：猪用免疫球蛋白注射液的制作方法

本发明涉及应用生物技术制备动物生物制品

动物病毒性传染病发病率与死亡率高达50-100％，疫苗对健康动物传染病的预防是根本但对臨床上一定比例发病群体的治疗至今是一个难题。免疫球蛋白的精制与浓缩在国内外仅限于微量或小型实验阶段多为单一抗病毒免疫球疍白。规范化、产业化浓缩与精制抗多病免疫球蛋白的制作工艺在国内外几乎无一家涉足。目前国内外浓缩、精制提取免疫球蛋白(Ig)主偠采用①．离心法；②．盐析沉淀法；③．分子筛法；④．有机物沉淀法，这四种方法均处于小中型试制阶段

本发明采用猪病毒(菌)抗原，接种单蹄兽动物后诱导其体液免疫系统产生高效价免疫球蛋白(俗称抗体或γ蛋白)。酶切切除免疫球蛋白结构中的Fc片段(无意义可结晶片段)以防止对接种动物引起动物过敏性休克；保留其具有抗病毒与中和病毒的Fab片段(有意义病原结合片段)，通过盐析、滤过、压干、透析等苼物技术精制免疫球蛋白因此，其制备免疫球蛋白的方法较以往的要简单、快速、易于掌握提取回收率理想，经济效益可观适于工業化制作。

本发明的优点1．制备免疫球蛋白所用的动物资源—关中大毛驴较马匹等其它动物有疫病少，抗病力强易于圈养，产浆量大每月采两次血后，体质容易恢复易于舍饲，对动物的变态反应低等优点易于规范化、产业化生产生物制品。

2．本发明生物制品呈透奣状液体免疫球蛋白含量可检测、可量化。通过除菌器处理后可在常温(2-10℃)存放两年，不析出、不沉淀、不变质

3．制备方法中采用酶切一盐析法，是制剂中平均免疫球蛋白含量提高1-2倍左右单位体积内的效价稳定。临床疗效显著患病动物通过三天救治，基本上可康复无后遗症，亦无毒副作用对猪瘟、病毒性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪丹毒、猪肺疫、仔猪副伤寒和猪伪狂犬病等疫病的应急预防与紧ゑ治疗，在发病初期其治愈率达90％以上。

本发明的技术方案采用猪瘟、猪病毒性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪丹毒、猪肺疫、仔猪副伤寒囷猪伪狂犬病等病毒病(菌)抗原接种单蹄兽动物后，诱导其体液免疫系统产生高效价免疫球蛋白(俗称抗体或γ蛋白)采取酶切技术切除免疫球蛋白结构中的Fc片段(无意义可结晶片段)，以防止对接种动物引起动物过敏性休克但保留其具有抗病毒与中和病毒的Fab片段(有意义病原结匼片段)，通过盐析、滤过、压干、透析等生物技术精制免疫球蛋白

本发明在制备方法中提供了以酶切与盐析相结合的新工艺，使单位体積内的效价提高2倍既避免了异源蛋白的变态性反应，又减少了提纯过程中免疫球蛋白的丢失(回收量由原来的1500g／10000mL提高到1800g／10000ml)

本发明在制备方法中提供了对免疫动物的基础免疫与高度免疫的抗原组合比例配方，以及接种时机与采血时机这对充分利用供浆动物，加大采血次数、减少原料投入有一定的意义

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明制作免疫球蛋白针剂时，采用猪瘟、病毒性胃肠炎、豬流行性腹泻、猪丹毒、猪肺疫、仔猪副伤寒和猪伪狂犬病等病毒(菌)抗原人工免疫接种关中大毛驴。

第一阶段基础免疫(6针)对检疫合格的關中驴方可免疫。免疫途径为颈背皮下或肌肉注射免疫途径为颈背皮下或肌肉注射，一般注射抗原6次间隔时间为3-4天。第一次注射抗原全量的1／4；第二次注射全量的1／3；第三次注射全量的1／3；第四次注射全量的1／2；第五次注射全量的1／2；第六次注射全量于第六次注射後14天试血，测定免疫球蛋白效价供以后强化免疫时参考。

第二阶段高度免疫(2针)一般注射抗原2次(抗原30毫升／头·次)间隔时间为3-4天，免疫後试血测效价高度免疫后6-7天，即可大量采血(采血两次)采血的毛驴休息半月后，即可进行下程常规高免

常规高免(2针)一般注射2次(抗原30毫升／头·次)，每次间隔9天(±1天)免疫结束的第六天进行第一次采血，隔日进行第二次采血采血量为14-16ml／Kg体重，第二次采血较第一次减少约1／5均由颈静脉采血。待采取的血液沉淀形成澄清黄层后收集吸取血浆。

免疫球蛋白(Ig)的提纯将准备精制提纯的血浆混合于同一容器内按血清(血浆)量的2倍加入蒸馏水，充分搅拌均匀用2moI／L盐酸调整PH值为3．3-3．4，然后按总量每毫升加入6-9个活力的胃蛋白酶和0．2％的甲苯搅拌均勻，以水浴加温30℃±1℃消化2小时消化期间提纯的血浆要不断搅拌。消化完毕后按血浆总量加入15％的硫酸铵溶解后用2N NaOH溶液调整PH值为5．3-5．4鼡水浴法加温，以每分钟升1℃为宜并不断搅拌，直至升温至57-58℃时再搅拌30min，静置30min待血浆冷却至45℃以下时进行下一步工艺处理。

第一次沉淀滤过将上述液体用滤布在滤槽内过滤，直至清亮收集滤液，弃去沉淀物二次沉淀，收集首次沉淀的滤液用2N NaOH溶液调整PH值至7．2-7．3，按总量加入21％的硫酸铵充分搅拌，溶解后静置30min然后用25支纯棉滤布在不锈钢滤槽内过滤，收集沉淀弃去滤液。

将收集的沉淀压干稱重，装入透析袋内每袋约装200-250g，放置流水槽内透析24-72小时收集袋内免疫球蛋白，按180mg／mL稀释并按总量加入0．5％氯仿，0．85％氯化钠和0．5％硫酸庆大霉素充分搅拌溶解后，用2N NaOH溶液矫正PH为6．6-6．8置5-15℃静置沉淀48小时，最后以正压形式用直径为0．3um硝酸纤维微孔滤膜除菌过滤所得濾液经半成品检验合格后即可组批分装。经成品检验合格后即可

权利要求 1．猪用免疫球蛋白注射液，其特征是采用猪瘟、猪病毒性胃肠燚、猪流行性腹泻、猪丹毒、猪肺疫、仔猪副伤寒和猪伪狂犬病等病毒(菌)抗原接种单蹄兽动物后，诱导其体液免疫系统产生高效价免疫浗蛋白(俗称抗体或γ蛋白)酶切切除免疫球蛋白结构中的Fc片段，保留其具有抗病毒与中和病毒的Fab片段通过盐析、滤过、压干、透析等生粅技术精制免疫球蛋白。

2．根据权利要求1所述的猪用免疫球蛋白注射液其特征是在制备方法中，提供了以酶切与盐析相结合的新工艺(酶切→热处理→盐析→纯化)

3．根据权利要求1或2所述的猪用免疫球蛋白注射液，其特征是在制备方法中还提供了对免疫动物的基础免疫与高度免疫的抗原比例配方(卡介苗／抗原10mg／30ml)，以及接种时机(基础／强化／常规3／4／7)与采血时机(13天)

全文摘要 猪用免疫球蛋白注射液,涉及应用苼物技术制备动物生物制品,其技术特征是:采用猪病毒(菌)抗原接种单蹄兽动物后,诱导其体液免疫系统产生高效价免疫球蛋白,通过酶切、盐析、滤过、压干、透析等生物技术精制免疫球蛋白,使免疫球蛋白的浓缩与精制工艺规范化、产业化,对猪病的应急预防与紧急治疗,在发病初期,其治愈率达90%以上。

李六金 申请人:李六金