114网址导航三色法流式细胞术检测胞内细胞因子的建立--《上海免疫学杂志》1999年05期
三色法流式细胞术检测胞内细胞因子的建立
【摘要】：运用荧光标记的抗细胞表面抗原单抗及抗细胞因子单抗， 结合固定、破膜处理技术， 建立了三荧光染色法流式细胞术检测细胞内细胞因子的方法， 探讨了不同刺激剂及细胞培养时间的选择， 并对５ 例正常人产生ＩＦＮ?γ、ＩＬ?４ 的ＣＤ４ 及ＣＤ８ 细胞进行测定。结果表明： 产生ＩＦＮ?γ的ＣＤ４ 及ＣＤ８ 细胞明显多于产生ＩＬ?４ 的细胞， 并且产生ＩＦＮ?γ的ＣＤ８ 细胞百分数比较ＣＤ４ 细胞相对增多； 同时产生ＩＦＮ?γ／ＩＬ?４ 的ＣＤ４ 、ＣＤ８ 细胞较少。此方法可从单个细胞水平直接用于Ｔ细胞亚群及其细胞因子的检测。
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&流式细胞术检测γδT细胞内细胞因子的方法学探讨
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BFA,Monensin一般不会影响Th1/Th2细胞因子的表达.下面的文章可能对你有用,祝顺利
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摘要：运用荧光标记的抗细胞表面抗原单抗及抗细胞因子单抗, 结合固定、破膜处理技术, 建立了三荧光染色法流式细胞术检测细胞内细胞因子的方法, 探讨了不同刺激剂及细胞培养时...
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找到约301条结果胞内细胞因子检测问题 - 流式中文网 - Powered by Discuz!
流式中文网
标题: 胞内细胞因子检测问题
作者: 可可菲& & 时间:
标题: 胞内细胞因子检测问题最近在做胞内细胞因子的检测，但是结果一直都不好，表达量非常低，最高的也不到1%，不知道有没有标准一些的胞内抗原检测流程？怀疑是实验流程有些问题。
作者: niwanmao& & 时间:
一般厂商的说明书就很详细了。
可以参见这个幻灯，可能对你有帮助：
作者: 可可菲& & 时间:
恩&&谢谢倪老师 有问题我再来发帖求帮助~
作者: 可可菲& & 时间:
niwanmao 发表于
一般厂商的说明书就很详细了。
可以参见这个幻灯，可能对你有帮助：/bbs/thread-193 ...
倪老师，这个PPT我下载不了，在线也看不全啊，能不能发我邮箱一份呢？，谢谢老师！
作者: niwanmao& & 时间:
可可菲 发表于
倪老师，这个PPT我下载不了，在线也看不全啊，能不能发我邮箱一份呢？，谢谢老师！ ...
我试过了，可以下载和浏览，可能是因为你们那边的网速问题。尝试一下换个网络或者刷新浏览。
作者: 可可菲& & 时间:
niwanmao 发表于
我试过了，可以下载和浏览，可能是因为你们那边的网速问题。尝试一下换个网络或者刷新浏览。 ...
恩 好吧 我再试试
作者: Mia_day& & 时间:
BD Pharmingen胞内因子检测的中文操作步骤，与大家一起分享
使用流式中文网资料阅读器在线阅读，免流星，内容与附件完全一样（）
（如图片无法正常显示请复制链接：）
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作者: Mia_day& & 时间:
[attach]2496[/attach] BD 周期检测操作步骤
作者: Mia_day& & 时间:
[attach]2497[/attach]&&[attach]2498[/attach] [attach]2499[/attach]
科研常用实验操作说明，供参考，也欢迎大家提供实验过程中的优化建议
作者: niwanmao& & 时间:
Mia_day 发表于
[attach]2496[/attach] BD 周期检测操作步骤
&&怎么不开新帖啊，呵呵，我晚上回去整理下，谢谢
作者: woodking& & 时间:
最近在做流式，有些问题请教大家。我也是做胞内细胞因子的，一般做到破膜固定后放在冰箱内，第二天再继续胞内染色后上机检测，不知道这样有没有什么问题？还有BD的那个流程对于选择性固定后过一段时间再进行胞内染色的那段，没有提到再进行破膜，是不是漏掉了？
作者: niwanmao& & 时间:
woodking 发表于
最近在做流式，有些问题请教大家。我也是做胞内细胞因子的，一般做到破膜固定后放在冰箱内，第二天再继续胞 ...
最近有研究生做IFN-γ、IL-17、IL-22，开始采用前一天晚上全部染好，放到第二天上机，结果发现细胞分群很差，表达不清，比例很低很低，于是后来建议其采用先固定，第二天进行破膜和胞内染色（约相隔12－15小时），发现效果比之前的方法好很多。所以你可以先固定好细胞，放在冰箱内，第二天大早来进行破膜和胞内染色。
你说的BD一个流程中没有提到破膜，是哪个？
作者: woodking& & 时间:
我们这里只有下午才能上机，所以我们是第一天做到破膜固定后放到第二天中午继续胞内染色后上机。如果按倪老师的方法，先用什么固定呢？4%多聚甲醛吗？
作者: niwanmao& & 时间:
woodking 发表于
我们这里只有下午才能上机，所以我们是第一天做到破膜固定后放到第二天中午继续胞内染色后上机。如果按倪老 ...
表面标记可以先染，然后用fix&Perm kit中的A液固定。
作者: woodking& & 时间:
5. Alternative Fixation and Permeabilization Protocol
Cells can be fixed and stored to continue the intracellular staining at a later time.
a. Fixation and Storage of Cells
1. Resuspend cells in 100μl (or 1 ml/107 cells for bulk fixing) of a 4%
paraformaldehyde solution at 4°C for 10-20 minutes.
2. Wash cells 2× in Staining Buffer.
3. Resuspend cells in Staining Buffer for storing cells at 4°C for up to
72 hrs or in 90% FCS/10% DMSO for storing at -80°C for longer
periods of time.
b. Permeabilizing Fixed Cells.
1. For frozen cells, wash 2× to remove DMSO. For cells at 4°C,
pellet and remove staining buffer.
2. Resuspend cells in BD Perm/Wash(TM) buffer for 15 minutes.
3. Pellet by centrifugation.
4. Stain for intracellular cytokines.
在这里好像没提到继续要破膜
作者: woodking& & 时间:
我是先染表面标记，然后破膜固定，再放在破膜buffer里到第二天继续染胞内细胞因子，因为以前也有人这样做的，结果还可以。但我的CD4就是标记不理想，不知道啥回事。
作者: niwanmao& & 时间:
woodking 发表于
我是先染表面标记，然后破膜固定，再放在破膜buffer里到第二天继续染胞内细胞因子，因为以前也有人这样做的 ...
是先固定，再破膜，不叫“破膜固定”。
就这么操作。效果不错的。
CD4标记不理想可能是因为莫能霉素等刺激剂的影响，肯定没有未刺激的细胞分群清楚，但只要能分的开就行。
作者: niwanmao& & 时间:
woodking 发表于
5. Alternative Fixation and Permeabilization Protocol
Cells can be fixed and stored to continue the&&...
这段中间我加粗的不就是破膜吗？
b. Permeabilizing Fixed Cells.
1. For frozen cells, wash 2× to remove DMSO. For cells at 4°C,
pellet and remove staining buffer.
2. Resuspend cells in BD Perm/Wash(TM) buffer for 15 minutes.
3. Pellet by centrifugation.
4. Stain for intracellular cytokines.
作者: woodking& & 时间:
Fixation/Permeabilization solution，BD的东西不是一起的么？呵呵，谢谢了
作者: niwanmao& & 时间:
woodking 发表于
Fixation/Permeabilization solution，BD的东西不是一起的么？呵呵，谢谢了
ebioscience、biolegend、invitrogen的都是分成两个组分，难道BD会例外？我记得BD做foxP3的破膜剂也是两个组分，是不是你记错了？
作者: woodking& & 时间:
BD的盒子里是两瓶的
Kit components:
o Fixation/Permeabilization solution (125 ml)
o BD Perm/Wash(TM) buffer,
那个加粗的只是标题啊，下面的1,2,3,4里没有加破膜剂的步骤，只写了个加perm/wash buffer的
作者: woodking& & 时间:
foxp3是要破核膜的，好像是更强的一点的，有两步。
作者: woodking& & 时间:
倪老师，还想请教一下，空白对照的基础荧光阈值高了是怎么回事呢？
作者: niwanmao& & 时间:
woodking 发表于
BD的盒子里是两瓶的
Kit components:
o Fixation/Permeabilization solution (125 ml)
可能叫法不同吧，我觉得应该是第二个加粗的部分Perm/Wash(TM) Buffer。
关于foxP3核内标记，它和胞内的标记一样都是两步，但它的第二步要复杂一些，破膜剂组成也不同。
作者: woodking& & 时间:
可那只是个10×的buffer呀，真正起破膜作用的是那个Fixation/Permeabilization solution。
倪老师，空白对照的基础荧光太高该怎么办？老师说洗的不够，我很困惑，这里面啥抗体都没加，再洗有用吗？
作者: niwanmao& & 时间:
woodking 发表于
可那只是个10×的buffer呀，真正起破膜作用的是那个Fixation/Permeabilization solution。
倪老师，空白对 ...
空白对照的荧光太高有可能跟你细胞状态或细胞本身有关，空白对照我觉得没有必要设置吧。象你如果要做CD4、CD3、IL-17，那么就直接用CD4、CD3这个FMO对照（即扣掉一个荧光参数）来设置IL-17的maker。
作者: niwanmao& & 时间:
woodking 发表于
可那只是个10×的buffer呀，真正起破膜作用的是那个Fixation/Permeabilization solution。
倪老师，空白对 ...
Fixation/Permeabilization solution是什么成份查不到，可能有一定的破膜成份，但看了Perm/Wash Buffer的说明书之后（BD Perm/Wash buffer consists of 100 ml of concentrated stock solution (10X) containing both Fetal Bovine Serum (FBS) and saponin）真正起破膜作用的我认为是它，因为其中的皂素就是最经典的破膜成份。
作者: woodking& & 时间:
那放在这个buffer里过夜的话，破膜的时间是不是太长了啊？
作者: niwanmao& & 时间:
woodking 发表于
那放在这个buffer里过夜的话，破膜的时间是不是太长了啊？
所以我前面说的是用第一个组分，固定过夜
作者: woodking& & 时间:
bd的说明书上是如果要间隔一段时间再染色的话用4%多聚甲醛4度10-20分钟，staining buffer洗涤两次后，用staining buffer重悬保存。
作者: niwanmao& & 时间:
woodking 发表于
bd的说明书上是如果要间隔一段时间再染色的话用4%多聚甲醛4度10-20分钟，staining buffer洗涤两次后，用sta ...
如果说明书上这么说，应该是可以的，而且从原理上也是说的通的。因为我们用其它kit也是都是先用fix成份固定过夜，第二天用perm成份破膜和染色。
作者: Mia_day& & 时间:
niwanmao 发表于
@Mia_day&&怎么不开新帖啊，呵呵，我晚上回去整理下，谢谢
嘿嘿，目前经验还没那么丰富，仍在努力学习当中
倪老师和经验丰富的会员们开贴，有需要的地方我再和大家一起讨论分享
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