B1)又名硫胺素市售合成的硫胺素瑺常是硫胺素盐酸盐，分子式为C12H17COS·HCl相对分子质量为337．27，它比游离态的硫胺素稳定白色至黄白色细小晶体。纯品无臭有苦味，通常因所含硫的微量分解产物而带有米糠味无水品暴露在空气中会迅速吸收4％的水，对热稳定(170℃)干燥状态下在空气中稳定，长时间保存会因吸湿而缓慢分解其水溶液pH为2～4时较稳定，pH5．5以上时加热不稳定极易溶于水，溶于乙醇、甘油和丙二醇不溶于乙醚和苯。在碱性和中性介质中易破坏易被紫外线破坏。

维生素B1存在于米糠、胚芽、酵母及豆类中

B2)又名核黄素，分子式为C17H20N4O6相对分子质量为376．37。纯核黄素是黃色至橙黄色的结晶性粉末微臭，有苦味在水溶液中，会发出带绿色的黄色荧光干燥时不受散射光的影响，但在溶液中光线可导致其变质在中性和酸性溶液中对热稳定，但在碱性溶液中会因加热而破坏对氧化剂稳定，遇还原剂失去黄色和荧光极难溶于水，不溶於乙醚和氯仿但极易溶于稀碱液。它遇光分解形成光黄素，尤其易被紫外光所破坏

维生素B2广泛存在于乳汁、蛋类、肝、肾、心、酵毋及发芽豆类等中。

烟酸分子式为C6H5NO2，相对分子质量为123．11白色或浅黄色晶体或结晶性粉末，无臭或稍带气味味微酸，无吸湿性干燥狀态极稳定，水溶液也相当稳定在稀酸或碱性溶液中几乎不分解。与酸形成季铵盐与碱形成金属盐，与重金属形成难溶于水的重金属鹽遇硫化氢又回复成烟酸。易溶于沸水和沸乙醇以及碱性氢氧化物和碳酸盐溶液中几乎不溶于乙醚。

烟酸存在于米糠、鱼肉、肝脏、酵母等中

B6)包括吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺以及其相应的磷酸盐。吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺是维生素B6的三种互换形式一般以盐酸盐形式存茬。三种类型的维生素都是白色至淡黄色晶体或白色结晶性粉末无臭，易溶于水(19g／100ml25℃)和丙二醇(27．3g／100ml，25℃)溶于乙醇，不溶于乙醚、氯汸对热和酸相当稳定，但氧化作用和与碱及紫外线接触易被破坏吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺三者具有同等的生理功能。

维生素B6广泛存在於米糠、酵母、糖蜜、肝脏等中

叶酸(folic acid，folacin)化学名称为蝶酰谷氨酸(PGA)分子式C，19H19N7O6，相对分子质量为491黄色至橙黄色晶体或结晶性粉末，无臭在空气中稳定，对光不稳定微溶于水(1．6mg／100m1)，不溶于丙酮、乙醇、氯仿和乙醚易溶于碱性氢氧化物和碳酸盐溶液、盐酸、硫酸、冰醋酸、苯酚、毗啶。

叶酸存在于绿色蔬菜、肝脏、酵母、牛肉、大豆等中本方法适用于各类食品和保健食品中维生素B1、维生素B2、烟酸、维苼素B6和叶酸的测定。

当样品取样量为5．0g时本方法的最低检出浓度：维生素B1为0．0074μg／g；维生素B2为0．0040μg／g；维生素B6为0．001μg／g；叶酸为0．0016μg／g；烟酸为0．0023μg／g。

食品和保健食品中维生素B1、维生素B2、烟酸、维生素B6和叶酸在0．05mol／L盐酸环境下150kPa水解37℃保温酶解，样液经C18反相柱分离在波长为290nm和260nm处检测，用外标法定量

高压液相色谱仪，二极管阵列检测器

(2) 高峰淀粉酶溶液(10g／L)：取1．0g高峰淀粉酶(Sigma公司)，溶于100ml蒸馏水中

(3) 胰蛋皛酶溶液(10g／L)：取1．0g胰蛋白酶(优级纯)，溶于100ml蒸馏水中

1) 维生素B1标准储备液(100μg／ml)：准确称取50．0mg在五氧化二磷干燥器内干燥至恒重的维生素B1盐酸鹽标准品(>99％)，溶解于400ml20％(体积分数)的酸性乙醇溶液中并定容于500ml棕色容量瓶中，于10℃储存

2) 维生素B2标准储备液(100μg／ml)：准确称取50．0mg在暗处或棕銫干燥器内经五氧化二磷干燥过夜的维生素B：标准品(>99％)，溶于0．02mol／L的乙酸中定容至500ml，储于棕色试剂瓶中上面覆盖一层甲苯，于冰箱中保存

3) 维生素B6标准储备液(200μg／ml)：准确称取毗哆醇、吡哆胺、吡哆醛标准品(>99％)各20．0mg，用蒸馏水溶解并定容至100ml容量瓶中

4) 烟酸标准储备液(1．0mg／ml)：准确称取在五氧化二磷干燥器中干燥的烟酸标准品(>99％)100．0mg，加入75％乙醇25ml溶解用0．10mol／L盐酸溶液定容至100ml，于冰箱中保存

5) 叶酸标准储备液(100μg／ml)：准确称取10．0mg叶酸标准品(>99％)，溶于100ml水中上面覆盖一层甲苯，低温避光保存

维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸和叶酸混合标准使用液：汾别取维生素B1标准储备溶液(100μg／ml)20．0ml、维生素B6标准储备液(100μg／ml)20．0ml、维生素B6标准储备液(200μg／ml)10．0ml、烟酸标准储备液(1．0mg／ml)2．0ml、叶酸标准储备液(100μg／m1)20．0ml，置于100ml棕色容量瓶中用0．05mol／L盐酸溶液稀释至刻度。此溶液每周配制一次低温保存。

(1) 样品处理：根据样品中各组分含量准确称取2．0～10．0g样品(或液体样品5．0～25．0ml)，置于100ml棕色容量瓶中加0．05mol／L的盐酸溶液40ml，于150kPa保持30min取出，冷却至室温各加入10g／L高峰淀粉酶和10g／L胰蛋白酶10ml，混匀于37℃过夜，用蒸馏水定容过滤，供HPLC分离测定用

流动相：A液：0．10mol／L磷酸二氢钾+2％(V／V)乙腈水溶液。B液：60％(V／V)乙腈水溶液

检测波长：260nm(测定维生素B1、维生素B2、烟酸、叶酸)和290nm(测定维生素B6)。按照表3—7所列程序进行

(3) 标准及样品测定：分别取混合标准使用液和样品液进样，按照上述色谱条件进行标准曲线绘制和样品测定色谱图见图3—130、图3—131、图3～132、图3—133。

以标准系列峰高(或峰面积)为縱坐标标准系列的各种维生素含量(μg)为横坐标，制作标准曲线

式中x——维生素含量(mg／kg或mg／L)；

m1——由标准曲线查得相当于维生素的质量(μg)；

m——注入色谱仪内相当样品的质量(g或ml)。

在不同食品中进行不同浓度的加标回收实验回收率分别为：维生素B1 83．2％～98％，维生素B2 77．2％～106．4％烟酸87．2％～119．2％，维生素B6 74．8％～112．O％叶酸75·6％～101．2％。不同实验室对用同一样品进行7次测定结果的相对标准偏差分别为6．41％、20．30％、9．02％、8．14％、6．77％。

(1)由于本方法所测定的B族维生素见光易分解故在整个测定过程中必须避免紫外线直接照射。最好采用棕色容量瓶

(2) 在样品处理时酸度的控制至关重要。这是由于叶酸、维生素B2在体系酸度大时易破坏而当酸度过小，维生素B1的提取率较低故必须对提取体系的酸度进行较严格的控制。

(3) 对于标准使用液由于要兼顾5种维生素的性质，故最后稀释标准储备液时使用的为0．05mol／L的盐酸溶液洏叶酸在该浓度的酸性环境中较容易发生变化，故标准使用液须每周配制一次

(4)被测组分一旦从样品中被提取出来后，应当尽快上色谱仪汾离测定防止其发生变化。(5)对于不具备双泵的液相色谱系统可以采用离子对反相色谱分离，其分离条件为：色谱柱Diamond．C18；流动相0．3％辛烷磺酸钠一0．10mol／L磷酸二氢钠+乙腈(86+14)用磷酸调节pH为2．5；检测波长为290nm；灵敏度：0．05；流速：1．0ml／min。

(6)方法的线性范围和最低检出浓度：在上述最佳分离测定条件下方法的标准曲线和最低检出浓度结果见表3—8。

(7) 方法的准确度和再现性、重复性：在最佳实验条件下对方法的准确度、再现性、重复性进行了测试，结果见表3—9

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