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实时荧光定量PCR实验体系的设计与优化---相关文章文档分类：
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下载所得到的文件列表茎环法与加PolyA尾法PCR在检测MicroRNA时引物设计的策略.pdf
文档介绍：
中图分类号:!’+-$’)文献标识码:&文章编号:’(()*+’),()(’))(-*(+,^*(#!综述!茎环法与加H&*;2尾法H98在检测7-$1&8O2时引物设计的策略高润石’,王红),高艾+(’.首都医科大学(&级七年制临床医学’班,北京’(((%&;).北京化工职防院体检科;+.首都医科大学公共卫生与家庭医学学院)关键词:\97?A!F&;实时定量Y0!;茎环法;加尾法;引物设计基金项目:国家自然科学基金(FHZ0:^’’,)%+&%+(^((&(-)
,北京市自然科学基金(R9!F&与YEKF相互作用对苯毒性的影响,,’’+’#&)和北京市人才强教深化计划中青年骨干教师基金(YM!HH)(’((^+&’)项目作者简介:高润石,首都医科大学(&级七年制临床医学’班学生,研究方向:毒物致病机制$通讯作者:高艾,博士,副教授,硕士研究生导师,研究方向:职业毒物致病机制$\97?A!F&(R9!F&)是一种长约’^d)-个核苷酸的非编码!F&,对基因的表达调控发挥着重要的作用$对于R9!F&的实时定量Y0!与以往的Y0!有些不同,这主要是因为R9!F&的自身结构比较特殊$其最大的特点就是长度过于短小,仅仅二十几个碱基的核酸片段无法直接应用常规的Y0!技术扩增$所以,在针对R9!F&的Y0!技术中,必须要延长待测R9!F&的长度,构建出一个足够长的Y0!模板,才能进一步应用Y0!技术来定量分析$本文介绍的)种方法,茎环法和加尾法,在原理上有所差异$茎环法的原理是,设计一种特殊的茎环结构的反转录引物,在反转录反应中直接完成模板链的延长;而加尾法的思路则是先对R9!F&进行加YA2P&尾处理,改造成R!F&的结构,再采用R!F&常用的A29VA(4E)反转录引物进行反转录,从而得到较长的模板链$=引物设计=&=引物设计原则无论是茎环法还是加尾法,其引物的设计最终要得到’一对半&,’一对(是指Y0!扩增的上下游引物,’半(是反转录引物$)种方法的反转录引物设计原则不同,而Y0!扩增引物的设计原则是相同的,也遵守常规Y0!的引物设计原则$=&?茎环法=&?&=反转录引物设计:’茎环(即指反转录引物$茎环结构不但能有效地延长R9!F&的长度,同时它自身互补的构象可以避免与其他同源基因结合,减少了非特异性扩增的几率$整个引物由)部分组成,一个通用的茎环结构和-d^个与目的R9!F&的+t端反向互补的碱基$这种通用的茎环结构由0I&:等[’]设计,其序列为:-t1GE0GE&E00&GEG0&GGGE00G&GGE&EE0G0&0EGG&E&0G&01+t$其中下划线部分为茎环自身互补部分$随后在该序列的+t端加上-d^个碱基,与目的\97?A!F&的+t端反向互补$以I=B1R9?1)%B的-Y成熟序列(R9!JB=&)为例$其序列为-t1NN0&&GN&&N00&GG&N&GG0N1+t,则设计反转录引物为:-t1GE0GE&E00&GEG0&GGGE00G&GGE&EE0G0&0EGG&E&0G&0&G00E&E1+t$前一部分是通用茎环,后一部分与目的R9!F&的+t末端互补$反转录引物+t端碱基的数量为-d^个,对于具体数值,近几年的文献说法不一,有说-个的,也有说不能少于,个的,但上界明确,都未超过^个[)1&]$此外,对引物+t末端的碱基也未见特别强调,&uEu0uG均有出现$=&?&?Y0!扩增引物设计:Y0!扩增引物是根据反转录后得到的模板链设计的一对引物,包括一条上游引物和下游引物,它们与模板链两端的片段相互补$此方法设置下游引物为通用引物,所以只需设计上游引物$通常,引物都是模板链上的一部分$而茎环法的上游引物较特殊,是由-t端碱基(模板外)与R9!F&特异序列(模板内))部分组成的$这源于茎环法特殊的模板链延长方式$设计Y0!扩增引物时,要考虑到实验过程,必须注意的是,在反转录后的扩增中,反应体系中还存在着大量剩余的反转录引物,所以在上游引物设计的时候,不能与反转录引物有重叠,否则会得到反转录引物和上游引物的二聚体,导致错误的结果$然而不与反转录引物重叠的部分不足’^个碱基,若想使引物长度不变,只能使得上游引物延伸到模板链外侧(如原理图所示)!EB:V等[’(]提出了上游引物’-t通用序列(的说法,但是,上游引物-t端的碱基要与目的R9!F&相适应,不同的R9!F&序列之间差异!^,+!毒理学杂志)(’)年’(月第)%卷第-期DEAS97A267&A@&?)(’)_A2$)%FA$-很大,使用同样的序列可能使设计出的上游引物的ER值%G0比出现很大问题$-t端通用序列不可能适用于所有R9!F&,也就是说它并不具有通用性$时宿妹等[&]在研究中对比了)种方法的引物,茎环法的引物合格率较加尾法低很多,提出了茎环法设计较困难的结论$在此解释为应用了’-t通用序列(所致$所以在解决这个问题时,要配合不同的目的R9!F&的模板链,用引物设计软件一一尝试$同样以I=B1R9?1)%B为例,其模板链为:-t1GE0GE&E00&GEG0&GGGE00G&GGE&EE0G0&0EGG&E&0G&0&G00E&E00EGG&EE&0EEG&&1+t$下游通用引物为:-t1G0&GGGE00G&GGE&EE01+t(与模板前灰色部分相同)!上游引物为:-t1G&GEGEEE0&&GE&&E00&GG1+t(与模板后灰色部分互补)!上游引物与I=B1R9?1)%B的序列对比:-t1NN0&&GN&&N00&GG&N&GG0N1+t$其中下划线部分为-t端碱基,其作用就是要延长上游引物长度,并调节G0比值和ER值,使其能配合下游引物完成扩增$=&@加YA2P&尾法=&@&=反转录引物:加尾法的反转录引物实际上就是处理R!F&所用的通用A29VA(4E)引物[’’1’+]$在反转录前有一个步骤是为!F&样品加YA2P&尾,然后反转录$所以它的反转录引物中包括:一段通用序列%一段多聚E和一个单碱基锚定$单碱基锚定的概念源于R!F&分析技术中的差异显示(h9QQ&?&:&9B249=T2BP)技术[’#1’-]$其原理是借助R!F&的YA2P&尾,对大量的R!F&进行分类$这种在多聚E后加上一个&或0或G的简并反转录引物,能将所有R!F&分类为+种,这就是单碱基锚定$给R9!F&加上了YA2P&尾后也可以用这种方法,设计简并反转录引物$例如,-t1G0EGE0&&0G&E&0G0E&0GE&&0GG0&EG&0&GEG(E))#_(&uGu0)1+t[’%]-t1G0EGE0&&0G&E&0G0E&0G1+t%%%对应的通用Y0!下游引物或-t1G0G&G0&0&G&&EE&&E&0G&0E0&0E&E&GG(E)’)_(&uGu0)F1+t[’’]-t1G0G&G0&0&G&&EE&&E&0G&01+t%%%对应的通用Y0!下游引物,_为锚定碱基$也就是说,研究者只需合成这+种反转录引物就足够了$在反转录时,将+种引物一同加入反应体系中,将所有序列反转录$=&@&?Y1
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