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全基因组测序技术在预防医学中的应用综述
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　　在疾病流行过程中，病原体的基因组会以一定速率发生变异，这些变异忠实记录了病原传播所经历的自然选择和遗传漂变的作用，下面是一篇探究全基因组测序技术应用的论文范文，供大家阅读借鉴。　　传染病疫情暴发严重危害人类健康，造成巨大的经济损失。尤其是新型病原微生物出现并迅速扩散时，如严重急性呼吸综合征、新型禽流感、德国出血性大肠杆菌疫情等，还会引起社会的普遍影响。预防医学工作者对疾病的流行规律，以及对引起疾病的病原微生物本身缺乏足够认识，是很多情况下疫情防控措施不够合理的重要原因;而缺乏对新型病原和疾病的了解，是导致民众产生恐慌的因素之一。因此，在疫情出现早期，快速获得病原特性，掌握疾病流行规律，是实现有效防控的重中之重。　　对病原微生物的全基因组序列测定可以迅速提供疫情防控所需要的信息[1-4].基因组是遗传物质的载体，也是形成微生物特定表型的本源。在疾病流行过程中，病原体的基因组会以一定速率发生变异，这些变异忠实记录了病原传播所经历的自然选择和遗传漂变的作用[5].因此，测定病原微生物的全基因组序列，并应用比较基因组学和群体遗传学的分析方法研究这些序列及其变异情况，将能够预测病原微生物的重要表型，并反演病原传播的途径和选择压力。这些信息的获得将为针对性预防治疗和传播过程追溯提供必要的数据支持。　　在过去30年中，基于基因组序列片段的分子分型方法与流行病学技术的结合极大地丰富了我们对病原的认识，脉冲场凝胶电泳、多位点串联重复序列分析、多位点序列分型(multilocussequencetyping，MLST)等技术已经在国家疾病防控体系中广泛应用。但是直到近十年前，分辨率最高的全基因组序列分析却始终徘徊在主流预防医学研究领域之外，其主要原因是基于双脱氧链终止法的第一代核酸测序技术成本过高，且进行全基因组测序的周期太长(通常需要整年的时间)，不适合常规监测以及应对突发疫情的需要。　　2005年起，新一代测序技术走上历史舞台，将单个细菌全基因组序列测定所需的时间从1年缩短到几天甚至几个小时，测序成本也大幅度降低[6]，至此全基因组测序技术才真正跨越基础研究的范畴，开始走入预防医学临床应用的广阔天地，并为该领域的研究带来革命性变革[4，7].　　本文从流行病学调查和溯源、病原体特性预测、疾病流行规律分析、疫苗变异监测和使用效果评价4个方面，对全基因组测序技术在预防医学领域中的应用进行综述。　　1、流行病学调查和溯源　　全基因组测序技术在预防医学中最直接的应用就是流行病学调查分析。病原体在不同宿主、媒介中复制和传播时，其基因组变异会以一定概率发生并累积下来。通过全基因组测序检测这些变异，并利用比较基因组学和群体遗传学分析手段重建样本间的系统发育关系，可以推测不同来源的病原体之间的传播关系，从而为流行病学和微生物法医学调查提供更完善的证据和补充。　　此类研究最早应用于加拿大的一起社区胸膜结核疫情的回顾性流行病学调查[8].该社区在2年时间里陆续观察到41例患者。Gardy等[8]对来自患者的结核分枝杆菌进行测序和系统发育分析，并与传统流行病学调查数据获得的患者社会网络互相叠加，精确判定了传染源和传播途径。研究发现了引起多人感染的超级传播者，并证明疫情实际由2起同时发生，但具有各自独立传播途径的流行组成。该研究首次将全基因组序列分析整合到传统流行病学研究中，有力证明了全基因组测序技术在流行病学调查中的作用。全基因组测序的高分辨率特性使其在院内感染调查中起到不可替代的作用。　　2009年，英国剑桥医院的新生儿监护病房发生了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)感染流行[9].由于同一家医院的MRSA分离株遗传距离非常接近，传统分型方法无法检测出不同患者MRSA分离株之间的差异，也无法判断院内感染源头和传播途径。而结合全基因组测序分析以及菌株的分离时间等信息，研究者得以清楚区分暴发菌株和普通患者携带的非暴发菌株，从而排除非暴发菌株携带者对流行病学调查造成的干扰，确定疫情流行的过程。另一个典型例子是对碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌院内暴发的分析[10].该研究将全基因组序列分析结果与患者出、入院及住院病房等资料结合，鉴定出传染源是一例患者，并发现该患者通过3条独立的传播路径引起其他17例院内感染。其中有2条传播途径涉及到无症状携带者以及医院下水道、通风系统等，这是通过基因组学分析发现而被传统流行病学调查手段所忽略的。　　因此，基因组分析能够丰富传统流行病学研究结果，为制订有效防控措施奠定了科学基础。　　全基因组序列分析还可应用于跨大洲的国际流行病学溯源研究。2010年10月，海地暴发了百年来首次霍乱疫情。疫情源头是来自拉丁美洲本地菌株还是联合国维和部队带来的外来菌株，曾一度引起强烈争议[11].通过对2株暴发菌株进行测序，并与拉丁美洲流行株和亚洲菌株序列进行比较，研究人员初步得到了问题答案：海地霍乱暴发不是拉丁美洲当地菌株所致，而是由于人类活动从遥远的外地带入[12].通过对更多暴发菌株及全球霍乱代表株进行全基因组序列分型(wholegenomesequencetyping，WGST)，研究者发现南亚尼泊尔地区与海地的霍乱分离株WGST结果一致。尼泊尔分离的霍乱菌株可分为4个遗传发育分枝，海地暴发菌株是其中之一，与该分支其他尼泊尔菌株之间仅存在1或2个碱基的差异，证明海地霍乱暴发菌株来源于尼泊尔地区[13].上述分析为WHO对海地霍乱流行病学调查的最终结论提供了坚实证据，成为认识疫情流行规律与实施有效防控措施的关键。　　2、病原体特性的快速判定　　通过对病原体全基因组序列的功能注释，以及与毒力因子数据库、耐药基因数据库等进行查询比对[14-15]，可以预测包括病原体环境生存能力、毒力及耐药谱等的重要表型特性，为临床用药给予指导。尽管表型试验成本相对较低，也容易在普通实验室实现，但基于全基因组序列的病原体特性预测对于新型病原体和生长速度非常慢的病原体仍然有非常高的实用价值。　　月，大肠杆菌疫情在德国北部暴发，很快席卷整个德国和欧洲部分国家，并蔓延至美国和加拿大。合计感染人数达4000例以上，其中三分之一以上病例发展为溶血性尿毒综合征，超过50例死亡。尽管患者症状表现为典型的肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhageEscherichiacoli，EHEC)感染，但病原培养特性和MLST分析却发现暴发菌株与EHEC差距甚远，因此怀疑该菌株是一种新型致病性大肠杆菌[16-17].我们在疫情暴发之初，应用IonTorrentPGM测序仪3d内完成了暴发菌株的测序，迅速确定了病原的性质[18].将暴发菌株与当时已发表的30株大肠杆菌完成图序列进行系统发育分析，结果表明导致暴发的菌株与肠聚集性大肠杆菌属于同一进化分支，但由于获得了编码志贺毒素的stx2基因，从而表现出EHEC的致病特点。对暴发菌株序列的注释结果表明，该菌株还携带了Ⅰ型聚集性粘附菌毛蛋白等毒力因子，以及27个耐药基因和19个重金属抗性基因，其中耐药基因预测结果与德国科赫研究所公布的暴发菌株耐药表型谱高度一致。上述遗传因子可能增强了该菌株的环境生存能力，从而促进病原的大范围传播。以上研究结果为认清病原特性、制订针对性防控措施提供了重要依据，也为暴发菌株的特异性检测方案设计打下基础[19].　　抗生素耐药的全球扩散是WHO提出的威胁人类健康的全球三大首要问题之一，而结核分枝杆菌耐药性的研究一直是该领域的热点[20].由于结核分枝杆菌生长速度极慢，通过传统培养和表型方法进行耐药谱检测，至少要花费几个星期。　　2013年新英格兰医学杂志上发表的一篇报道中，研究者将患者痰液放入分枝杆菌生长指示试管(mycobacterialgrowthindicatortube，MGIT)中进行培养，3d后直接从培养物中提取DNA，并使用IlluminaMiSeq测序仪进行测序[21].结果鉴定出患者混合感染了2种不同的结核多耐药菌株，并通过耐药基因的变异情况预测了耐药谱。通过序列分析获得的耐药谱准确包含了参考实验室通过培养检测得到的全部9种抗生素的耐药情况，并预测菌株可能对另外5种抗生素耐药(参考实验室未进行实验验证)。这项研究利用全基因组测序技术，将结核分枝杆菌耐药谱检测时间从几个星期缩短到几天，其推广应用将为结核分枝杆菌耐药的临床诊断带来革命性变化。　　3、疾病流行规律分析和预测　　使用群体遗传学方法，对病原体的历史分离株进行全基因组序列分析和进化研究，可以推测病原的长期流行情况，深入认识其所致疾病的流行规律。流感是最常见的呼吸道传染病，每年在全球造成几十万人死亡。通过北半球(美国纽约)和南半球(新西兰)在12年间分离的上千株甲型流感病毒的序列分析，Rambaut等[22]提出了流感流行的源库模型(source-sinkmodel)。他们推测，流感病毒的遗传多样性在位于热带地区的宿主种群中(source)持续产生，并在强烈的自然选择作用下发生抗原漂变等变异。随后，在热带地区变异后的流感病毒季节性传播到南北半球的温带地区(sink)并在当地造成流行。因此，要从根源上遏制流感疫情，不仅要对流行区域进行疫苗接种等防控措施，还须要重视对热带地区流感宿主种群的研究。　　鼠疫菌是对人类历史影响最深远的病原之一，曾导致3次世界范围的大流行。但由于缺乏病原学证据，前2次大流行(公元6世纪的查士丁尼瘟疫和14-17世纪的中世纪黑死病)是否为鼠疫菌所致在学术界一直有争议。直到近年来，通过对死于前2次瘟疫的患者尸骨中提取的古DNA进行全基因组测序，才为这些争议盖棺定论[23-24].分析结果显示，古DNA与现代鼠疫杆菌在核心基因组上仅存在几百个单碱基差异，证明2次流行确实是鼠疫杆菌所致。造成2次流行的鼠疫杆菌分属于不同的进化分支，其中引起第1次大流行的分支已经在进化长河中消失;而引起第2次大流行的分支被保留下来，其后代在进化了几百年后又导致了第3次世界大流行[24].对全球代表性鼠疫杆菌分离株的全基因组测序和分析进一步加深了我们对鼠疫流行规律的认识。研究结果表明鼠疫可能起源于中国青藏高原东部，并通过丝绸之路、茶马古道和唐蕃古道等古商贸途径传播到世界其他地区，说明人类活动在鼠疫传播中起到重要作用[25-26].　　通过适当的数学方法对病原体基因组变异进行解析，可以推测产生变异的系统发育过程，以及进化传播过程中的各种重要参数，包括传播速度、基础复制率、采样比率、有效种群大小等。Stadler等[27]应用基于贝叶斯方法开发的存亡轮廓线模型(birth-deathskylineplot，BDSP)对HIV基因组序列进行分析，重现了由于成功应用鸡尾酒疗法，英国的B型HIV-1有效复制率和种群多样性在20世纪90年代开始呈现明显下降的趋势;并指出在90年代中期之后，由于高效抗反转录病毒疗法的产生，HIV的有效复制率开始低于1，提示流行趋势已得到控制。该方法还被应用于63株埃及分离的HCV的序列分析，结果清晰显示了20世纪初由于抗血吸虫注射疗法造成埃及HCV感染急剧增加，而在70年代之后，由于口服疗法逐渐取代了注射疗法，HCV感染率及有效种群也随之下降[27].BDSP方法从数学层面将基因组序列变异和疾病流行规律结合起来，在将来疾病流行趋势分析中将发挥重要作用。　　4、疫苗变异监测和使用效果评价　　利用全基因组序列分析，我们还可以对疫苗株的变异及使用效果进行监测和评价。EV76是鼠疫耶尔森菌减毒活疫苗，曾在世界范围内应用于鼠疫预防接种。通过对中国保藏的EV76-CN株进行全基因组测序，并与鼠疫杆菌野生株进行比较分析，我们鉴定出疫苗株发生了12个突变(6个单核苷酸多态性和6个插入缺失)。选择更多来自不同研究所和国际保藏中心的EV76疫苗株，对这些突变位点进行了扫描，结果发现该疫苗在各个国家之间转移、运输和生产的过程中，至少已形成5个种系，并发现中国使用的EV76株存在3个独立的来源[28].　　基因组水平的遗传变异可能导致疫苗株表型变化，进而影响接种后的免疫效果，因此我们的发现将有助于阐明各批次疫苗的免疫效力不同的问题，为疫苗的质量监测提出了新的思路。美国从2000年开始，大范围应用肺炎球菌脂多糖-蛋白质联合七价疫苗(PCV7)。与此同时，能逃避疫苗的肺炎链球菌菌株在种群中的频率开始上升。　　2012年，Golubchik等[29]通过对62株19A血清型肺炎链球菌的测序分析表明，同源重组造成关键遗传片段在菌株间的水平转移，是导致疫苗逃避的最重要原因。研究还发现，在重组造成荚膜转换，从而逃避疫苗作用的同时，大量其他未知功能的基因组片段也通过搭车效应转移到受体菌中。因此，疫苗的大规模应用会对细菌种群的进化产生一些难以预料的后果。　　2013年，Croucher等[30]进一步研究了肺炎链球菌种群在疫苗作用下的进化机制，通过616株无症状携带者分离的肺炎链球菌基因组序列比对，研究者在荚膜生物合成基因簇、抗原蛋白编码基因PspA和PspC等基因元件中观察到了显着的重组事件。结合近十年的流行病学资料进行综合分析发现：重组对整个种群的血清型转换和耐药谱产生了影响，受到免疫的7个血清型几乎完全消失，取而代之的是非疫苗免疫的型别。但接种疫苗前后物种的基因库基本没有发生变化，因此尽管儿童患病率显着下降，肺炎链球菌的无症状携带者比例与疫苗使用前相比无显着差别。以上研究让我们了解到大规模疫苗接种行为对病原体种群组成的影响，这为将来疫苗的针对性设计提供了依据。　　5、问题与展望　　尽管已经在预防医学领域取得了显着进展，但全基因组测序技术要真正进入基层疾病监测机构和医院，仍然有很长一段路要走。首先要解决的是成本问题。目前上市的测序仪主要为人类基因组研究设计，而普通细菌基因组大小仅为人类基因组大小的千分之一。进行微生物基因组测序时，为了降低成本，往往须要把几十甚至上百株样品的DNA加上标签后混合测序。这对于群体遗传学研究是非常合适的，但限制了其在临床上的应用。第二个要解决的问题是测序前样本的快速处理。如果按照传统测序方法，先对菌株进行复苏培养，再大量提取DNA进行测序，其整个周期将仍然很长，难以体现快速全基因组序列分析的优势。尽管已有一些实验室解决方案被提出，如上文中提到的利用MGIT方法对结核分枝杆菌快速培养测序[21]，以及在非培养条件下，对样本DNA进行富集后测序，或者直接进行宏基因组或者单细胞测序等[32-33]，但这些方法的大规模临床应用还存在技术和成本屏障。第三个问题是海量数据的储存管理及自动化分析。高通量实验技术使得数据产生相对容易，而对数据的解析和管理成为科研的瓶颈。尤其对于疾病防控工作者和医生来讲，在日常工作中去对大量数据进行深入分析是不现实的，必须开发数据库和自动化分析平台，实现从序列到结果解读的一键化操作。　　可以设想未来传染病防控工作的一个场景：工作人员采集到患者体液样本，在实验室经过简单处理和平板培养，长出单菌落后，将其分成两部分，一部分用于提取DNA测序，另一部分继续培养，进行表型试验。几个小时内获得测序结果后，可直接导入普通笔记本电脑预装的软件(或网络分析平台)，软件在几分钟内自动给出标准格式的病原特性和溯源分析报告。测序分析结果与表型试验相互印证，为患者临床治疗和疾病流行控制提供迅速有效的指导。这个场景令人鼓舞与期待。　　【参考文献】　　[1]DidelotX，BowdenR，WilsonDJ，etal.Transformingclinicalmi-crobiologywithbacterialgenomesequencing[J].NatRevGenet，)：601-612.　　[2]DiepBA.Useofwhole-genomesequencingforoutbreakinvestiga-tions[J].LancetInfectDis，)：99-101.　　[3]RobinsonER，WalkerTM，PallenMJ.Genomicsandoutbreakin-vestigation:fromsequencetoconsequence[J].GenomeMed，)：36.　　[4]KaoRR，HaydonDT，LycettSJ，etal.Supersizeme:howwhole-genomesequencingandbigdataaretransformingepidemiology[J].TrendsMicrobiol，)：282-291.　　[5]ShapiroBJ，DavidLA，FriedmanJ，etal.LookingforDarwin'sfoot-printsinthemicrobialworld[J].TrendsMicrobiol，)：196-204.　　[6]LomanNJ，MisraRV，DallmanTJ，etal.Performancecomparisonofbenchtophigh-throughputsequencingplatforms[J].NatBiotech-nol，)：434-439.
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【基金标书】-重要病原体变异规律与致病机制研究
项目名称重要病原体变异规律与致病机制研究首席科学家金奇中国医学科学院病原生物学研究所起止年限托部门卫生部二、预期目标总体目标以病原体变异与流行规律及致病机制这两个关键科学问题为核心，充分利用我国流行菌株和临床样本资源，发挥学科间交流与合作的优势，采用现代前沿组学、生物信息学、感染性克隆等先进技术，从病原学、流行病学、细胞生物学、分子生物学、免疫学、疫苗学等角度，深入揭示志贺氏菌、肠道病毒、脑膜炎奈瑟菌三种病原体引起的疾病的本质，了解其变异、流行规律、致病机理和机体免疫保护机制，并研制出有可能应用于临床防治的新型疫苗和诊断新技术，为临床救治方案的制订、疫苗的研发、药物靶标的筛选及防控策略的完善等提供理论基础。通过课题的实施，培养一批优秀人才，全面提升我国相关传染病诊防治的整体水平。五年预期目标1、深入揭示志贺氏菌变异规律和致病机制。包括系统分析志贺氏菌的进化起源和变异机制部分阐明福氏志贺菌血清型转换通路和规律及其对福氏志贺氏菌流行强度的影响了解福氏志贺氏菌优势血清型菌株的耐药、致病力和环境适应能力特点揭示毒力大质粒对宿主菌染色体基因表达影响的种类与方式了解志贺氏菌毒力相关蛋白下调宿主免疫应答的现象和在宿主细胞中的作用靶点及新的作用方式。2、揭示我国变异规律、趋势及其与毒力关系。包括阐明过去10年我国大陆流行的毒的型别特点和进化特征阐明若干与病毒毒力有关的变异位点，鉴别出一组与病毒复制和翻译有关的宿主因子，并部分阐明其作用机制解析若干异体病毒颗粒和3C、3D等重要功能蛋白及其突变体的结构建立我国株库，建立感染性克隆、亚基因组复制子等关键性研究技术平台3、部分阐明病毒的致病与免疫机制。包括揭示入中枢神经系统的分子机制部分阐明抗天然免疫、诱导适应性免疫的机制及其与疾病进展、预后的关系，提出活疫苗的免疫保护机制和有效性评价指标建立完善用于染研究的体外血脑屏障模型、新型小鼠感染模型和恒河猴模型等。4、初步揭示脑膜炎奈瑟菌变异规律和致病机制。包括掌握我国主要脑膜炎奈瑟菌流行菌株血清群变异的规律了解我国脑膜炎奈瑟菌菌株在健康人鼻咽部的粘附和定植对菌株的扩散以及流脑流行的公共卫生学意义初步阐明了解细菌的粘附和侵袭毒力基因和蛋白的相互关系。5、培养中青年研究骨干30人以上，研究生50。6、在录杂志上发表论文80。三、研究方案（一）总体学术思路本项目围绕病原体变异规律与致病机制这两个传染病基础研究中的核心科学问题，根据我国传染病防控的需求，以志贺氏痢疾杆菌、肠道病毒和脑膜炎奈瑟菌等为研究对象，利用前沿组学、结构生物学等各种前沿生命组学技术，结合生物信息学、感染性克隆、基因工程动物等先进技术，从病原学、流行病学、细胞生物学、分子生物学、免疫学、疫苗学等角度，在病原体基因及其编码产物、宿主分子、细胞、动物和机体等不同层次上，深入揭示志贺氏菌、膜炎奈瑟菌等变异规律及其与致病机制关系，同时根据病原体的不同各有侧重志贺氏菌以优势血清型和编码噬菌体为重点，研究优势血清型菌株的致病性、流行性、耐药性等生物学特性，提出解释我国福氏志贺氏菌流行病学特点的假说，为发展志贺氏菌疫苗和控制志贺氏菌感染提供新的思路和策略。手足口病围绕肠道病毒遗传变异和致病机制两大科学问题，开展肠道病毒遗传变异规律及其与毒力关系、病毒致病与免疫保护机制的研究，为病毒监测、临床救治、疫苗研发和药靶筛选等提供基础科技支撑，填补研究空白。脑膜炎耐瑟菌重点阐明我国流脑菌株在健康人鼻咽部的粘附和定植对菌株的扩散以及流脑流行的公共卫生学意义同时，开展荚膜合成基因簇的表达、基因缺失、基因水平转移以及基因重组的调控机制研究，以期了解我国流脑菌株血清群变异的机制和规律，甄别流脑流行株和非流行株，为我国流脑预防控制提供基础性参考数据。（二）技术路线1、志贺氏菌变异规律和致病机制研究本课题将收集和分离志贺氏菌流行株，分析其血清型、耐药性、生化特性、毒力等，选择具有代表性菌株，通过全基因序列分析以及比较基因组学研究，发现不同血清型、耐药性、毒力及生化特性等菌株的基因组差异，重点研究各种志贺氏菌菌株之间致病性质粒、毒力岛、血清型转换噬菌体等可水平转移遗传成分以及与生存环境相关的代谢基因间的差异，并进一步通过噬菌体分离、基因敲除、基因导入、动物毒力评价等分析上述差异与致病力的关系，同时开展志贺氏菌致病性质粒与染色体的协同进化研究、重要毒力蛋白和复合物与宿主相互作用，系统解析志贺氏菌的变异规律与致病性的关系。2、病毒变异趋势与毒力关系的研究（1）我国不同地区病毒流行变异规律研究收集1998我国不同地区的离株，利用基因组步移发表毒株序列为参考序列，应用比较基因组学等方法进行病毒遗传进化树，探明我国毒的型别特点、分子特征和衍化来源。阐明中国大陆流行的毒的基因变异规律及病毒基因型别进化，阐明不同毒株在不同基因之间的进化关系和病毒衍化来源。（2）病毒变异与病毒毒力关系研究通过对不同地区、不同毒力的离株进行序列比对，利用定点突变技术，在因组中引入突变位点，转录出转染敏感宿主细胞，观察重组病毒的产生效率和噬斑形成能力等，确定异与毒力的关系，并在动物模型上进一步验证。在此基础上，利用大肠杆菌或昆虫细胞表达、纯化重组变体蛋白或病毒样颗粒，优化条件，最终获得质量符合X射线衍射实验的单晶体，结合实验室小型X射线衍射仪，大型同步辐射实验室获得C衍射数据，进行数据分析和三维模型建立，完成结构解析。以白和非编码区钓饵，利用亲和层析、蛋白质组学等技术，分析鉴别与因组非编码区及赖的合酶结合的宿主因子，并研究其相互作用机制及其对病毒复制的影响。具体思路如图2所示。3、病毒致病与免疫保护机制研究（1）致病机制研究建立血脑屏障模型，利用蛋白质组学、免疫学、病理学、动物学等技术体系，进行血脑屏障侵入路线同神经轴突侵入路线的功能性比较研究、筛选和鉴定参与不同示神经毒性分子机制研究，从而阐明神经嗜性机制。利用免疫沉淀、报告基因转染、蛋白质组学、转录组组学、酵母双杂交筛选、技术阐明宿主天然免疫系统对识别机制，病毒对干扰素等天然免疫系统的拮抗机制利用转基因技术、基因敲除技术等建立小鼠敏感感染模型，利用该模型观察天然免疫与病性的关系及干扰素的治疗作用。（2）手足病免疫保护机制研究利用流式细胞分析和液态芯片检测、微量中和实验等技术，动态研究临床患者不同病程免疫应答特征，了解重要免疫细胞、免疫因子与病情发生、发展和转归的功能关联性利用超速离心、流式细胞分析、电镜检测、芯片分析以及高通量荧光定量方法探索病毒感染机体后不同免疫细胞间快速致病信息交流的机制利用小鼠模型观察细胞与病性及疾病进展的关系制备活疫苗，免疫恒河猴，观察猴体病理反应以及细胞与体液免疫反应用行攻击，观察病理反应和保护作用及病毒排泌情况等，力争进入临床试验，观察疫苗安全性和有效性，提出评价疫苗安全性和有效性的指标。4、脑膜炎奈瑟菌变异与流行规律及致病机制研究针对流行性脑膜炎，本项目拟通过体外粘附侵袭实验、基因组序列测定、逆转录光定量序手段分析具有不同流行特征的流脑菌株在致病性上的差异及其可能的产生机制。（三）创新性本项目以志贺氏菌、肠道病毒和脑膜炎奈瑟菌等为研究对象，开展系统研究，具有很强的创新性1、从血清型转换噬菌体入手，研究噬菌体感染的特异性和时序性，揭示噬菌体与福氏志贺菌血清变迁的关系，对于预测、预警流行血清型及血清型变化趋势，阐明细菌性痢疾的流行规律具有重要意义。2、目前手足口病的基础研究在国内外均非常薄弱，空白很多，本研究均为原始创新研究。其中拟开展的我国大陆流行的肠道病毒的变异规律和毒力关系研究以及致病机制和免疫保护机制的研究，如异与毒力关系、毒颗粒与重要蛋白的结构生物学、入中枢神经系统及其致损伤机制、天然免疫拮抗机制、获得性免疫与疾病进程关系、活疫苗保护机制等重要研究方向均未见系统研究。建立新型小鼠感染模型和恒河猴模型将对阐明活疫苗的免疫保护机制和有效性评估提供重要理论依据。3、充分利用我国脑膜炎奈瑟菌资源，研究不同来源菌株流行变异规律及粘附侵袭相关基因蛋白调控机制。从分子水平上解释细菌的粘附侵袭相关因子和健康人群的正常携带对流脑流行传播的规律的影响，了解我国不同流行特征的脑膜炎奈瑟菌在致病能力上的差异。系统研究和了解我国不同血清群菌株血清群变异的遗传学基础和调控机制。（四）研究特色1、在志贺氏菌研究方面发达国家对志贺氏菌的研究，重点已经转移到痢疾志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌。我国志贺氏菌研究团队，多年来一直开展福氏志贺氏菌的研究，在基因组解析、进化理论、O抗原多样性形成机制解析、新的血清型发现、蛋白质组分析等方面，达到国际水平。本课题是继续以福氏志贺氏菌为主要研究对象开辟新的领域，具有中国特色（1）从旁基因组和核心基因组两方面着手，全面分析志贺氏菌分化中发生的遗传事件，特别是研究突变和重组对志贺氏菌进化的影响。（2）将建立第一个福氏志贺氏菌血清型转换噬菌体库，进而与福氏志贺氏菌的优势血清型的流行结合研究，探讨血清型转换通路，了解新的血清型产生机制。2、在病毒研究方面本项目围绕我国手足口病防控中急需解决的瓶颈难题，结合国际前沿进展，以病原体变异和致病机制为主线，开展毒遗传变异规律及其与毒力关系以及病毒复制、致病与免疫保护机制的研究。研究内容系统全面，包括传变异特征、变异与毒力关系、复制机制、神经嗜性机制、免疫调制机制、疫苗保护机制和动物模型等，涵盖了病毒学、免疫学、细胞生物学、结构生物学、生物信息学、病理学等诸多领域，是迄今为止最为全面的研究，填补多方面空白。课题综合运用了蛋白质组学、转录组学等前沿组学，感染性克隆技术，免疫学，基因工程动物模型技术，生物信息学技术，结构生物学技术等先进技术，体现了传染病和病毒学研究的国际前沿水平。另外，针对不同地区行特征不同，本研究是基于对我国内地行变异规律分析基础上，利用我国毒株进行的，具有我国特色。3、在脑膜炎奈瑟菌研究方面全球范围内，流脑的流行具有地区性或区域性，不同地区各有特点，流脑疫苗的应用影响到流脑流行和传播的规律。国际上的研究各有侧重。本研究集中国内流脑研究的优势单位，利用现有的近50年来的不同时期的流脑菌株，对这些菌株进行致病性和变异性研究，有助于我们更好地了解和掌握中国流脑流行规律的变迁和菌株的变异流行规律和菌株的毒力特征，为我国流脑的防控和流行预测提供基础性数据。（五）可行性分析1、理论上可行本研究所涉及的痢疾变异规律、传变异特征、变异与毒力关系、致病和免疫保护机制和动物模型的研究、脑膜炎奈瑟菌等变异规律和致病机制等研究均基于国际相关领域的最新进展，在其他病原体有成功经验可循，部分研究已经取得初步成果。2、具有资源优势研究团队中的中国疾病预防控制中心传染病预防控制所新病原室，长期从事细菌性痢疾等细菌性腹泻病的研究，是国家细菌性痢疾监测网络菌株收集、鉴定和保藏单位，已经收集和保存不同年代、不同地区、不同血清型痢疾杆菌4000余株，其中福氏志贺菌2000余株，涵盖目前已知的15个血清型。中国医学科学院病原生物研究所、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所等单位分离、收集了株600余株，研究单位和北京地坛医院以及多个省级疾控中心建立了良好合作关系，可获得研究所需临床样本，另外研究所需的细胞株、克隆、细胞系、抗体等均已收集齐备中国疾病预防控制中心传染病预防控制所呼吸道病原保存有近50年来的不同时期的流脑菌株和样本，保存有我国自1956年以来脑膜炎奈瑟菌菌株3000多株，这些菌株能够代表建国以来我国流脑流行期间以及流行间期脑膜炎奈瑟菌菌株的整体状况。另外，通过购买或者国际交流与合作，还获得了世界其它流脑流行国家、地区的脑膜炎奈瑟菌代表株。3、具有成熟的技术平台研究团队的中国医学科学院和南开大学团队已投资建成了具备国际通行标准的基因组学、功能基因组学、蛋白质组学和生物信息学研发平台，为计划的实施奠定了物质基础。军事医学科学院生物工程研究所团队（病原微生物生物安全国家重点实验室），建立了微生物蛋白质组学研究平台，并且熟练掌握了进行毒力评价研究的多种方法和模型。中国医学科学院实验动物研究所建立了基因工程动物模型技术平台、医学生物学研究所建立了灵长类动物平台，均可为本项目的开展提供支撑。本研究所需各类实验技术均已被研究团队熟练掌握，并具备研究所需的生物安全二级实验室等保障条件，开展本研究不存严重技术障碍。4、具有高素质的研究团队本项目集成了来自重大疾病研究国家实验室（筹）以及病毒基因工程、病毒学、传染病预防控制、医学分子生物学、病原微生物生物安全等五个国家重点实验室等的高水平科研力量，拥有国内痢疾、手足口病和流脑等研究最强的研究队伍，部分骨干参与了本项目前两期的研究，具有良好的工作基础，为本项目的完成提供了重要保障。（六）课题设置课题设置思路本项目继续围绕病原体变异规律与致病机制这两个传染病基础研究中的核心科学问题，根据我国传染病防控需求，选择四种重要病原体分别研究其变异规律及其与致病机制的关系，包括现阶段居于我国传染病发病率前列的痢疾、手足口病以及流行型别和模式发生转变、对社会造成严重冲击的流脑等重要传染病的病原体，其中以手足口病和痢疾为研究重点。围绕项目的科学问题、主要研究内容和目标，拟设置志贺氏菌变异规律和致病机制研究、病毒变异与毒力关系的研究、病毒致病与免疫机制研究和脑膜炎奈瑟菌变异规律和致病机制研究四个课题。为突出重点，其中考虑到我国当前手足口病研究基础薄弱，国内以前对相关研究资助较少，而近年疫情上升迅猛，国内外普遍关注，特设置两个课题，以加强相关研究痢疾研究基础较好，单独设置一个课题流脑单独设置一个课题。课题间的联系及其与项目目标的关系本项目的4个课题分别针对志贺氏菌、病毒和脑膜炎奈瑟菌开展研究，都是围绕病原体变异规律和致病机制关系展开，涵盖细菌、病毒等不同微生物，相关研究将从不同侧面显示病原体的变异特征、导致疾病本质和相关机制，有助于发现、揭示共性问题和规律，从而从整体上提高我们对于传染病的认识，因此这4个课题是围绕项目目标的有机统一的整体。其中课题2和3从病毒变异和致病机制两个方面对行研究，但又各有侧重，这两个课题的研究成果结合起来将对手足口病的临床诊治、预防控制、疫苗和药物研发等提供基础。课题1志贺氏菌变异规律和致病机制研究主要研究内容（1）志贺氏菌O抗原的变异规律的研究通过对不同福氏志贺氏菌血清型亚型的全基因组分析，找到负责特定血清型亚型形成的关键基因。解析不同福氏志贺氏菌血清型的分化机制，了解不同血清型之间转化的变异机制，建立针对全部福氏志贺氏菌血清型的分子分型方法，为针对福氏志贺氏菌的传染病防控和疫苗开发奠定理论基础。针对志贺氏菌多起源和变异程度高的特点，通过志贺氏菌及其潜在的前体侵袭性大肠杆菌（间的比较基因组学分析，建立志贺氏菌和旁基因组（据库和核心基因组（据库，对志贺氏菌的进化起源机制进行系统分析，了解其进化和变异的规律和趋势。（2）福氏志贺氏菌优势血清型转换噬菌体和流行强度的研究通过诱导、获取目前已知和未知的各种福氏志贺菌血清型转换噬菌体，对目前全基因组序列未知的噬菌体进行序列测定和生物学特征研究研究不同血清型转换噬菌体单独或组合感染及转化福氏志贺菌的可能性和特异性，掌握多种噬菌体组合感染的时序性，了解福氏志贺菌血清型间转换通路和规律研究各种噬菌体单独或组合感染时在宿主菌基因组上的整合位点和排列方式，为揭示福氏志贺菌血清型间转换及遗传进化的分子机制提供线索揭示血清转换噬菌体与福氏志贺菌血清变迁的关系，阐明福氏志贺菌血清型变迁机制。（3）志贺氏菌毒力大质粒和染色体的协同进化及调控毒力大质粒的获得是志贺氏菌从非致病性大肠杆菌变为致病菌的第一步也是最重要的一步，随后志贺氏菌的染色体与大质粒就开始了漫长的协同进化历程，以达到其适应肠道新环境的最佳状态。本研究拟通过比较不同血清型志贺氏菌去除毒力大质粒前后、非致病性大肠杆菌导入毒力大质粒前后的蛋白表达谱和复合物谱的变化，从全局角度对志贺氏菌毒力大质粒与染色体之间的关系进行较为系统的研究，以期发现一些新的抗毒力基因和解析志贺氏菌毒力大质粒对染色体表达调控的全新机制，极大地丰富细菌质粒与染色体协同进化理论的内容，也为致病菌的致病性研究提供了借鉴。（4）福氏志贺氏菌重要蛋白复合物、毒力蛋白和耐药性研究基于志贺氏菌感染机体后通过Ⅲ型分泌系统释放的毒力蛋白调控各种炎症反应信号通路，能够下调宿主的免疫应答，但其调控过程中的具体机制尚不明确。本研究主要以此类毒力蛋白和重要蛋白复合物参与介导的志贺氏菌致病机制展开研究。针对Ⅲ型分泌系统释放的毒力蛋白在志贺氏菌感染中能下调宿主免疫应答的现象，寻找其在宿主细胞中的作用靶点，研究毒力相关蛋白和其它重要功能蛋白参与调控宿主相关免疫信号途径的新作用方式，以帮助我们理解志贺氏菌的致病机制，为进一步研发抗痢疾小分子药物提供理论基础和线索。在耐药分子机制研究方面，通过基因芯片技术平台，从志贺氏菌全基因组和转录组水平高通量、全方位筛选耐药相关基因和系统研究志贺氏菌耐药的分子机制及调控机理通过分子生物学、生物信息学和功能基因组学方法研究耐药相关基因的功能和遗传特征，分析和评价耐药相关基因在志贺氏菌耐药性产生过程中所发挥的作用。主要研究内容包括志贺氏菌耐药株的诱导、分离和鉴定志贺氏菌全基因组芯片制备耐药株与敏感株基因组结构差异分析耐药株与敏感株转录组差异分析潜在耐药相关基因功能和遗传特征分析。全面研究和评价志贺氏菌耐药和多重耐药产生过程中获得耐药性的主要方式及分子机理，从而为临床耐药监测和开发针对耐药菌的新型抗菌药物提供潜在的分子靶位。同时，通过生物信息学分析与分子生物学实验相结合的手段，在前期小关工作的基础之上开展毒力大质粒上小功能研究。课题目标（1）建立志贺氏菌和侵袭性大肠杆菌（旁基因组（据库和核心基因组（据库，对进化起源和变异机制进行系统分析（2）建立福氏志贺氏菌血清型转换噬菌体库，了解福氏志贺氏菌血清型转换通路和规律，以及对福氏志贺氏菌流行强度的影响（3）了解福氏志贺氏菌优势血清型菌株的耐药、致病力和环境适应能力特点（4）了解毒力大质粒对宿主菌染色体基因表达影响的种类和方式（5）了解志贺氏菌毒力相关蛋白下调宿主免疫应答的现象，和在宿主细胞中的作用靶点和新作用方式（6）培养中青年研究骨干5，博士后、研究生10（7）发表文25篇以上。承担单位中国疾病预防控制中心传染病所传染病预防控制国家重点实验室中国医学科学院病原生物学研究所病毒基因工程国家重点实验室军事医学科学院生物工程研究所病原微生物生物安全国家重点实验室南开大学分子微生物学与技术教育部重点实验室课题负责人徐建国，研究员，传染病预防控制国家重点实验室主要学术骨干杨剑，副研究员，病毒基因工程国家重点实验室孙强正，副研究员，传染病预防控制国家重点实验室卫灿东，副研究员，病毒基因工程国家重点实验室朱力，副研究员，病原微生物生物安全国家重点实验室刘斌，副教授，教育部分子微生物学与技术重点实验室经费比例课题2病毒变异与毒力关系的研究主要研究内容（1）我国不同地区行变异规律研究对1998分离的近500个中国流行株开展系统的分子流行病学研究，阐明中国大陆流行的及病毒重要中和抗原位点的变异情况，通过生物信息学分析寻找潜在的毒力相关变异，为疫苗和诊断试剂研究等提供依据。（2）异与病毒毒力关系研究对不同地区过构建一系列的突变重组病毒，鉴定影响经毒力的关键位点。在上述研究的基础上，选择1具有代表性的突变体进行结构生物学研究，了解突变对病毒颗粒表面结构的影响，探讨病毒变异导致抗原性改变的机制挑选2代表性的重要功能蛋白，如3C，3D蛋白突变体进行结构生物学研究，为揭示病毒变异导致功能和毒力变异机制提供基础利用基因组复制子探索在神经细胞中复制的机理，揭示病毒基因组非编码区及赖的合酶、宿主蛋白的相互作用对制的影响，鉴别出与病毒复制密切相关的宿主因子。课题目标（1）阐明1998我国大陆流行的毒的型别特点和进化特征（2）阐明若干与病毒毒力有关的变异位点，获得无神经毒力重组病毒（3）解析若干异体病毒颗粒和3C、3D等重要功能蛋白及其突变体的结构（4）鉴别出一组与病毒复制和翻译有关的宿主因子，并部分阐明其作用机制（5）建立我国株库，建立感染性克隆、亚基因组复制子等关键性研究技术平台（6）培养中青年科研骨干5，博士后、研究生15（7）在录杂志上发表论文25篇以上。承担单位中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室中国医学科学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室解放军第302医院中国医学科学院病原生物学研究所病毒基因工程国家重点实验室课题负责人许文波，研究员，病毒基因工程国家重点实验室主要学术骨干彭小忠，研究员，医学分子生物学国家重点实验室貌盼勇，研究员，解放军第302医院崔胜，研究员，病毒基因工程国家重点实验室周世力，教授，江汉大学经费比例课题3病毒致病与免疫机制研究主要研究内容（1）病毒致病机制研究建立成年小鼠、恒河猴、转基因小鼠等染动物模型建立毒经由血脑屏障入侵中枢神经系统的感染模型和体外血脑屏障模型，利用基因芯片、蛋白质组学等技术检测比较单纯经由血脑屏障入侵中枢神经系统同正常小鼠的脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞表达谱差异，比较不同的基因型和流行株的感染及神经毒力差异，筛选能阻断病毒复制的关键节点蛋白建立血脑屏障结构细胞（脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞）和神经轴突细胞、脊髓细胞、骨骼肌细胞的库及差异文库，利用筛选与白质相互作用的细胞因子或靶分子利用转基因或基因敲除技术对新发现的侵中枢神经系统相关作用因子进行动物水平的系统研究，有针对性的比较不同的基因型和流行株的感染及神经毒力差异阐明受体对毒的识别机制及病毒编码产物对干扰素激活抑制机制，探讨天然免疫抑制与病毒致病机制的关系。（2）手足口病免疫保护机制的研究在纵向（不同病程）和横向（不同病情程度、不同毒株感染）水平揭示病毒感染机体后免疫应答的动态，阐明重要免疫细胞与病情发生、发展和转归的功能关联性探讨不同剂量染中胞亚型分化情况及其与疾病进展的关系利用超速离心、电镜、生物芯片以及实时细胞分析等技术探索病毒感染机体后免疫细胞间快速的信息交流和免疫抗原的传递等机制利用动物模型揭示活疫苗的免疫保护机制，力争开展I、临床试验。课题目标（1）揭示入中枢神经系统的分子机制（2）揭示抗干扰素激活机制及其与病性的关系（3）揭示交叉反应的细胞对疫应答和感染小鼠疾病进程的影响，染导致特异的胞亚型分化情况及其与疾病进展的关系（4）阐明活疫苗的免疫保护机制和有效性评价指标（5）和建立完善用于染研究的体外血脑屏障模型、新型小鼠感染模型和恒河猴模型等保障条件（6）培养中青年科研骨干10，博士后、研究生20（7）在录杂志上发表论文30篇以上。承担单位中国医学科学院病原生物学研究所病毒基因工程国家重点实验室中国医学科学院医学生物学研究所武汉大学病毒学国家重点实验室中国科学院上海巴斯德研究所中国医学科学院实验动物研究所卫生部比较医学重点实验室课题负责人王健伟，研究员，病毒基因工程国家重点实验室主要学术骨干李琦涵，研究员，中国医学科学院医学生物学研究所秦川，研究员，卫生部比较医学重点实验室冷启彬，研究员，中国科学院上海巴斯德研究所刘海鹰，副研究员，病毒基因工程国家重点实验室刘映乐，副教授，病毒学国家重点实验室雷晓波，助理研究员，病毒基因工程国家重点实验室经费比例课题4脑膜炎奈瑟菌变异规律和致病机制研究主要研究内容（1）脑膜炎奈瑟菌变异与流行规律研究研究我国主要流脑流行菌株血清群变异的规律，研究不同血清群菌株之间荚膜合成基因簇的表达、基因缺失、基因水平转移以及基因重组的调控机制。研究我国主要流脑流行菌株的粘附定植能力和相关毒力基因、蛋白的表达调控机制，以期了解我国流脑菌株在健康人鼻咽部的粘附和定植对菌株的扩散以及流脑流行的公共卫生学意义研究我国流脑菌侵袭力及相关基因蛋白特征，以期了解细菌的粘附和侵袭毒力基因与白的相互关系研究我国流脑菌株的变异规律。（3）脑膜炎奈瑟菌变异与致病机制关系研究选择不同血清群、不同年代、不同基因型别的流脑菌代表菌株，进行体外粘附试验，比较不同流脑菌的粘附定植能力分析我国流脑菌代表菌株流行变异规律和细菌在健康人群中定植传播能力的关联性选择与流脑菌粘附相关的因子编码基因作为目的靶基因，进行序列测定分析，同时采用逆转录光定量序等技术手段进行粘附因子相关的关键基因转录水平检测，研究粘附因子在不同流脑菌中的基因序列、转录水平、调控水平上的差异进行细菌究不同流脑菌在侵袭力的差异性通过序列测定检测荚膜相关基因序列上的差异，利用逆转录光定量序等技术手段检测荚膜相关基因的转录水平，并进一步探索荚膜基因序列和转录水平的差异与其侵袭能力的可能关系以小切入点，选择部分脑膜炎奈瑟菌毒力相关基因（包括粘附定植、侵袭和抗吞噬等相关基因），采用生物信息学预测、序、阵列、逆转录交等技术开展调控机制探索性研究。收集和选择一定数量的中国流脑菌临床菌株，利用新一代测序技术进行高通量序列分析，利用生物信息学技术手段寻找变异，并分析其规律。课题目标（1）掌握我国主要流脑流行菌株血清群变异的规律（2）了解我国流脑菌株在健康人鼻咽部的粘附和定植对菌株的扩散以及流脑流行的公共卫生学意义（3）了解细菌的粘附和侵袭毒力基因与蛋白的相互关系（4）培养中青年研究骨干8，博士后、研究生15（5）在录杂志上发表论文20篇以上。承担单位中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室中国医学科学院皮肤病研究所中国医学科学院病原生物学研究所病毒基因工程国家重点实验室课题负责人金奇，研究员，病毒基因工程国家重点实验室主要学术骨干邵祝军，研究员，传染病预防控制国家重点实验室王千秋，研究员，中国医学科学院皮肤病研究所张笑冰，副研究员，病毒基因工程国家重点实验室彭俊平，副研究员，病毒基因工程国家重点实验室经费比例四、年度计划研究内容预期目标第一年1、诱导、分离和鉴定志贺菌血清型转换噬菌体对志贺菌小行预测和统计，并2、对预测的小行初步验证分析福氏志贺氏菌1找并验证负责O抗原侧链修饰的噬菌体和关键基因;驱除不同亚群和不同血清型志贺氏菌菌株中的毒力大质粒，获得含有志贺氏菌毒力大质粒的大肠杆菌，进行志贺氏菌毒力大质粒驱除前后的蛋白表达谱差异分析3、比较不同株的细胞和动物感染特性，构建中国要流行株的感染性克隆，找出具有代表性突变序列，对染主要器官特别是神经系统来源的细胞系进行胞受体的表达谱分析，构建基因组复制子4、构建成年小鼠和恒河猴等立毒经由血脑屏障入侵中枢神经系统的感染模型和体外血脑屏障模型，描述经由血脑屏障入侵中枢神经系统的表达谱变化，比较不同的基因型和流行株1、诱导、分离到至少3种血清型转换噬菌体，建立福氏志贺菌血清型转换噬菌体库初步获得志贺菌的小，完成福氏志贺氏菌1b和2b的全基因组序列，证明O抗原侧链修饰基因功能初步完成志贺氏菌毒力大质粒驱除前后的蛋白表达谱差异分析2、完成对不同地区离株的序列分析测定，阐明其在细胞和动物上的感染特性，确立代表性突变序列,构建我国要流行株（亚型）感染性克隆，获得胞受体在多组织来源的细胞系中的表达谱。3、初步建立用于染研究的体外血脑屏障模型、新型小鼠感染模型和恒河猴模型等，初步揭示不同类型病人细胞因子等表达谱、免疫调制特征和机制4、完成500株流脑菌株提取和型分析,建立2细菌宿主细胞粘附相互作用细胞模型,建立荚膜基因簇相关基因检测和差异性分析技术,完成代表研究内容预期目标的感染及神经毒力差异，筛选能阻断病毒复制的关键节点蛋白5、对我国不同年代、不同血清群流脑菌株进行子分型和种群结构分析，筛选有代表性的菌株，建立细菌行小选6、获得研究所需菌毒种及样本资源，进行分析并建立信息数据库。株序5、初步完成有关菌毒株的收集工作6、发表文8。第二年1、对获得的血清型相关噬菌体进行基因组序列测定和鉴定，比较其与非优势血清型相关噬菌体的特征差异，寻找噬菌体基因组上优势决定基因或区域对筛选出小一步进行鉴定分析，对多个毒力大质粒编码的小行功能探讨筛选对志贺菌生长有明显抑制作用的药物设计构建志贺菌全基因组芯片测定福氏志贺氏菌3a、4b的全基因组序列，寻找并验证负责O抗原侧链修饰的噬菌体和关键基因;解析不同福氏志贺氏菌血清型的分化机制和不同血清型之间转化的变异机制建立针对全部福氏志贺氏菌血清亚型的分1、初步确定噬菌体基因组上优势决定基因或区域，初步了解志贺菌小生物学功能以及相应的调控机制完成福氏志贺氏菌3a和4明O抗原侧链修饰基因功能建立福氏志贺氏菌血清亚型的分子分型方法，初步解析不同福氏志贺氏菌血清型的分化机制和不同血清型之间转化的变异机制揭示志贺氏菌毒力大质粒驱除前后以及大肠杆菌获得毒力大质粒前后在不同培养条件下的蛋白表达谱差异;2、阐明毒的码基因序列变异特征，以及重组毒研究内容预期目标子分型方法分析志贺氏菌毒力大质粒驱除前后的蛋白表达谱差异以及大肠杆菌获得毒力大质粒前后在不同培养条件下的蛋白表达谱差异，筛选差异表达蛋白蛋2、进行变异分析，分析不同重组突变病毒在细胞水平上的感染特性，开展不同变株3C、3C与宿主结合因子以及3C和抑制剂复合物的结构生物学研究，探讨结构蛋白）与细胞受体相互作用的机制3、建立完善染动物模型，筛选与白质相互作用的细胞性因子或靶分子，分析不同类型病人的细胞因子等表达差异以及对天然免疫的拮抗作用4、完善细菌宿主粘附能力检测技术和荚膜基因簇相关基因序列差异性检测技术，对不同群代表性的菌株进行粘附定植能力差异性、荚膜基因簇差异性和粘附相关基因进行分析，建立粘附因子相关的关键基因转录水平检测技术，继续进行小析。在不同细胞上的感染特性，获得3C/抑制剂复合物晶体结构，初步揭示受体相互作用的分子机制;3、完善用于染研究的体外血脑屏障模型、新型小鼠感染模型和恒河猴模型等，初步揭示不同病人细胞因子等表达特征和干扰素拮抗机制4、阐明不同群流脑菌株对宿主细胞粘附力检测，完成荚膜基因簇差异性分析和相关粘附基因的分析，对候选小行鉴定5、发表文10。研究内容预期目标第三年1、分析血清型转换噬菌体感染及转换志贺菌血清型别的可能性、特异性及感染时序以及其整合位点与多噬菌体宿主菌基因组上排列方式，描绘福氏志贺菌血清型间转换通路和规律构建3抗菌药物作用下志贺氏菌构建转录谱数据库，完成志贺菌耐药株和敏感株基因组结构和转录组的差异分析，着重分析志贺菌获得耐药性的分子机理选择4株位于不同进化位置的志贺氏菌进行全基因组测序分析菌株的蛋白复合物表达差异以及菌株间转录谱的差异2、对来自不同年代，具有基因差异和地理分布特点的代表株进行全基因组序列测定分析不同重组突变动物体内感染特性及其对宿主免疫系统影响与病理损害特征进行不同突变3D蛋白结构生物学研究研究病毒非编码区与病毒蛋白和宿主蛋白的相互作用及其对制的影响3、对新发现的侵中枢神经系统相关作用因子进行动物水平的系统研究，有针对性的比较不同的基因型和流行株的感染及神经毒力差异揭示病毒感染机体后免疫应答的1、掌握噬菌体感染及转换宿主志贺菌血清型别的特异性和时序性，完整描绘福氏痢疾杆菌血清型别转换通路和规律，阐明噬菌体在宿主菌基因组上整合位点及排列方式初步了解志贺氏菌的潜在耐药机制，筛选出若干新的候选药物靶标完成4株志贺菌的全基因组测序分析，阐明毒力大质粒驱除前后志贺菌株蛋白复合物表达差异及转录谱差异2、在全基因组水平阐明表株的遗传变异特征阐明不同重组病毒的体内感染特性，包括宿主免疫和病理反应获得3D或3抑制剂复合物结构以及3分阐明神经细胞复制中的参与的病毒及宿主蛋白3、揭示入中枢神经系统的分子机制，进一步揭示疫调制和保护机制4、阐明100株、Y群、不可分群等流脑菌株宿主细胞粘附力差异，完成菌株粘附相关基因分析，构建突变体进行功能研究5、发表文15。研究内容预期目标动态，研究重要免疫细胞与病情发生、发展和转归的功能关联性及天然免疫的拮抗机制。4、分析、Y群、不可分群等其它血清群流脑菌株的粘附定植能力差异、荚膜基因簇差异和粘附定植相关基因，对代表性菌株进行粘附因子相关基因转录水平检测，选择2个小行功能分析。第四年1、分析噬菌体对志贺菌毒力基因表达的影响分析和验证志贺菌耐药机制和调控机理筛选志贺菌参与调控宿主免疫反应的重要功能蛋白或毒力蛋白及其相互作用的蛋白和区域选择4株与不同志贺氏菌进化簇关系较近的析不同志贺氏菌分化的主要动力和产生的结果，寻找在志贺氏菌形成过程中的关键基因上的变，分析志贺氏菌与株之间的进化关系和差异，系统解析志贺氏菌的进化起源机制综合分析并验证上述比较蛋白质组和比较转录组的结果，并分析相关基因的受调控水平验证差异表达复合物各组成亚基间的相互作用。2、探讨我国病毒基因变异和神经毒性的关系，阐明不同毒株在1、初步掌握不同噬菌体对志贺菌致病力和毒力的影响，了解福氏志贺菌优势血清型菌株的致病力特点初步掌握志贺菌重点耐药相关基因的调控功能获得志贺菌重要功能蛋白在宿主细胞中的靶蛋白并初步了解相应蛋白复合物的结构和功能初步了解志贺菌进化的动力、其形成过程中关键基因的变异、与株之间的进化关系以及进化起源机制确定毒力大质粒驱除前后志贺菌株差异蛋白相关基因的受调控水平以及差异表达复合物各组成亚基间的相互作用2、揭示我国大陆流行的毒的型别特点、进化特征及其与国外不同年代毒株的差别初步确定得12A、2B、2C、3A及突变蛋白结构生物学研究内容预期目标不同基因之间的进化关系和病毒衍化来源，并对毒的重组进行动态分析进行神经毒性相关蛋白的筛选进行不同突变A、2B、2C和3A蛋白结构生物学研究分析脊髓灰质炎来源翻译效率的影响鉴定参与病毒基因组翻译的病毒蛋白、宿主蛋白3、揭示受体对毒的识别机制及病毒编码产物对干扰素激活抑制机制，探讨天然免疫抑制与病毒致病机制的关系，探讨不同剂量染时胞亚型分化情况及其与疾病进展的关系4、对代表性的流脑菌株利用新一代测序技术进行高通量序列分析，粘附定植能力不同的代表性流脑菌株进行侵袭力的差异性以及荚膜基因簇遗传变异规律分析在以前研究基础上，再选择2小行功能分析。信息，解析1晶体结构鉴定出若干神经细胞中参与译的病毒、宿主蛋白3、深入揭示抗干扰素激活机制及其与病性的关系、交叉反应的细胞对疫应答和感染小鼠疾病进程的影响以及染导致特异的胞亚型分化情况及其与疾病进展的关系4、完成10代表性流脑菌株高通量测序分析、粘附能力差异性代表性菌株侵袭力的差异性及调控机制分析并构建突变体进行功能研究5、发表文20。研究内容预期目标第五年1、分析不同血清型福氏志贺菌抗酸性、耐药性等及环境适应性差异，探讨环境中噬菌体与血清型流行强度及血清型变迁的关系研究宿主相应上下游信号通路的传递情况，并借助动物模型进行进一步评价对志贺氏菌的基因组组成、多态性特征和变异机制进行深入分析，认识志贺氏菌进化和变异的规律和趋势捕获转录或翻译调控蛋白筛选调节染色体基因表达的毒力大质粒基因，构建突变体利用细胞和动物模型评价与毒力的关系，提出毒力大质粒对染色体的调控机制，发现染色体编码的新的抗毒力因子2、开展我国手足口病病原谱研究构建无神经毒或低神经毒的重组行毒颗粒或病毒样颗粒结构生物学研究探讨病毒非编码区及病毒蛋白、宿主蛋白的相互作用对病毒基因组翻译的影响3、探索病毒感染机体后免疫细胞间快速的信息交流和免疫抗原的传递等机制根据动物模型和临床试验数据，揭示活疫苗的免疫保护机制4、进行数据深入分析和课题总结。1、初步了解噬菌体对福氏志贺菌环境适应性的影响，了解福氏志贺氏菌优势血清型菌株的耐药和环境适应能力特点，初步揭示血清转换噬菌体与福氏志贺菌血清变迁的关系初步阐明志贺菌重要功能蛋白参与调控宿主相关免疫信号途径的作用方式初步认识志贺氏菌进化和变异的规律和趋势提出毒力大质粒对染色体的调控机制，发现染色体编码的新的抗毒力因子完成相关基因缺失突变体和过表达突变体毒力评价鉴别出转录或翻译调控蛋白2、揭示我国手足口病病原谱特征，初步阐明毒的基因和重要蛋白表位的变异特征以及病毒进化和力（致病力）的关系，筛选出低毒或无毒的重组步获得病毒颗粒晶体结构或病毒颗粒冷冻电镜结构，初步阐明毒复制及翻译机理3、进一步阐明宿主免疫的调控机制，阐明活疫苗的免疫保护机制和有效性评价指标4、阐明我国代表菌株流行变异规律和细菌在健康人群中定植传播能力的关联性5、发表文20。一、研究内容研究表明，自然资源开发、环境变化、人口老化、人员流动、抗生素滥用、人群免疫水平改变等多方面的原因均可导致病原体的变异。病原体通过变异不断适应宿主，但是其变异往往也导致致病力、耐药性、流行特性和临床表现等发生改变，从而给临床诊断、治疗、疫苗研发和预防控制带来困难，因此如何应对病原体变异是传染病防控面临的长期巨大挑战病原体通过非常复杂的机制导致疾病，但是迄今对病原体致病机制的认识总体上尚十分肤浅，揭示其致病机制仍是战胜传染病的一项长期任务。因此，阐明病原体流行变异规律并在此基础上揭示其与致病机制的关系，对于研发有效的疫苗和治疗药物以及制定、完善有效的治疗方案和防控措施均具有重要意义。鉴此，本项目拟以病原体变异规律与致病机制这两个传染病基础研究中的核心科学问题为突破口，针对我国现阶段居于传染病发病率前列的痢疾、手足口病以及流行型别和模式发生转变、对社会造成严重冲击的流脑等重要传染病病原体的流行变异规律和致病机制开展相关研究，从而为其有效防控打下基础。本项目围绕上述科学问题，根据不同病原体的特征，拟分成志贺氏菌变异规律和致病机制研究、病毒变异与毒力关系的研究、病毒致病与免疫机制研究、脑膜炎奈瑟菌变异规律和致病机制研究等四部分内容（一）志贺氏菌变异规律和致病机制研究拟解决的关键科学问题是福氏志贺氏菌通过血清型变迁实现流行和致病的分子机制。变异是志贺氏菌流行病学的一个最显著的特点，它既是志贺氏菌逃避免疫屏障，保持流行强度的重要机制之一，也对进一步发展和使用志贺氏菌疫苗具有决定性意义。围绕该科学问题拟主要开展以下研究1.福氏志贺氏菌血清型转换噬菌体解析和变异机制的研究通过不同的诱导方法，建立福氏志贺氏菌血清型转换噬菌体库。利用它在实验室构建自然界分离到的血清型菌株，研究血清型转化机制、噬菌体单独或共转导的特点、噬菌体和流行强度的关系、噬菌体对宿主菌致病力的影响等。2.优势血清型福氏志贺氏菌重要蛋白复合物和毒力蛋白功能针对Ⅲ型分泌系统毒力蛋白在痢疾杆菌感染中能下调宿主免疫应答的现象，寻找其在宿主细胞中的作用靶点研究相关毒力蛋白和其它重要功能蛋白参与调控宿主相关免疫信号途径的新作用方式等。3.优势血清型福氏志贺氏菌耐药特点研究从志贺菌全基因组和转录组水平高通量、全方位筛选耐药相关基因，系统评价志贺菌单耐药和多重耐药产生过程中获得耐药性的主要变异方式及分子机理，从而为临床耐药监测和开发针对耐药菌的新型抗菌药物提供潜在的分子靶位。4.优势血清型志贺氏菌毒力大质粒和染色体的协同进化研究通过比较多种优势血清型志贺氏菌菌株去除毒力大质粒前后、非致病性大肠杆菌导入毒力大质粒前后的蛋白表达谱和复合物谱的变化，并对这种变化背后的原因进行分析与研究，对志贺氏菌毒力大质粒和染色体协同进化进行较为全面系统的研究，以期获得致病菌适应性进化的新证据和新途径。（二）病毒变异与毒力关系的研究拟解决的关键科学问题是病毒遗传变异规律及其与毒力关系。和其他肠道病毒类似，有较高的变异频率，但我国变异规律和趋势尚不清楚，且对其变异与毒力的关系尚缺乏系统研究。本研究将为我国监测与疫苗株的筛选提供依据，并为阐明其致病机制提供线索。围绕该科学问题拟重点开展以下研究1.我国不同地区行变异规律研究通过对不同地区、不同时间分离毒株的大规模序列分析，阐明中国大陆流行的毒的基因变异规律及病毒基因型别进化，揭示不同毒株的进化关系和病毒衍化来源，宏观了解我国病毒基因变异和致病性的关系，为手足口病监测、防控策略的制定和疫苗株筛选等提供依据。2.异与病毒毒力关系的研究构建无神经毒或低神经毒的重组找潜在的毒力位点筛选与重要致病蛋白质相互作用的细胞因子或靶分子，鉴别阻断病毒有效复制或产生致病性的关键靶点解析异体病毒颗粒和重要功能蛋白的三维结构，为揭示病毒变异导致功能和毒力变异机制提供基础、为有效疫苗及治疗型药物的开发研究奠定基础。（三）病毒致病与免疫机制研究拟解决的关键科学问题是病毒的致病与免疫保护机制。目前致病和免疫机制尚不清楚，且缺乏灵敏、简易的动物模型，从而使其临床治疗方案的制订、疫苗和药物研发等缺乏科学依据。围绕该科学问题拟重点开展以下研究1.致病机制研究
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