表示酶的催化效率，为酶专一性的定量尺度。&&&&?催化常数（catalyticnumber）（Kcat）也称之转换数(turnovernumber)。一个动力学常数，是在底物浓度处于饱和状态下，一个酶（或一个酶活性部位）催化一个反应有多快的测量。Kcat值越大，表示酶的催化效率约高。?催化常数等于最大反应速度除以总的酶浓度（Vmax/[E]total），或者是每摩尔酶活性部位每秒钟转化为产物的底物的摩尔数。&&&&&&&&胰凝乳蛋白酶,&&&&Kcat/Km也叫专一性常数。&&&&&&&&?Kcat/Km不仅可用来衡量酶对底物专一性，还可用于检验酶催化反应是否达到恒态或平衡态.生理条件下SKm，Vmax=kcat[E]代入米氏方程v=kcat[E][S]/Km+[S]=kcat[E][S]/Km得出：v=kcat/Km[E][S]kcat/Km为[E]和[S]反应形成产物的表观二级速度常数，单位：L/mols。可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率kcat/Km大小可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。&&&&&&&&2.1.1.4作图法求Km和Vmax&&&&（1）Lineweaver-Burk作图法：（2）Eadie-Hofstee作图法：（3）Hanes-Woolf作图法：（4）Eisenthal和Cornish-Bowden作图法&&&&&&&&2.1.2多底物酶促反应的动力学&&&&2.1.2.1双底物双产物酶促反应动力学分类&&&&（1）序列有序反应&&&&（2）序列随机反应&&&&（3）乒乓反应&&&&&&&&两种不同模式的双底物反应&&&&顺次式(sequential)&&&&随机次[顺]序&&&&&&&&丙酮酸&&&&乳酸&&&&序列有序反应&&&&&&&&肌氨酸&&&&磷酸肌酸&&&&序列随意&&&&&&&&乒乓式(ping-pong)&&&&P2&&&&P2&&&&&&&&乒乓反应—氨基酸的转氨基反应&&&&吡哆醛&&&&&&&&天冬氨酸&&&&酮戊二酸&&&&谷氨酸&&&&草酰乙酸&&&&&&&&2.1.2.3双底物产物反应的动力学方程?（1）序列机制的反应动力学方程及作图&&&&&&&&序列反应的动力学方程&&&&?KmA是指在B的浓度达到饱和浓度时，A的米氏常数，在B的浓度低于饱和浓度时所测得的随[B]而变的A的各个Km称为表观米氏常数。&&&&&&&&?如交于横坐标上，说明固定浓度底物与酶的结合不影响变量底物的Km，即A和B的浓度大小彼此互不影响各自的Km，此时表观Km=Km?如直线的交点在横坐标以下，说明A的表观Km随B的浓度升高而升高?如直线的交点在横坐标以上，说明A的表观Km随B的浓度升高而降低&&&&&&&&（2）乒乓机制的反应动力学及作图&&&&&&&&2.2酶的抑制作用&&&&凡能降低酶催化活性的物质均可认为是酶的抑制剂。酶在抑制剂作用下活力下降甚至丧失，称为抑制作用。（1）抑制程度表示方法：&&&&1．相对活力分数（残余活力分数）a=Vi/Vo&&&&2．相对活力百分数（残余活力百分数）a%==Vi/Vo*100%3．抑制分数指被抑制而失去活力的分数i=1-a=1-Vi/Vo4．抑制百分数i%=(1-a)*100%=(1-Vi/Vo)*100%通常所谓抑制率是指抑制分数或抑制百分数。&&&&&&&&（2）抑制作用的分类：&&&&根据抑制作用是否可逆:不可逆的抑制作用:抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活的作用.可逆的抑制作用:可逆的抑制作用:抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活.可逆抑制作用分为3种类型：(1)竞争性抑制(2)非竞争性抑制:(2)非竞争性抑制:&&&&(3)反竞争性抑制反竞争性抑制:&&&&&&&&?（3）不可逆抑制与可逆抑制的鉴别：&&&&?物理方法处理:透析,超滤,凝胶过滤;;?动力学方法:动力学方法:&&&&&&&&?Therearetwobroadclassesofenzymeinhibitors:reversibleandirreversible.&&&&?Irreversibleinhibition：抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活，称为不可逆抑制?Reversibleinhibition:抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活，这种抑制作用是可逆的，称为可逆抑制。&&&&?Reversibleinhibition&&&&?竞争性抑制（Competitiveinhibition）?非竞争性抑制(noncompetitiveinhibition)?反竞争性抑制(uncompetitiveinhibition)&&&&&&&&2.2.1可逆抑制作用&&&&?2.2.1.1竞争性抑制&&&&1v[I]增大K'm对照斜率=1Vmax&&&&－&&&&KmKi&&&&1Km&&&&－&&&&1[S]1K'm&&&&－Ki&&&&Km&&&&[I]&&&&图2.9竞争性机制Lineweaver-Buck作图法抑制二次作图法&&&&图2.10&&&&竞争性&&&&&&&&竞争性抑制（Competitiveinhibition）&&&&?aninhibitor,I,bindsreversiblytotheenzymeatthesamesiteasS.S-bindingandI-bindingaremutuallyexclusive,competitiveprocesses.?SandImustshareahighdegreeofstructuralsimilaritybecausetheybindatthesamesiteontheenzyme.?theinhibitioncanbeovercomebyraising[S].&&&&&&&&竞争性抑制的双倒数作图&&&&&&&&氨甲喋呤&&&&四氢叶酸&&&&&&&&胰蛋白酶与牛胰蛋白酶抑制剂的复合物&&&&&&&&pepsin&&&&胃蛋白酶&&&&HIV-1proteinase&&&&?HIV-1蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶家族的一个成员。该家族成员包括木瓜酶、肾素、凝乳酶及组织蛋白酶D等(c1)。HIV蛋白酶专一性地催化病毒gag(衣壳蛋白)和gag-pol转录产物，产生装配病毒颗粒所需要的酶和结构蛋白质。HIV-1蛋白酶活性在pH6时最高，将二聚体解离会导致酶活性的完全散失。胃蛋白酶抑制剂A（isovaleryl-ValVal-Sta-Ala-Sta,Mr686）是天冬氨酸蛋白酶的特异性抑制剂(c2-3)。HIV-1蛋白酶的活性位点有两个亚基的相同部分组成。抑制剂和酶的反应有氢键和疏水作用共同起作用。&&&&&&&&抗病毒药（沙喹那韦)&&&&鸟嘌异甘醚&&&&吲哚那韦&&&&利托那韦&&&&2003年美国FDA批准的抗HIV药是HIV蛋白酶抑制剂&&&&&&&&蛋白酶抑制剂印地那韦商品名&&&&&&&&表2.1某些药物或其代谢物对酶的竞争抑制&&&&药物（抑制剂）磺胺类氨基喋呤氨甲喋呤（MTX）5-氟尿嘧啶（5-FU）5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸（d-5FUMP）被抑制的酶竞争底物临床应用及机制抑菌作用（抑制THFA合成）抗白血病（抑制THFA合成）二氢叶酸合成酶（细菌）对-氨基苯甲酸二氢叶酸二氢叶酸还原酶（细菌）尿嘧啶核苷磷酸化酶胸嘧啶核苷磷酸化酶胸嘧啶核苷酸合成酶次黄嘌呤、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶黄嘌呤氧化酶纤溶酶单胺氧化酶单胺氧化酶酪氨酸蛋白激酶尿嘧啶胸嘧啶d-UMP次黄嘌呤鸟嘌呤次黄嘌呤、黄嘌呤赖氨酰肾上腺素去甲肾上腺素酪氨酰&&&&抗癌作用（抑制核苷酸合成）抗癌作用（抑制DNA合成）&&&&6-巯基嘌呤（6-MP）&&&&别嘌呤醇ε-氨基已酸苯丙胺麻黄素L-氮酪氨酸&&&&抗白血病（抑制核苷酸合成）&&&&抗痛风（抑制尿酸合成）止血，抗纤溶（抑制纤溶酶）中枢兴奋抗哮喘抗癌作用（抑制RPTK）&&&&&&&&犊牛小肠腺苷脱氨酶反应&&&&过渡态次黄（嘌呤核）苷&&&&adenosinedeaminase腺苷脱氨酶&&&&&&&&过渡态（transitionstate）底物（S≠）比基态底物（S）更易与酶结合并形成产物，因而过渡态类似物比一般的底物类似物有更强的抑制效应。基态底物类似物对酶的亲和力与底物仅相差10倍，而过渡态类似物对酶的亲和力一般较底物大2~5个数量级。例如腺苷酸激酶催化AMP和ATP生成2分子ADP，过渡态类似物AP5A对酶的亲和力比底物AMP和ATP的结合力高105倍，而AP4A几乎没有抑制作用。&&&&&&&&2.2.1.2非竞争性抑制&&&&(noncompetitiveinhibition)&&&&无法形成产物&&&&抑制物&&&&&&&&?NoncompetitiveinhibitorsinteractwithbothEandES?Obviously,then,theinhibitorisnotbindingtothesamesiteasS,andtheinhibitioncannotbeovercomebyraising[S].&&&&&&&&1＝（1+〔I〕）×ViKi（Vmax1&&&&非竞争性抑制&&&&Vmax〔S〕Vi＝Km1〔I〕〔S〕)＋）(1+)(Km+Vmax〔S〕Ki&&&&&&&&作用特点：Vmax变小，Km不变，Vmax随[I]的&&&&增加而减小，抑制分数与[I]成正比，与[S]无关。不能通过增加底物浓度来消除或低抑制剂的作用。&&&&&&&&特点：&&&&①I和S在结构上一般无相似之处，I常与酶分子上结合基团以外的化学基团结合，这种结合并不影响底物和酶的结合，增加底物浓度并不能减少I对酶的抑制。②非竞争性抑制剂的双倒数曲线：有非竞争性抑制剂存在的曲线与无抑制剂的曲线相交于横坐标1/Km处，但纵坐标的截距，因竞争性抑制存在变大，说明该抑制作用，并不影响酶促反应的Km值，而使Vmax值变小，如下图所示：&&&&&&&&2.2.1.3反竞争性抑制(uncompetitiveinhibition)&&&&?抑制剂不能与游离酶结合，但可与ES复合物结合并阻止产物生成，使酶的催化活性降低，称酶的反竞争性抑制&&&&&&&&反竞争性抑制剂存在下，Km、Vmax都变小。1&&&&Vi&&&&＝&&&&Km&&&&1&&&&Vmax〔S〕&&&&+&&&&〔I〕(1+)VmaxKi&&&&1&&&&Vi＝&&&&Vmax〔S〕&&&&〔I〕Km＋（1＋Ki〔）S〕&&&&&&&&与图形特征&&&&反竞争性抑制的速度方程&&&&&&&&反竞争性抑制的特点：⑴反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；⑵抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合；⑶必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；抑制程度随底物浓度的增加而增加；⑷动力学参数：Km减小，Vm降低。&&&&&&&&混合性抑制&&&&&&&&混合性抑制的双倒数作图&&&&&&&&混合性抑制&&&&抑制剂与酶的活性中心相结合,阻断酶分子的结合基团或催化基团,或与酶-底物中间复合体结合,从而阻止底物形成产物。这类抑制剂在酶分子上的结合部位基本上和底物相同或相近,故称为同位抑制剂,这种抑制作用也就叫做同位抑制作用&&&&表2.2几种同位抑制作用动力学的比较&&&&表观米氏常数&&&&抑制类型竞争性&&&&反竞争性非竞争性反竞争性与非竞争性混合型&&&&条件&&&&表达最大反应速度（增大）&&&&K'm&&&&Vmax(1?[I])KI&&&&KI=∝&&&&Ki=∝Ki=KI&&&&（不变）&&&&'Vmax&&&&（减小）（减小）（减小）&&&&[I])KI&&&&（减小）&&&&Vmax&&&&[I])Ki&&&&Km（不变）（减小）&&&&Km(1?&&&&Vmax(1?&&&&[I])KI&&&&KiKI&&&&Vmax(1?&&&&竞争性与非竞争性混合型&&&&（减小）KiKI&&&&Km(1?[I])KI[I])KiKm(1?&&&&（增大）&&&&[I][I])(1?)KiKI[I][I])(1?)KiKI&&&&Vmax(1?&&&&Km(1?&&&&&&&&?表2.3双底物反应中同位可逆抑制剂的抑制类型&&&&I为A为竞争性抑制剂反应机制对1/[A]作图a竞争性竞争性竞争性对1/[B]作图b反竞争性非竞争性非竞争性&&&&I为B的竞争性抑制剂&&&&对1/[A]作图&&&&对1/[B]作图&&&&乒乓反应强制有序反应序列随机反应&&&&反竞争性&&&&竞争性&&&&反竞争性&&&&竞争性&&&&非竞争性&&&&竞争性&&&&a.A浓度变化，B浓度固定；&&&&b.B浓度变化，A浓度固定&&&&&&&&?2.2.1.5底物抑制与产物抑制?底物抑制作用简单酶催化反应动力学有一个显著的特点,即反应速率与底物浓度的关系是一种简单增加的函数关系.而实际上有些酶的催化反应,由于底物浓度过高,其反应速率反而会下降,这种效应称为底物抑制作用.?过多的底物类似于反竞争性抑制剂，与ES形成盲端复合物&&&&&&&&产物抑制&&&&?产物常通过别构效应进行反馈抑制。此外，根据质量作用定律，当P浓度逐渐增大时，EP的分解速度相应下降。&&&&&&&&2.2.2不可逆抑制作用&&&&?不可逆抑制剂：&&&&–非专一性抑制剂：能与酶蛋白上特定的氨基酸残基侧链上活性基团发生共价化学反应的化学物质。–专一性抑制剂&&&&&&&&?2.2.2.1非专一性不可逆抑制剂：&&&&?主要有以下几类&&&&（1）有机磷化合物，与羟基反应&&&&使某些蛋白酶和酯酶失活，这类化合物强烈地抑制胆碱酯酶，导致以乙酰胆碱为递质的神经系统处于过度兴奋状态，出现神经中毒症状，因此把这类有机磷化合物称为神经毒剂。&&&&&&&&DFP、1605、敌百虫，等许多有机磷农药。机理：与酶活性直接相关的丝氨酸上的羟基牢固地结合。作用：强烈抑制对神经传导有关的胆碱酯酶活力。解毒剂：PAM(解磷定)含CH=NOH，可以将酶上的磷酰基团除去。&&&&二异丙基氟磷酸(DFP)能抑制以丝氨酸为必需基团的酶的活性&&&&二异丙基磷酰氟酯&&&&&&&&?（2）有机汞、有机砷化合物，与巯基反应?抑制机理：使酶的巯基(-SH)烷化?解毒剂：二巯基丙醇（BAL）、Cys、GSH等过量的巯基化合物?（3）烷基化试剂，含有活泼卤素原子，可与巯基、氨基、羧基、咪唑基等反应&&&&&&&&碘乙酰胺&&&&&&&&?（4）青霉素、头孢霉素可与糖肽转移酶活性中心的Ser羟基共价结合，使酶失活，从而抑制细菌细胞壁肽聚糖合成，起到抗菌作用。&&&&青霉素不可逆抑制糖肽转肽酶&&&&糖肽转肽酶-Ser-OH&&&&&&&&?（5）氰化物、硫化物和CO。与酶中的金属离子形成稳定络合物?（6）重金属盐Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等重金属离子。高浓度能使酶蛋白变性，低浓度抑制酶活性,Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+、Fe3+能使大多数酶失活，EDTA可解除。&&&&&&&&2.2.2.2专一性不可逆抑制剂&&&&?Ks型不可逆抑制剂：又叫亲和标记试剂(affinitylabelingreagent)。活性部位定向抑制剂或亲和标记试剂。底物类似物。?Kcat型不可逆抑制剂：又叫自杀性底物(suicidesubstrate)。被催化后起作用。&&&&?过渡态类似物(Transition-StateAnalogs)&&&&&&&&（1）KS型专一性不可逆抑制剂（活性部位定向抑制剂或亲和标记试剂）：&&&&部分结构与底物类似，可直接结合于活性部位，另一部分则与活性中心某基团反应，对其进行共价修饰使E失活。&&&&&&&&Ks型不可逆抑制剂&&&&?具有底物类似的结构?可与相应的酶结合?带有一个活泼的化学基团，能与酶分子中的必需基团反应进行化学修饰?抑制剂与酶活性部位某基团形成的非共价络合物和抑制剂与非活性部位同类基团形成的非共价络合物之间的解离常数不同&&&&&&&&TPCK对胰凝乳蛋白酶&&&&胰凝乳蛋白酶&&&&特异基团&&&&甲苯磺酰基-L-氨基联苯氯甲基酮&&&&&&&&类胰蛋白酶及其抑制剂&&&&?胰蛋白酶是肥大细胞含量最丰富的一种分泌性介质,且在多种疾病的进程中起到诱导作用,因此类胰蛋白酶及其抑制剂已经成为近年来炎症及其相关疾病研究领域的热点.成熟的β类胰蛋白酶能够短暂快速地加重全身性过敏反应病情。?近年来人们发现,类胰蛋白酶抑制剂可以抑制人皮肤、扁桃体和滑膜中肥大细胞组胺的释放。?N-(1-羟基-2-萘酰)-L-精氨酰基-L-脯氨酰胺（APC366）。是一低分子量、活性中心定向、不可逆性的竞争性类胰蛋白酶抑制剂,其抑制常数Ki值是330nmol/L,APC366在羟氨、氨或者谷胱甘肽的存在下，对类胰蛋白酶的抑制作用明显下降，这是由于这些亲核基团与APC366的活性中心结合所致。APC366使类胰蛋白酶失活的作用机制是APC366分子中的胍基引导抑制剂进入人类胰蛋白酶的P1位点，并与类胰蛋白酶的天冬氨酸残基形成盐桥，羟基萘酰基受类胰蛋白酶氨基酸侧链的亲核攻击，生成共价加成化合物从而使得类胰蛋白酶失活。&&&&&&&&?南瓜籽来源的胰蛋白酶，南瓜籽抑制剂家族由20多种不同的抑制剂组成。所有这些抑制剂均是由属于南瓜家族的植物种子中分离出来的。它们的生理作用虽然不是很清楚，但它们都是高表达的蛋白，是丝氨酸蛋白酶的可逆性抑制剂，绝大部分能够强烈抑制胰蛋白酶。?这些抑制剂都较小，一般由28～31个氨基酸组成，而且在结构上都有一个异常的由3个二硫键组成的结状结构。目前对该家族研究最多的是CMTIⅠ和CMTIⅢ，它们均由29个氨基酸组成，可以高效的抑制牛β-胰蛋白酶，缔合平衡常数（associasionequilibˉriumconstant）分别为3.2××1011，其活性部位经证明为5位的Arg和6位的Ile形成的肽键结构，这一结构破坏后整个分子&&&&&&&&溴磷酸丙糖异构酶&&&&&&&&（2）Kcat型专一性不可逆抑制剂（自杀性底物，suicidesubstrate）：&&&&Kcat型不可逆抑制剂这类抑制剂不但具有与天然底物相类似的结构而且本身也是酶的底物可被酶催化而发生类似底物的变化。但这类抑制剂还有一种潜伏性的反应基团这种基团可因酶的催化而暴露或活化作用于酶活性中心或辅基使酶共价共价修饰而失活。&&&&具有类似于底物的结合和反应基团，可结合于酶的活性部位并在其作用之下发生反应；与底物不同的是它还有潜伏的反应基团，受酶催化之后即被活化，与酶活性中心某基团共价结合，使酶丧失活性。&&&&&&&&Kcat型不可逆抑制剂&&&&?这种抑制剂是根据酶的催化过程来设计的，它们与底物类似，既能与酶结合，也能被催化发生反应，在其分子中具有潜伏反应基团（latentreactivegroup），该基团会被酶催化而活化，并立即与酶活性中心某基团进行不可逆结合，使酶受抑制。此种抑制专一性强，又是经酶催化后引起，被称为自杀性底物。&&&&&&&&FAD核黄素辅基&&&&烷基化N,N-二甲基丙炔胺&&&&修饰后的核黄素使该酶活性丧失。&&&&&&&&过渡态类似物&&&&?过渡态是底物和酶结合成中间复合物后被活化的过渡形式，由于能障小，和酶结合就紧密得多。?因此过渡态类似物与酶的亲和力就会远远大于底物，引起酶的强烈抑制&&&&&&&&prolineracemase脯氨酸消旋酶&&&&吡咯2-羧酸160timesmoretightly过渡态类似物&&&&&&&&甘油醛&&&&烯二醇化物&&&&果糖1,6-二磷酸&&&&磷酸乙二醇异羟肟酸盐&&&&Aldolase醛缩酶&&&&&&&&小牛肠&&&&肌苷&&&&嘌呤&&&&adenosinedeaminase腺苷脱氨酶&&&&&&&&(三)可逆和不可逆抑制作用的鉴别&&&&1：反应体系不加I&&&&v&&&&1&&&&2&&&&2：体系中加入一定量不可逆抑制剂3：体系中加入一定量可逆抑制剂&&&&3&&&&[E]&&&&&&&&v&&&&[I]→&&&&v&&&&[I]&&&&[E]&&&&[E]&&&&不可逆抑制剂&&&&可逆抑制剂&&&&的作用&&&&的作用&&&&&&&&2.3酶的作用机制&&&&酶催化的专一性包括底物结合专一性和催化作用专一性。前者要求酶选择与其活性部位的几何形状和大小相吻合的底物；后者要求底物具备合适的键或基团，在ES中与酶的催化基团间有足够大的作用力。底物结合专一性与KS相关，而Kcat/Km反映催化专一性。&&&&&&&&2.3.1酶的活性中心&&&&?2.3.1.1活性中心的特点：&&&&?①仅占酶分子总体积的一小部分（通常约1～2%），催化中心一般由2～3个残基（和辅因子）组成，最常见的残基如His、Ser、Asp等。结合中心因酶而异；&&&&&&&&?②活性中心的三维结构由其一级结构决定，与特定的环境有关，凡破坏蛋白质构象的因素（变性）均使酶失活；&&&&?③酶在与底物结合的过程中相互诱导，使酶的活性中心的几何形状和大小与底物相吻合（互补），催化基团与底物反应基团定向靠近；&&&&?④活性中心通常在酶分子表面疏水的裂隙或凹陷中。&&&&&&&&酶的活性中心和必需基团&&&&?酶的特殊催化能力只局限于大分子的一定区域，只有少数特异的氨基酸残基参与底物结合及催化作用。?这些特异的氨基酸残基比较集中的区域，即与酶活力直接相关的区域称为酶的活性部位(activesite)或活性中心(activecenter).?通常又将活性部位分为结合部位和催化部位。结合部位，由一些参与底物结合的有一定特性的基团组成?催化部位，由一些参与催化反应的基团组成，底物的键在此处被打断或形成新的键，从而发生一定的化学变化。&&&&&&&&?酶的活性部位是一个三维实体。&&&&溶菌酶&&&&&&&&?酶的活性部位是位于酶分子表面的一个裂隙(cleft)或裂缝(crevice)。&&&&&&&&?酶的专一性取决于酶活性部位原子的构象排列与底物结合精确程度.?酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和底物结合过程中，底物分子或酶分子，有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的，这时催化基团的位置也正好在所催化底物键的断裂和即将生成键的适当位置。&&&&&&&&?底物通过次级键较弱的力结合到酶上。&&&&尿嘧啶&&&&?酶与底物结合成ES复合物主要靠次级键：氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用。&&&&&&&&?酶活性部位具有柔性或可运动性邹承鲁的结果&&&&在酶的变形过程中，在酶分子的整体构象没有受到明显的影响之前，活性部位已经大部分被破坏，造成活性丧失，表面酶的活性部位，相对于整个酶分子具有柔性或可运动性。&&&&&&&&溶菌酶的结构&&&&溶菌酶多肽链上活性中心残基的位置&&&&&&&&溶菌酶Lysozyme&&&&?Lysozymeisanaturalantibacterialagentfoundintearsandeggwhites.?Theheneggwhitelysozyme(Mr14,296)isamonomerwith129aminoacidresidues.Thiswasthefirstenzymetohaveitsthree-dimensionalstructuredetermined,byDavidPhillipsandcolleaguesin1965.&&&&&&&&溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramideglycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。&&&&&&&&?Thesubstrateoflysozymeispeptidoglycan肽聚糖,acarbohydratefoundinmanybacterialcellwalls?Peptidoglycanisacopolymeroftwosugarunits,N-acetylmuramicacid(N-乙酰葡糖乳酸，N-乙酰胞壁酸，NAM)andNacetylglucosamine(N-乙酰葡糖胺，NAG)，joinedinβ(1-4)glycosidiclinkages糖苷键?LysozymehydrolyzestheglycosidicbondbetweenC-1ofNAMandC-4ofNAG,butdoesnotactontheβ(1-4)linkagesbetweenNAGandNAM.&&&&&&&&119&&&&&&&&120&&&&&&&&121&&&&&&&&122&&&&&&&&123&&&&&&&&124&&&&&&&&125&&&&&&&&溶菌酶催化机理：&&&&1、D糖构象由椅式&&&&半椅式&&&&2、Asp52在极性区以AspCOO-存在，Glu35在非极性区以GluCOOH存在3、Glu35起广义酸催化D环C1-O断裂，C1C1+&&&&4、AspCOO-羧基O与D环C1+0.3nm，GluCOOH羧基O与D环C1+0.3nm5、AspCOO-稳定C1+&&&&6、Glu35COO-进攻H2O的H形成GluCOOH，促使H2O形成OH7、C+1&&&&与OH-结合并恢复椅式构象&&&&126&&&&&&&&127&&&&&&&&128&&&&&&&&船型&&&&半椅型&&&&反应坐标，扭转的角度&&&&&&&&肽聚糖&&&&N-乙酰葡糖胺残基(GlcNAc）&&&&N－乙酰胞壁酸（Mur）。Ac乙酰&&&&糖基中间体&&&&共价中间体&&&&&&&&2.3.1.2研究酶活性中心结构的方法&&&&?活性部位研究是全面了解一个酶的结构与功能、确定其归类以及进一步对其定向改造的前提和基础。?目前常用方法包括研究大分子空间结构的经典技术，如X-射线晶体衍射、多维核磁共振等，以及化学修饰法，定点突变法等。&&&&&&&&修饰酶的功能基团：亲核的Ser、Cys、Thr、Lys、His，亲电的Tyr、Trp可氧化的Tyr、Trp、Met——经过修饰的酶稳定性好。&&&&&&&&1.酶分子侧链基团的化学修饰法&&&&化合物&&&&活性部位AA残基侧链基团&&&&共价结合&&&&↓&&&&水解酶，确定一级结构位置&&&&&&&&（1）非特异性共价修饰&&&&——推测某基团是否在活性中心&&&&某基团被修饰后：酶活力改变：为必需基团&&&&&&&&（2）特异性共价修饰&&&&——试剂专一修饰活性部位某AA，使酶失活。&&&&如：二异丙基氟磷酸（DFP)专一修饰ESer-OH&&&&ESerOH&&&&酶?&&&&+(CH3)2CHOP&&&&(CH3)2CHOO&&&&F&&&&ESerO&&&&P&&&&O&&&&CH(CH3)2CH(CH3)2&&&&OO&&&&DFP&&&&DIP-E&&&&仅修饰活性中心Ser-OH&&&&&&&&(3)亲和标记法&&&&——与S结构相似的共价修饰剂?能被专一地引入活性部位，接近底物结合位点&&&&?其活泼的化学基团可与活性部位某一基团形成稳定的共价键&&&&&&&&对甲苯磺酰－L－苯丙氨酸乙酯(TPE)&&&&胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶&&&&CH2CHNHSO2&&&&COOCH2CH3&&&&CH2CHNHSO2&&&&COCH2Cl&&&&TPETPCK&&&&CH3HN&&&&3&&&&CH3RCOCH2&&&&2&&&&N&&&&3&&&&RCOCH2Cl&&&&+2&&&&N&&&&1&&&&TPCK&&&&His57-N3&&&&N&&&&1&&&&E-His57&&&&烷化失活&&&&对甲苯磺酰－L－苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）&&&&&&&&2.动力学参数测定法&&&&活性部位AA残基解离状态和酶活性直接相关通过动力学方法求有关参数，对酶活性部位化学性质作出判断。&&&&3.X射线晶体结构分析法&&&&X-射线晶体衍射仍是迄今最主要的研究大分子三维结构的技术手段。&&&&&&&&4.定点诱变法&&&&利用定点诱变技术，改变编码蛋白基因中的DNA顺序，改变其中某AA后，测定酶活性的变化。&&&&将所研究酶的基因或cDNA分离出来，进行定点诱变，表达后得到一个或几个氨基酸被取代的酶蛋白，再测定其活性和其它有关性质，根据发生的改变推测这些残基对酶作用的贡献。&&&&&&&&?①非专一性修饰试剂仅用于初筛②差示标记法③亲和标记&&&&?（2）动力学参数测定可为了解酶活性中心的结构提供有关信息。?（3）X-射线晶体衍射仍是迄今最主要的研究大分子三维结构的技术手段。?（4）分子生物学方法已广泛用于酶结构的研究。&&&&&&&&2.3.2酶的催化机制：对酶作用高效性作出贡献的基元反应&&&&?诱导契合机制&&&&酶与底物靠近定向&&&&酶与底物相互诱导变形&&&&产物脱离&&&&契合成中间产物&&&&酶催化的本质：降低反应的活化能。&&&&&&&&过渡态&&&&非催化反应活化能&&&&能量改变&&&&一般催化剂反应活化能酶促反应活化能&&&&初态&&&&反应总能量变化&&&&终态活化过程&&&&酶促反应降低活化能&&&&&&&&2.3.2.1&&&&底物的邻近效应(proximity)&&&&与定向效应(orientation)&&&&?邻近效应是指酶与底物结合形成中间复合物，使底物与底物之间，酶的催化基团与底物之间结合于同一分子而使有效浓度得以极大的升高，从而使反应速率大大增加的一种效应。&&&&?酶与底物结合形成中间复合物后，使酶的催化基团邻近底物，使有效浓度极大提高，从而反应速率大大提高。有人曾测过某底物在溶液中的浓度为0.001moll-1而在活性中心的浓度100moll-1，比溶液中的浓度高十万倍。&&&&&&&&定向效应是指反应物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。&&&&&&&&靠近&&&&定向&&&&静电吸引疏水作用&&&&底物&&&&酶&&&&产物脱离&&&&酶复原－催化剂&&&&&&&&碱催化&&&&酸催化&&&&羧肽酶&&&&＋&&&&&&&&电子云形变&&&&＋－C=O&&&&定向极性专一性契合区＋靠近C端确认区H2+N＝CArg&&&&注意&&&&&&&&?proximityandorientationareresponsibleforentropy熵loss&&&&&&&&（二）底物的变形(distortion)和&&&&诱导契合(inducedfit)&&&&?当酶遇到其专一性底物时，酶中某些基团或离子可以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或降低，产生电子张力，使敏感键的一端更加敏感，底物分子发生形变。?底物比较接近它的过渡态，降低了反应活化能，使反应易于发生。&&&&&&&&?①酶从低活性形式转变为高活性形式?②底物扭曲、变形?③底物构象变化，变得更像过渡态结构，大大降低活化能&&&&&&&&诱导&&&&互补性结构变化&&&&契合&&&&能否契合—专一性的由来&&&&&&&&2.3.2.2&&&&酸碱催化(acid-basecatalysis)&&&&?酸碱催化是通过瞬时的向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。?Nearlyallenzymereactionsinvolvesomedegreeofacidorbasecatalysis.?Therearetwotypesofacid–basecatalysis:?specificacid–basecatalysis,inwhichH+orOHacceleratesthereaction；?generalacid–basecatalysis,inwhichanacidorbaseotherthanH+orOH-acceleratesthereaction.&&&&&&&&酶活性中心提供H+/H+受体使敏感键断裂的机制。&&&&酸催化(－OH、－NH3+、＝NH+、-COOH、－SH)&&&&H2OEHEEH+OH-&&&&A-:+B+碱催化(失电子态)A-:H+&&&&H+&&&&AH&&&&+&&&&B+&&&&+E-COO-&&&&A-+&&&&E-COOH&&&&E-COO-+H+&&&&&&&&酶分子中可作为亲核基团和酸碱催化的功能基团&&&&Intheactivesiteofanenzyme,anumberofaminoacidsidechainscansimilarlyactasprotondonorsandacceptors(质子的供体和受体)&&&&&&&&对硝基苯乙酸乙酯&&&&&&&&共价催化(covalentcatalysis)2.3.2.3共价催化(covalentcatalysis)&&&&?Someenzymereactionsderivemuchoftheirrateaccelerationfromtheformationofcovalentbondsbetweenenzymeandsubstrate,involvingformationofacovalentintermediate:&&&&&&&&——酶活性中心亲电/亲核基团参与底物敏感键断裂的机制。亲电基团——带正电荷性质的基团亲核基团——带负电荷性质的基团&&&&&&&&?共价催化包括：?亲核催化(nucleophiliccatalysis)&&&&–最常见的3种亲核基团：Ser的羟基、Cys的巯基、His的咪唑基&&&&?亲电催化(electrophiliccatalysis）&&&&–通常由辅酶构成亲电中心&&&&&&&&3-磷酸-甘油醛&&&&亲核催化&&&&&&&&中间产物不稳定，断裂，形成产物，酶复原。&&&&（不同酶促反应中的催化因素影响大小不同。）&&&&¨-OH亲电催化¨-SH-¨NH2咪唑基&&&&2A-:&&&&亲核催化&&&&2B+&&&&+Mg2+&&&&AA:¨Mg&&&&+2B+&&&&A-:&&&&B+&&&&¨+-OH&&&&A-:+HO:B&&&&&&&&?2.3.3酶促反应机制实例&&&&&&&&胰凝乳蛋白酶&&&&胰蛋白酶原&&&&胰肽酶E&&&&&&&&（一）胰凝乳蛋白酶&&&&胰凝乳蛋白酶是脊椎动物的消化酶。在胰脏中以酶前体物质胰凝乳蛋白酶原的形态生物合成，随胰液分泌出去。在小肠受到胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的一定的分解，转变成活性的胰凝乳蛋白酶。&&&&疏水口袋&&&&活性位点残基&&&&&&&&胰凝乳蛋白酶&&&&属于肽链内切酶，主要切断多肽链中的芳香族氨基酸残基的羧基一侧。牛的α-胰凝乳蛋白酶的氨基酸残基数245个，分子量约2.5万，第57位His、102位Asp、195位Ser等三个残基在催化作用中起着中心作用。195位Ser受二异丙基氟磷酸（DFP）的作用受特异的修饰而丧失活性，即所谓丝氨酸蛋白酶。疏水口袋&&&&活性位点残基&&&&&&&&氧阴离子洞&&&&&&&&氧负离子孔&&&&&&&&4.丝氨酸蛋白酶的催化机制&&&&催化三联体&&&&稳定His的正电形式&&&&亲核攻击&&&&&&&&属于肽链内切酶，主要切断多肽链中的芳香族氨基酸残基的羧基一侧。&&&&&&&&酰基&&&&&&&&脱酰基作用&&&&&&&&酶活性的调节&&&&&&&&2.4酶活性的调节&&&&新陈代谢受到精密灵活高效的调控，调控作用在不同层次上进行，其中最基本的是对酶的数量和酶活性的调控。以下重点介绍酶活性调节的分子机理。&&&&&&&&2.4.1别构调控（allostericregulation）&&&&1、定义&&&&别构调节：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性状态。&&&&别构酶：具有别构现象的酶。&&&&别构剂：能使酶分子发生别构作用的物质。&&&&&&&&2、别构酶的特点&&&&别构激活剂&&&&（1）多亚基&&&&一部分亚基有活性中心，另一部分有别构调节中心&&&&别构抑制剂&&&&&&&&①天冬氨酸转氨甲酰酶aspartatecarbamoyltransferase&&&&COOOH2NCOOPO&&&&-&&&&-OOC&&&&OHN&&&&O&&&&-&&&&+H3N&&&&+&&&&CH2CCOOH&&&&Zn2+ATCase&&&&Pi&&&&O&&&&CH2CCOO-&&&&+H2N&&&&CNH&&&&CTP反馈抑制ATCase&&&&O&&&&NH&&&&COO-&&&&NH2N&&&&CTP（嘧啶生物合成的终端产物)&&&&ATP别构激活剂CTP别构抑制剂&&&&OO&&&&-&&&&OO&&&&-&&&&OO&&&&-&&&&OO&&&&-&&&&N&&&&-&&&&PO&&&&PO&&&&PO&&&&H2COOHOH&&&&&&&&别构酶E.coli天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）的别构调节效应。这种酶分子由6个催化亚基和6个调节亚基组成&&&&调节亚基&&&&催化亚基&&&&&&&&（2）别构酶的动力学&&&&S形曲线（正协同）表观双曲线（负协同效应）&&&&正、负协同别构酶与非别构酶的动力学曲线比较&&&&&&&&2.4.1.1协同效应：&&&&?协同效应：一个配体与蛋白或酶结合后对另一配体结合的影响.?1.分类：?同种效应：一个分子的配体与蛋白或酶结合对后续同种或同类配体结合的影响。或同类配体结合的影响。?异种效应：一个分子的配体与蛋白或酶结合对不同种或不同类配体结合的影响。不同类配体结合的影响。?正协同效应：一分子的配体与蛋白或酶结合可促进下一分子配体与蛋白和酶结合的效应。子配体与蛋白和酶结合的效应。?负协同效应：一分子的配体与蛋白或酶结合使其它配体的结合力降低的效应。结合力降低的效应。&&&&&&&&协同效应&&&&激活剂&&&&抑制剂&&&&&&&&2.4.1.2别构酶的一般特性：&&&&vVmax2Vmax130A[s]0S0.5B[s]v2&&&&13&&&&图2.21别构效应剂的调节作用A为K型效应剂，B为V型效应剂。1.未加效应剂；2.加入v别构激活剂；3.加入别构抑制剂&&&&pHMB脱敏酶&&&&天然酶&&&&[ASP]&&&&图2.22ATCase用对羟汞苯甲酸（pHMB）处理失去别构性质，变为正常的来氏酶脱敏的ATCase活性比天然酶大50%&&&&&&&&a、仅底物是别构调节物&&&&底物是别构抑制剂&&&&VV&&&&1&&&&1负协同&&&&2米氏曲线&&&&90%V&&&&底物是别构激活剂&&&&2&&&&3正协同&&&&3&&&&10%V0&&&&[S]90%V[S]10%V&&&&81&&&&[S]&&&&S曲线：正协同＜81—V↑随〔S〕↑而加快&&&&双曲线：负协同＞81—V↑随〔S〕↑而减慢&&&&&&&&b、当其他别构物参与调节时&&&&V&&&&别构激活&&&&别构抑制底物敏感区&&&&0&&&&[S]&&&&?整体上产生激活、抑制现象&&&&?改变了调节的敏感区位置&&&&&&&&2.4.1.3别构酶的调节活性的机理&&&&1、对称或协同模型（symmetryorconcertedmodel,也称齐变模型、MWC模型）&&&&1965年由Monod、Wyman和Changeux提出。此模型主张变构酶的所有亚基在两种状态间的转变是同时的，齐步发生，这种转变是可逆的，而且各个亚基的排列是对称的。如一种变构酶是由两个相同亚基组成的寡聚体，存在两种状态：RR和TT。R状态表示松驰状态，具有高活性，对底物的亲和力大；而T状态表示紧张状态，具有很低的活性或不具有活性，与底物的亲和力很小。R状态与T状态可以互变。分子的构象或是RR或是TT，而不是RT&&&&该模型的要点:&&&&&&&&2、序变模型（sequentialmodel，也称KNF模型）&&&&1966年由Koshland、Nemethy和Filmer提出。任何亚基都只有两种构象状态，即R和T；结合底物后，改变结合了底物的亚基的构象，成为R态，而未被底物结合的亚基构象并没有发生显著的变化，仍处于T态；一个亚基中底物结合引起的构象变化会使同一酶分子中另一亚基对底物的亲和力增加或减少。RT中的空白活性部位比TT中的部位对底物的亲合力更高。&&&&该模型的要点:&&&&&&&&2.4.2共价修饰调节酶&&&&——通过其它酶对其多肽链上的某些基团进行。&&&&可逆的共价修饰，使酶处于活性/非活性的互变状态，从而调节酶的活性。&&&&&&&&蛋白激酶，磷酸化&&&&?酶&&&&磷酸酶，脱磷酸化&&&&酶-P&&&&由核苷三磷酸（ATP）提供磷酸基酶的活性形式：可能是磷酸化也可能是脱磷酸化&&&&&&&&磷酸激酶&&&&碱性磷酸酶&&&&R&&&&&&&&生理条件下：几乎所有的蛋白激酶都以ATP为磷酸基的供体，几乎所有的磷酸化反应都需Mg2+。&&&&底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基有两类：（1）Thr、Ser、Tyr、Asp、Glu┉P-O键连接&&&&（2）Lys、Arg、His┉P-N键连接&&&&&&&&共价修饰调节酶&&&&?（1）酶原激活：?（2）可逆的共价修饰：&&&&&&&&酶原的激活&&&&酶原(zymogen)：酶的无活性的前体酶原的激活：由无活性的酶原转变为有活性的酶的过程。&&&&酶原激活的意义：在特定的环境和条件下发挥作用；避免细胞自身消化；有的酶原可以视为酶的储存形式。&&&&&&&&酶原激活的机理:&&&&酶原在特定条件下一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽&&&&分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心&&&&&&&&肠激酶&&&&胰蛋白酶原&&&&缬天天天天赖异缬甘&&&&组&&&&46&&&&丝&&&&183&&&&S&&&&S&&&&SS活性中心缬天天天天赖&&&&缬&&&&异甘组丝SS&&&&S&&&&S&&&&胰蛋白酶&&&&胰蛋白酶原的激活过程&&&&&&&&胰蛋白酶原&&&&肠激酶&&&&胰凝乳蛋白酶原六肽&&&&自身催化&&&&弹性蛋白酶原&&&&+&&&&胰蛋白酶&&&&α-胰凝乳蛋白酶+二肽羧基肽酶原A弹性蛋白酶+碎片羧基肽酶A+碎片&&&&肠激酶启动的酶原激活&&&&&&&&（1）酶原激活：&&&&胰凝乳蛋白酶&&&&胰蛋白酶&&&&&&&&16位Ileu位置移动&&&&&&&&催化&&&&&&&&（2）可逆的共价修饰&&&&腺苷酸环化酶&&&&依赖于cAMP的蛋白激酶&&&&&&&&2.4.4酶活性的其它调节方式&&&&?（2）通过与细胞骨架或细胞器表面的缔合解离调节酶活性?（1）寡聚酶通过聚集解聚调节活性：?（3）有些酶的调节亚基具有抑制蛋白或改性亚基的功能，或者有接应蛋白的功能，催化亚基可逆地与这样的调节亚基结合对活性进行调控。&&&&&&&&2.4.5酶活性调节实例&&&&?2.4.5.1天冬氨酸转氨甲酰酶&&&&?Aspartatecarbamoyltransferase，EC2.1.3.2，简称为ATCase）&&&&?是嘧啶核苷酸从头合成中很重要的一个酶，它催化的是天冬氨酸与氨甲酰磷酸生成氨甲酰天冬氨酸和磷酸的反应。&&&&&&&&对大肠杆菌ATCase的研究表明，它是一种别构酶，并具有正协同性，v-[S]图为S型。其活性受嘧啶合成终产物CTP的反馈抑制，但受到嘌呤核苷酸ATP的激活。&&&&大肠杆菌完整的天冬氨酸转氨甲酰酶由12个亚基组成，其中6个为大的催化亚基（C亚基），6个为小的调节亚基（R亚基）。每3个催化亚基构成1个催化三聚体，共有2个催化三聚体。每2个调节亚基构成1个调节二聚体，共有3个调节二聚体。两个催化三聚体构成该酶的两个主要面，调节二聚体构成酶的几个角，呈三角形。该酶的竞争性抑制剂为N-膦乙酰基-L-天冬氨酸（PALA）。&&&&&&&&E.coli的ATCase的亚基排列&&&&催化(C)亚基（catalyticsubunit）&&&&调节(R)亚基（regulativesubunit）&&&&大肠杆菌完整的天冬氨酸转氨甲酰酶由12个亚基组成，其中6个为大的催化亚基（C亚基），6个为小的调节亚基（R亚基）。每3个催化亚基构成1个催化三聚体，共有2个催化三聚体。每2个调节亚基构成1个调节二聚体，共有3个调节二聚体。两个催化三聚体构成该酶的两个主要面，调节二聚体构成酶的几个角，呈三角形。&&&&&&&&ATCase半分子（C3R3)的结构ATCase的半分子结构&&&&catalyticsite&&&&CTPsite&&&&&&&&ATCase所催化的反应&&&&ATCase&&&&氨甲酰磷酸天冬氨酸&&&&氨甲酰天冬氨酸&&&&+&&&&-&&&&UMPUTP&&&&ATP&&&&CTP&&&&&&&&ATCase的别构过度作用&&&&PALA&&&&?&&&&N-磷乙酰-L-天冬氨酸&&&&ATCasealoneCCCCCC&&&&ATCase-PALAcomplex&&&&PALA&&&&?&&&&RR&&&&CC&&&&C&&&&RR&&&&C&&&&RR&&&&RRRRRR&&&&C&&&&C&&&&低催化活性构象&&&&高催化活性构象&&&&T(tense)-态&&&&R(relax)-态&&&&&&&&PALA(N-磷乙酰-L-天冬氨酸)结合到ATCase活性中心的模型&&&&&&&&ATCase变构效应的动力学特征&&&&作为别构酶的典型例子，对大肠杆菌ATCase的研究表明，这种酶具有正协同性，v[S]图为S型，希尔系数1。其活性受嘧啶合成终产物CTP的反馈抑制，但受到嘌呤核苷酸ATP的激活。&&&&Vmax&&&&1/2VmaxKm&&&&C&&&&C&&&&CC&&&&CC&&&&ATP（正效应剂）&&&&RR&&&&C&&&&C&&&&RR&&&&C&&&&RR&&&&RRRRRR&&&&CTP（负效应剂）&&&&C&&&&C&&&&C&&&&低催化活性构象&&&&高催化活性构象&&&&T(tense)-态&&&&R(relax)-态&&&&&&&&2.4.5.23-磷酸甘油醛脱氢酶&&&&?表2.8兔肌3-磷酵甘油醛脱氢酶与NAD+结合的解离常数（mol.L－1）&&&&?3-PGD催化糖酵解解离常数中唯一的脱氢反应，是负协同别构酶的K代表。兔肌3-PGD由4个亚基组成，理论上全酶可结合4分K子NAD+，但结合的亲和力不同(表K2.8)，&&&&123&&&&超离心法测定&&&&平衡透析法测定&&&&荧光法测定&&&&＜5×10－8&&&&＜10－10&&&&1×10－8&&&&＜5×10－8&&&&＜10－8&&&&9×10－8&&&&＜4×10－6&&&&3×10－7&&&&4×10－6&&&&K4&&&&＜3.5×10－&&&&5&&&&2.6×10－5&&&&3.6×10－5&&&&&&&&?实际上通常只能结合2分子NAD+，即酶分子上只有一半NAD+结合位点能被NAD+占据，这种现象称为半位反应性(half-site-reactivity)。?半位反应是一种极端的负协同效应，当第一和第二个NAD+与酶的两个亚基结合后，由于别构效应，使得另外两个亚基对NAD+的亲和力下降2～3个数量级。说明在一定的底物浓度范围内，酶活性不受底物浓度变化的影响，这是另一种意义上的调节。&&&&&&&&2.4.5.3E.coli谷酰胺合成酶&&&&该酶由12个相同的亚基(50ku)组成，形成两个对称的六聚环叠加而成。E.coliGS的活性受到Ala、Gly、His、Trp、AMP、CTP、Car-P和GlcNP等8种含氮代谢物的累积的反馈抑制。这8种别构抑制剂都是由Gln直接或间接提供-NH2合成的，是细胞内氮供应状况主要的“指示剂”。它们中的每一个，当浓度达到一定数值时，就能与GS结合，抑制其一部分活性。通过这种累积的反馈抑制调节GS的活性，使Gln的合成恰好满足细Glu+NH+ATP胞生理活动的需求。&&&&3&&&&4H12ADP&&&&2&&&&OGln&&&&+&&&&4UMPMn2+GSMg2+&&&&-&&&&Ala、Gly、HisTrp、AMP、CTPCar-PGlcN-P&&&&Mg2+和MnATP,&&&&2+&&&&+&&&&AT+PⅡ(UMP)4乙酰转移酶&&&&UR?UT&&&&12ATPAT+PII&&&&+&&&&GlnMg2+12PPiGS&&&&Gln+ADP+PiAla、Car-PGly、GlcN-PHis、AMPCTP&&&&α-kGATP,4PPi&&&&Mn2+&&&&-&&&&+&&&&12PI&&&&M&&&&g&&&&2-kG2+&&&&+&&&&（AMP）12Glu+NH3+ATP&&&&4UTP&&&&尿苷酰转移酶（UT）腺苷酰转移酶(AT)&&&&图2.30E.coli谷酸胺合成酶的调节&&&&&&&&乙酰转移酶&&&&调节蛋白PⅡ谷氨酰胺&&&&&&&&2.4.5.46-磷酸果糖-1-激酶&&&&(6-phosphofructo-1-Kinase,6PF-1-K)&&&&由磷酸果糖激酶1作用可得果糖-1,6-双磷酸。由磷酸果糖激酶2作用可得果糖-2,6-双磷酸。该酶会受到高浓度ATP的抑制，高的ATP浓度会使该酶与底物果糖-6-磷酸的结合曲线从双曲线形变为S型。而柠檬酸就是通过加强ATP的抑制效应来抑制磷酸果糖激酶的活性，从而使糖酵解过程减慢。因磷酸果糖激酶是糖酵解作用的限速酶，因此，对此酶的调节是调节酵解作用的关键步骤。&&&&图2.31可逆磷酸化对6PF-2，6-P2ase活性的调节&&&&6PF-1-K的别构激活剂有Fru-2,6-P2、AMP、ADP、Fru-6-P等，别构抑制剂有ATP、柠檬酸等，其中Fru-2，6-P2并不是糖代谢的中间产物，是专门为调节6PF-1-K和Fru-1,6-P2ase的活性合成的。&&&&?图2.31可逆磷酸化对6PF-2，6-P2ase活性的调节&&&&&&&&磷酸果糖激酶&&&&变构部位&&&&?Phosphofructokinaseintheliverisatetrameroffouridenticalsubunits.&&&&催化&&&&&&&&最重要的调节酶（变构酶）抑制剂：ATP、柠檬酸（碳骨架）激活剂：AMP、ADP6-磷酸果糖、2，6-二磷酸果糖&&&&6-磷酸果糖PFK22，6-二磷酸果糖激活磷酸果糖激酶&&&&前馈刺激作用；抵消ATP的抑制。&&&&&&&&ATP既是该酶作用的底物，又起抑制作用。&&&&酶活性中心对ATP的Km值低，而别构中心对ATP的Km值高。因此，当ATP浓度低时，ATP和酶的活性中心结合作为底物，酶发挥正常的催化功能；当ATP浓度高时，ATP可被酶的别构中心结合，引起酶构象改变而失活，ATP是别构抑制剂。&&&&ATP通过浓度变化影响磷酸果糖激酶活性，调节糖酵解速度。&&&&&&&&糖酵解&&&&糖异生作用&&&&&&&&果糖-6-磷酸激酶ATP&&&&RegulatoryATP&&&&Onesubunitofthetetramericphosphofructokinase-1(PFK-1)&&&&&&&&磷酸果糖激酶是关键酶在糖酵解中由已糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶催化的反应实际上是不可逆的，因此都有调节糖酵解途径的作用。它们的活性受到变构效应物及酶共价修饰的调节。?高浓度ATP对PFK有抑制作用；?ADP和AMP可消除ATP对PFK的别构抑制；&&&&ATP对磷酸果糖激酶的变构调节作用&&&&&&&&柠檬酸和脂肪酸对磷酸果糖激酶的别构抑制&&&&柠檬酸和脂肪酸分别是糖有氧分解中间物和以糖分解中间物为原料合成的产物。&&&&果糖-2,6-二磷酸对磷酸果糖激酶的调节&&&&果糖-2,6-二磷酸激酶(PFK2)催化果糖-6-磷酸(F-6-P)磷酸化形成果糖-2,6-二磷酸(F-2,6-BP)；而果糖-2,6-二磷酸酶(FBPase)催化F-2,6-BP水解去磷酸形成F-6-P。&&&&6PF&&&&PFK2果糖二磷酸酶2&&&&2，6-二磷酸果糖&&&&PFK2和FBPase位于一条多肽链上&&&&&&&&当血液中葡萄糖水平降低时，激活胰高血糖素释放于血液中，启动cAMP级联系统使PFK2/PBPase2多肽上特定的一个Ser残基磷酸化，而使FBPase2活化、PFK2抑制，使F-2,6-BP水平降低，从而也降低了糖酵解水平。&&&&反之，当葡萄糖水平高时，蛋白磷酸酶水解PFK2/FBPase2上的磷酸导致F-2,6-BP升高，提高糖酵解速率。&&&&G过剩，则去磷酸化，协同控制&&&&&&&&ATP&&&&ADP&&&&磷酸果糖激酶2（PFK2)&&&&果糖二磷酸酶2（FBPase2)&&&&Pi&&&&&&&&14.8.2.果糖-2,6-二磷酸对糖酵解的调节&&&&果糖-2,6-二磷酸是PFK的变构激活剂，它可提高果糖激酶与果糖-6-磷酸的亲和力并降低ATP的抑制效应。&&&&果糖-2,6-二磷酸对PFK的激活作用&&&&&&&&果糖-2,6-二磷酸对磷酸果糖激酶的调节&&&&果糖-2,6-二磷酸激酶(PFK2)催化果糖-6-磷酸(F-6-P)磷酸化形成果糖-&&&&2,6-二磷酸(F-2,6-BP)；而果糖-2,6-二磷酸酶(FBPase)催化F-2,6-BP&&&&水解去磷酸形成F-6-P。?但这两个相反催化活性的酶是集两种活性为同一多肽链的双功能酶，即N端一半为PFK2的活性中心，C端一半为FBPase2活性中心，一般写作PPK2/FBPase2。?F-6-P激活其PFK2活性而抑制其FBPase2活性，而F-2,6-BP强烈激活PFK。因此，F-6-P高时促进糖酵解进行。&&&&&&&&一些PFK同工酶亚基序列de组成&&&&&&&&2.4.5.5PyruvateDehydrogenaseComplex&&&&硫胺素焦磷酸&&&&&&&&反应过程&&&&?在复合物内进行的脱羧作用主要可分为5个步骤，丙酮酸与乙醘辅酶A的中间物在复合物里的移动过程，大致依照E1、E2的顺序，E3则没有直接与中间物接触。其中丙酮酸是在第一个步骤（E1中）加入反应，乙醘辅酶A是在第三个步骤（E2中）中生成。?A.在第一个步骤中，丙酮酸上的羧基会形成二氧化碳然后释出；中间的碳原子则会与E1中的TPP结合形成羟乙基TPP（HydroxyethylTPP），对丙酮酸来说是个氧化反应。这个步骤是所有步骤中最慢的一个，因此决定了整个反应的速率。?B.接下来TPP会将羟乙基带入第二个步骤，TPP本身则留在E1中继续作用。羟乙基氧化之后变成乙酰基，并进入E2，与硫辛酰基上的其中一个硫原子结合，已经氧化过的硫辛酰基离氨酸与乙酰基结合，成为酰基硫辛酰基离氨酸（Acyllipoyllysine）。?C.第三个步骤在E2进行，酰基硫辛酰基离氨酸会与辅酶A进行反应，此反应会使硫辛酰基离氨酸还原，并释出乙酰辅酶A。硫辛酰基离氨酸则经过下一步骤的氧化之后回到第二步骤作反应。?D.第四个步骤中，E3的辅成基FAD会使上一步骤中还原的硫辛酰基离氨酸再度氧化，以回到第二步骤；而FAD经过反应之后，会变成FADH2。?E.最后FADH2与NAD+反应而氧化成FAD，回到第四步骤。NAD+则还原成NADH，并且放出一个氢离子。&&&&&&&&?丙酮酸脱氢酶复合体会受到三种方式调控，第一种称为产物抑制，也就是复合物所催化生成的产物乙酰辅酶A与NADH，能够抑制复合物的作用能力。其中乙酰辅酶A抑制的对象是E2，NADH则是抑制E3。除此之外，这两种抑制物氧化之后生成的辅酶A与NAD+，则能够促进复合物的作用。第二种调控方式是由核苷酸来执行，例如GTP有抑制作用，AMP则有促进作用。?第三种称为共价修饰作用，当E1中的丝氨酸残基被ATP磷酸酯化之后，复合物会失去活性；反之如果磷酸酯化产生的磷酸酯基被水解掉，则复合物会再度活化。另外磷酸酯化作用本身又受到丙酮酸的抑制；并且当ATP/ADP、乙酰辅酶A／辅酶A，以及NADH/NAD+的比值高时，将有促进磷酸酯化的效果。&&&&&&&&2.5酶学研究新领域&&&&?2.5.1核酶?2.5.2极端酶研究进展&&&&5.2.1嗜高温的稳定性因素&&&&5.2.2极端酶的制备&&&&5.2.3极端酶的应用&&&&&&&&2.5.2极端酶研究进展&&&&?地球上最极端的环境条件，如地热泉和深海热喷泉80℃的水温，极地的低温，煤沉积层和含硫地热泉pH2的酸性环境，污水中pH11的碱性环境以及2～5mol.L－1NaCl的高盐环境，也存在微生物，称为极端菌或嗜极菌(extremophiles)。与人们熟知的原核生物和真核生物不同，大多数极端菌属于最原始的细菌——古核菌。这些极端菌含有在极端条件下保持生物活性的酶，称为极端酶(extremenzymes)。&&&&&&&&?酶作为高效、专一的生物催化剂，已广泛应用于化工、医药、食品、轻工等领域，但是酶易变性，稳定性差，一直制约着酶技术的发展与应用。而极端酶在一般酶不能容忍的极端条件下保持活性，因此成为解决上述难题的希望，极具开发前景。随着极端菌基因组测序工作的进展，极大地加快了极端酶的研究进程。同时，对极端酶的分离、鉴定、稳定性、底物特异性以及对映体选择性的深入了解，大大提高了在分子水平上对极端酶的认识，为生物催化技术的发展注入新的活力。&&&&&&&&2.5.2.1嗜高温的稳定性因素&&&&?从嗜热菌P.furiosus中分离的酶最适温度为98～100℃；T.maritima中分离的酶最适温度为～80℃。对嗜高温酶与相应常温型酶的氨基酸序列进行了比较，结果还不能很好地解释嗜高温酶的热稳定性。嗜热菌P.furiosus和T.litorlis的谷氨酸脱氢酶序列有87%相同，而与常温型谷氨酸脱氢酶序列仅有35%相同。&&&&&&&&?还发现一些嗜高温酶中的天冬酰胺和谷酰胺随最适温度的升高而减少。对P.furiosus红铁氧还蛋白和醛铁氧还蛋白的晶体结构以及铁氧还蛋白二级结构的研究显示，嗜高温醛铁氧还蛋白的表面积较小，活性部位为钨和喋呤，而常温型则为钼和喋呤辅因子，表面积较大。核磁共振和晶体图分析暗示，热稳定性可能与表面几个氨基酸取代有关。与常温型相比，嗜高温铁氧还蛋白有3股β-片而不是两股，还有较短的环、较长的α-螺旋和两端之间的盐键。&&&&&&&&2.5.2.2极端酶的制备&&&&?极端菌也只在相当窄的温度、pH等条件下生存，如超级嗜热菌Pyrocdccushorikoshii最高生长温度为110℃，85℃时生长速度很慢。因此，标准的工业发酵和下游纯化技术不适用于极端酶的制备。目前主要是利用基因工程技术将极端菌中的目的基因转移到普通宿主菌中，就能在温和的条件下利用普通的发酵设备和纯化方法，大量制备极端酶。&&&&&&&&?例如在E.coli中成功表达了P.furiosus的3-磷酸甘油醛脱氢酶(1990年)；Thermotoga的4-α-葡聚糖转移酶、β-D-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、乳酸脱氢酶等；T.neapolieana的木糖异构酶(1995)。由于E.coli与古核菌对几个密码子的使用频率有较大差异，如古核菌编码Arg较多的酶或蛋白质在E.coli中表达率大大下降。为了提高表达效率，可用富含Arg、Leu、IletRNA的coden-plus细胞表达极端菌基因。&&&&&&&&?细胞内的酶通常在特定的环境条件和分子伴侣等存在下才能折叠成活性构象，而工程菌的生存条件与极端菌明显不同，因此，由普通宿主菌合成的极端酶往往需经特殊处理才有活性。例如在30～37℃下合成的嗜高温谷氨酸脱氢酶可通过加热到80～85℃来激活；嗜盐酶在E.coli中表达后形成无活性的包涵体，可先用高浓度尿素变性，再置于3～5mol.L－1的NaCl中复性，就可得到活性类似于天然酶的产物。&&&&&&&&?2.5.5酶工程进展?2.5.5.1化学酶工程&&&&(1)天然酶&&&&&&&&?(1)天然酶工业用酶制剂大多通过微生物发酵制取，如洗涤剂和皮革生产用的蛋白酶；造纸和棉布退浆用的淀粉酶；乳品加工用的凝乳酶等，多为比活力较低的粗酶制剂，品种少，应用范围窄。由于各种分离技术的发展，天然酶分离纯化也随之取得长足的进展。目前医药和科研所用的酶多数从生物材料中分离纯化。&&&&&&&&(2)化学修饰酶&&&&&&&&酶分子修饰的方法有：①部分水解酶蛋白的非活性主链；&&&&②利用小分子或大分子物质对活性部位或活性部位以外的侧链&&&&基团进行共价修饰；③酶辅因子的置换等。酶的化学修饰主要是利用修饰剂所具有的各类化学基团的特性，与酶分子上的某种氨基酸残基（一般为非必需基团）产生化学反应，改造酶分子的结构与功能。酶分子的化学修饰技术较简单，容易见效。例如使用聚乙二醇修饰嗜热菌的蛋白酶可以改变酶催化反应的类型，现已用&&&&于甜味剂的合成。&&&&&&&&酶化学修饰时应注意：&&&&①修饰剂的要求&&&&要求修饰剂具有较大的分子量、良好的生物相容性&&&&和水溶性，修饰剂表面有较多的反应基团及修饰后酶活的半衰期较长。②酶性质的了解应熟悉酶活性部位的情况、酶反应的最适条件和稳定条件以及酶分子侧链基团的化学性质和反应活性等。&&&&&&&&③反应条件的选择尽可能在酶稳定的条件下进行反应，避免破坏酶活性中心功能基团，因此必须仔细控制反应体系中酶与修饰剂的分子比例、反应温度、反应时间、盐浓度、pH值等条件，以得到酶与修饰剂高结合率及高酶活回收率。&&&&&&&&(3)固定化酶&&&&酶的固定化方法&&&&不同的酶要根据具体的应用目的选择特定的固定化方法。固定化方法可分为：①载体结合法（包括物理吸附、离子结合法、螯合法、共价结合法）；②交联法；③包埋法（包括聚合物包埋法、疏水相互作用、微胶囊、脂质体包埋）。&&&&&&&&?(4)摹拟酶在深入了解酶的结构与功能以及催化作用机制的基础上，用化学半合成或全合成法制备的人工酶称摹拟酶。例如肌红蛋白有结合O2的性质，与电子传递催化剂[Ru(NH3)3]3+共价结合，产生的半合成摹拟酶能氧化抗坏血酸等有机物，催化效率接近于天然的抗坏血酸氧化酶。全合成酶利用非蛋白质有机物作为基本骨架，再连接上酶活性中心的基团，可专一地结合底物并催化底物发生反应。&&&&&&&&?例如用β-环糊精为基本骨架以“固定”底物，在环糊精上引入邻-硫代咪唑代苯甲酸侧链，构成了胰凝乳蛋白酶的摹拟酶β-benzyme。环糊精提供的羟基与侧链上的咪唑基、羧基共同组成一个电荷中继网，如图2.34所示。这种摹拟酶催化芳香酰乙酯类水解的反应速率与天然酶相近，而热稳定性和pH稳定性大大优于天然酶，至少在80℃仍保有活性，在pH2～13的大范围内也不致失活。&&&&COOH&&&&催化侧链&&&&N&&&&NH&&&&HOS&&&&环糊精&&&&图2.34人工模拟酶β-benzyme，有一小的侧链连接到不糊精上，可模拟胰凝乳蛋白酶&&&&&&&&?国内有人制备了三肽Glu-γ-Ser-Gly，再与苯甲基磺酰氟(PMSF)和硒化氢(H2Se)相继反应，得到Glu-SelCys-Gly三肽，就能摹拟谷脱甘肽过氧化物酶的作用，对GSH的Km比天然酶小一个数量级以上，对H2O2的Km则大于天然酶一个数量级。摹拟酶的研究虽已取得可喜的成果，但大多数摹拟酶的催化效率远不及天然酶，要达到实际应用还有相当长的距离。&&&&&&&&2.5.5.2生物酶工程&&&&生物酶工程包括：①用基因工程技术大量生产酶。②修饰酶基因，产生遗传修饰。③设计新酶基因，合成自然界不存在的酶。重组DNA技术使人们在很大程度上摆脱了对天然酶的依赖。基因工程使人们较容易地克隆天然的酶基因，使其在微生物中高效表达。目前已有100多种酶基因克隆成功，包括尿激酶基因、凝乳酶基因等。&&&&&&&&酶基因克隆及表达步骤&&&&&&&&酶的遗传设计的目标是设计出具有优良性状的新酶基因。虽然已有近三百种蛋白质晶体学结构数据，从中获得了一些结构规律性，但直接从蛋白质的氨基&&&&酸顺序来推测它的三维结构还有一段相当的距离，因&&&&此酶的遗传设计还只是一个美好的梦想。但随着对蛋&&&&白质化学、蛋白质晶体学、酶催化本质等的进一步了&&&&解，再加以适当的技术是可以实现的。&&&&&&&&The&&&&END&&&&&&&&}