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His 标签蛋白（word）可编辑
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His 标签蛋白（word）可编辑
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his蛋白标签
his标签自己扩效果怎样？
his标签可以扩效果怎样？有人做植物稳定转化改造过带标签的载体？非常感谢
能详细一点吗？表达后要回收检测蛋白活性，新手，实验室以往也没有做。
自己在带his标签的载体上拿到的序列合成挂载体上有木有问题？
在植物稳定表达载体上带蛋白标签，有前辈做过么？能详细说一下吗？
非常感谢。
his-tag蛋白是否有活性要看不同蛋白，一般来说his-tag不影响蛋白活性，但是需要自己实验验证。如果蛋白N端有信号肽什么的，一般只能把tag加在C端。
没有做过在植物体内的
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随时随地聊科研His标签蛋白纯化填料(带柱子)- His标签蛋白纯化填料(带柱子) 蛋白质
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新品名称：&&His标签蛋白纯化填
新品类型：&&形成系列型新产品
新品型号：&&HR0387
新品产地：&&北京
新品品牌：&&百奥莱博
新品数量：& 842
包装说明：&&10 ml，瓶装
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发布日期：&&
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经营模式：生产型, 贸易型
企业核实：
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&His标签蛋白纯化填料(带柱子)- His标签蛋白纯化填料(带柱子) 蛋白质 的 详 细 说 明
特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。 产品名称：His标签蛋白纯化填料(带柱子) 规格：10&ml
我公司生产供应销售的蛋白质研究正全品类优惠促销，十分期待您的咨询选购His标签蛋白纯化填料(带柱子)&蛋白质研究。
本公司还供应上述产品的同类产品：His标签蛋白纯化填料,HR0387,带柱子
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his标签蛋白纯化说明
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你可能喜欢导读：就爱阅读网友为您分享以下“His-GFP蛋白的纯化步骤”资讯，希望对您有所帮助，感谢您对的支持!以His-GFP为例简述His-tag蛋白的纯化 His-tag是重组蛋白中最常用的融合标签之一。使用镍柱纯化His-tag融合蛋白的原理为：组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子，在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合，在低pH下用咪唑竞争洗脱。实验中一般选用6个组氨酸（His6-tag）的标签。His6标签有许多优点：（1） 由于只有6个氨基酸，分子量很小，对蛋白结构和活性的影响较小，一般不需要酶切去除；（2）（3） 可以在变性条件下纯化蛋白，在高浓度的尿素和胍中仍能保持结合力； His6标签无免疫原性，重组蛋白可直接用来注射动物，也不影响免疫学分析。 His6标签也有一些不足，如目的蛋白易形成包涵体、难以溶解、稳定性差及错误折叠等。镍柱纯化时金属镍离子容易脱落，混入蛋白溶液，不但会通过氧化破坏目的蛋白的氨基酸侧链，而且柱子也会非特异吸附蛋白质，影响纯化效果。本实验将以His-GFP（绿色荧光蛋白）为例，阐述His-tag蛋白的纯化过程。 1. E. coli重组菌体破碎表达完成的E. coli重组菌体，经超声或细胞破碎仪进行破碎。当需要破碎的细胞沉淀较少（＜ 1 g）时，通常在Eppendorf管中，用超声法完成细胞裂解。而当细胞沉淀较多时，可选用细胞破碎仪进行破碎。本实验采用细胞破碎仪法。细胞破碎仪法：称量细胞沉淀的湿重，加入细胞湿重10倍体积的裂解缓冲液。如，1 g细胞沉淀加入约10 ml的裂解缓冲液，使得细胞在溶液中的终浓度为10-15%，在此范围内细胞破碎的效果较好。过浓或过稀的细胞浓度均不利于破碎效率。裂解缓冲液的组成如下：Lysis buffer： 20 mM Tris-HCl, pH 7.4100 mM NaCl10 mM imidazole0.1% Triton X-1001 × protease inhibitor将细胞沉淀在裂解buffer中充分搅拌至没有结块后，进行高压破碎。细胞破碎仪的使用方法：首先加水至规定线后，开压缩机，将冷却水制冷至4oC，方可使用。本过程可能要要持续20 min左右。待水冷却至4oC后，开始破碎。为保证破碎效果，一般重复三次。破碎完成后，一定要卸压、放水、清洗样品槽。 2. 离心细胞裂解液15000 rpm、4C离心45 min，去除细胞碎片。离心完成后，得到的上清即细胞裂解液上清用来做进一步的纯化。对于GFP来说，由于折叠好的GFP本身具有颜色，因此可以通过颜色来判断在细胞裂解液上清、沉淀中是否具有GFP。在本实验中，
ml的培养物最终得到了
g的细胞沉淀，加入
ml的裂解缓冲液，最终得到
ml的细胞裂解液上清。 3. His-GFP蛋白的纯化Ni sepharose 6 FF凝胶的预处理：在直径2.5 cm的层析柱中装入适量的凝胶。本实验中选用2 ml凝胶（CV = 2 ml）。待液体流完后，分别用5 CV H2O和5 CV平衡缓冲液处理凝胶。平衡好的凝胶以待使用。平衡缓冲液的配制：20 mM Tris-HCl, pH 7.4100 mM NaCl10 mM imidazole吸附：将平衡好的凝胶加入到细胞裂解液上清中。将此混合物在4oC层析柜的混匀器上混匀30 min。装柱：将层析柱的下端打开，让未结合的蛋白随液体流出，收集流穿（flow through）。如果GFP完全吸附到柱子上，那么流穿中应该没有颜色，而柱子上应该有较重的黄绿色。流穿中的黄绿色越重，说明蛋白的吸附不理想。这种情况下，需要考虑调整平衡缓冲液的pH、NaCl的浓度、咪唑的浓度；以及吸附时间、细胞裂解液上清：凝胶的体积比等。洗脱非特异吸附的蛋白：用10 ml的10 mM imidazole（溶解在20 mM Tris-HCl, pH 7.4，500 mM NaCl中）洗脱非特异吸附的蛋白，自然流速洗脱，每1 ml一收集。目的蛋白的洗脱：分别用10 ml的50 mM、250 mM、500 mM的imidazole（溶解在20 mM Tris-HCl, pH 7.4，100 mM NaCl中）洗脱目的蛋白，自然流速洗脱，每1 ml一收集。洗脱级分的检测：10% SDS-PAGE检测各洗脱级分。 o镍柱的清洗：如果柱子上仍有残留的蛋白或者是脂类等物质未被洗脱下来，可以用2 M NaCl或0.5 M NaOH在自然流速下洗2 cv，然后用5 cv H2O继而5 cv平衡缓冲液冲洗。镍柱的再生：如果镍柱已使用超过5次，或明显可看到镍柱颜色变浅，或纯化其它蛋白担心引起交叉污染，可对镍柱进行再生，程序如下：1） 5 cv binding buffer2） 5 cv EDTA（in 20 mM Tris-HCl， pH 7.4，500 mM NaCl）3） 5 cv H2O4） 5 cv binding buffer5） 2 cv 0.1 M NiSO46） 5 cv H2O7） 5 cv binding buffer此时，柱子再生完毕，可继续使用。 蛋白纯化中应注意的事项：1. 缓冲液的选择：应根据目标蛋白的pI值和pH稳定性等条件来选择。例如，GFP的等电点是5.67，那么我们估测GFP在pH7.5附近应该为稳定的，因此我们首先尝试pH7.4的Tris-HCl缓冲液。如果实验结果表明该pH条件不稳定，那么我们再考虑换用其它缓冲体系。注意选择缓冲液时应避开蛋白质的等电点，因为蛋白质在其等电点时溶解度最小，容易沉淀，不利于蛋白质的稳定。此外，在进行融合表达时，计算目标蛋白的pI时，应考虑到融合标签的影响。2. 平衡缓冲液中NaCl及imidazole浓度的选择：在平衡缓冲液中加入NaCl及imidazole均是为了尽可能减少非特异吸附。具体浓度应根据Ni柱说明书及具体蛋白的特性进行调节。3. 吸附时间的选择：对于镍柱而言，一般30 min的吸附时间即已足够。但是对于一些吸附较差的蛋白，可酌情延长吸附时间。但需要注意的是，吸附时间过长，可能会增加非特异吸附。因此需要在目的蛋白的吸附和非特异吸附之间做出平衡。4. 细胞裂解液上清：凝胶的体积比：可根据Ni柱说明书中的每ml凝胶的蛋白载量进行适量调节。凝胶过少，则目标蛋白不能完全吸附，从流穿中流出；凝胶过多，则导致洗脱体积变大，以及不必要的非特异吸附。5. 目标蛋白的洗脱：用高浓度的imidazole进行目标蛋白的洗脱时，如果对该蛋白没有纯化经验，可采用线性imidazole梯度进行洗脱，如从10 mM – 500 mM imidazole进行洗脱，找出目标蛋白被洗脱出来的imidazole浓度区间。如采用分步梯度洗脱，应保证每个梯度均应洗2倍柱体积以上。6. 洗脱蛋白的检测：用SDS-PAGE检测目的蛋白的纯化情况。具体使用多大浓度的分离胶，应根据目标蛋白的分子量确定；上样量的多少，可粗略根据洗脱级分的280nm的吸光度进行估测，一般来说，电泳每个泳道上样1-10 ug比较理想，过少则条带不清晰，过多则容易跑成一团，不容易分辨各条带。7. 蛋白的储存：纯化得到的蛋白可透析或超滤后除去咪唑，加入5%的甘油，液氮速冻后-80oC保存。需要注意的是，蛋白质的反复冻融将对其活性造成不可逆的损失，因此应尽量避免，可将蛋白溶液分装成若干小份，每次取用一份。 百度搜索“就爱阅读”,专业资料,生活学习,尽在就爱阅读网,您的在线图书馆
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