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【原创】人体感染未知病毒，有没有可以用PCR检测的可能性
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这个帖子发布于2年零237天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
本人 极有可能是未知病毒，并且病毒序列不明，请求哪位可以帮忙鉴定,定予重谢。
不知道邀请谁？试试他们
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我是一家6口的顶梁柱，此事关系到我的人生乃至一家人命运，请好心人帮助，感激涕零。
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对于序列不明的病毒，无法设计引物，所以用PCR的方法不合适。一种可能的方案是测序，但也有问题，很可能测不到，或者由于丰度偏低，在后续的生物信息分析中分析不出来。个人拙见，仅供参考！建议去技术较为先进的医院检测分析！
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wisdom_love 对于序列不明的病毒，无法设计引物，所以用PCR的方法不合适。一种可能的方案是测序，但也有问题，很可能测不到，或者由于丰度偏低，在后续的生物信息分析中分析不出来。个人拙见，仅供参考！建议去技术较为先进的医院检测分析！非常感谢智爱先生的解答，但您的答案也让我再次跌入低谷。各个大医院已经跑过不下20趟，无检测出异样病原体。已经少有方法能用了。
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请问，如果使用随机引物来分析病毒，成功率高么
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summerkay 请问，如果使用随机引物来分析病毒，成功率高么 对于完全未知信息的病毒，使用随机引物是不可能分析出病毒信息来的。by the way ,能否详细说明一下具体情况？你依据什么判断自己感染了未知病毒？
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summerkay 非常感谢智爱先生的解答，但您的答案也让我再次跌入低谷。各个大医院已经跑过不下20趟，无检测出异样病原体。已经少有方法能用了。那就试试测序吧，找一个专业的机构，必须测序技术和分析技术都要过硬才行。
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wisdom_love 那就试试测序吧，找一个专业的机构，必须测序技术和分析技术都要过硬才行。 谢谢您的建议。不知道是否有专业机构符合条件的，给予推荐？
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breezemail
对于完全未知信息的病毒，使用随机引物是不可能分析出病毒信息来的。by the way ,能否详细说明一下具体情况？你依据什么判断自己感染了未知病毒？ 十分感谢您对我的关注！我是家庭的独子，38岁，正月初三同学会喝酒后直接被送桑拿，喝醉后无控制力，犯下大错。回家2个礼拜后发现皮肤粗糙，脸色变黄，出现雀斑样痣和红色血管痣，开始多梦，口腔溃疡，腹部隐痛，肠鸣不适。上网找寻到类似人群不少。。。可惜都无证据支持，甚至被***机构认定为精神疾病。可怕的是，我又发现家人陆续开始出现皮肤灰黄现象，孩子开始睡眠不足，夜间哭闹。这一切不可能是巧合，只有病毒才有如此强悍的传染性，而我更是无力说服我年迈的医生父亲。 我无所适从，不知该怎样，突然发现丁香园有许多热心的专业人士，就来求救，想挽救我一家几口的健康，我自己的未来，家庭的未来。
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3个月后，检测过HIV和梅毒都为阴性。
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建议找家相关的三甲医院，根据症状做全面的检查。论坛毕竟只能讨论一些问题，而不能排查出你的病因。
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的确是无法解决我身体的病痛，可是如果能帮我找到病毒的属性或者分类，或许可以找到解药。这是我唯一能做的。譬如，找到EVB，就可以治疗，找到HPV-19B，我也能给家人治疗。问题是现在无从下手。三甲医院只有常规的类型检测，都是已知的病原体。
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你好，你的病因找到了吗？我的情况和你一样，请求帮助，谢谢
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关于丁香园《PCR技术检测病毒》
书籍信息/《PCR技术检测病毒》
著作者：医学院出版社：人民卫生音像出版社ISBN号：出版日期：装帧：简装定价：38元
检测Cox.病毒/《PCR技术检测病毒》
pcr技术 PCR技术的应用
柯萨奇病毒(Coxsackieviruses简称Cox.病毒)是1948年Dalldorf等采用新生小鼠研究病毒时，在纽约附近的Coxsackie分离发现的一种肠道病毒，属小RNA病毒科，可分为A、B二组.A组有23型(A1-22，24)，B组有6型(B1-6)，与A组的A9型有共同的组特异性抗原.可引起许多不同的临床症侯，甚至同一病毒可以引起不同的疾病(表1)，近年通过PCR技术证明，除可导致脑炎、脑膜炎外，是心肌炎、心包炎的重要病原，其持续感染可能与特发性扩张型心肌病密切相关.本文简述PCR技术在Cox病毒检测中的应用。
一、Cox病毒基因与
Cox病毒为肠道病毒属，其基因结构具有小RNA病毒科的共同特征(如图所示)，可分为衣壳蛋白基因区，无性繁殖功能区和非编码区，其5'-末端即位于外的碱基序列同其他小病毒具有较高的交叉性。
病毒感染引起的主要临床症侯主要临床症侯组主要型别无菌性脑膜炎A2，4-7，9，10，12，16B所有型别疱疹性咽峡炎A1-6，8-10，16，21，22急性上感A2，10，21，24
B2-5A16A4，6，8-10
B1-5心肌炎B2-5心包炎B1-5麻痹疾病A4，7，9B3-5目前，根据Cox病毒基因的序列研究结果，人们选择高度保守的编码区和5'非编码区(如nts461-640)，已设计了多对引物，用于Cox病毒A组和B组的扩增及特异性扩增CoxB3病毒.但由于Cox病毒与其小RNA病毒基因之间有高度的同源性(70-90%，位于VP1基因)，目前设计的引物除CoxB3病毒特异性引物外，其余的引物均可用于扩增CoxA组和B组病毒，并同脊髓灰质炎病毒有较高的交叉反应.
Cox病毒PCR扩增所用引物及探针引物及序列位置片段意义探针(5'-3')()(bp)　P1(＋)CGGTACCTTTGTGCGCCTGT64-83414用于扩增CoxA16，21P2(－)TTAGGATTAGCCGCATTCAG459-478CoxB1-6及探针TATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGG430-455P3(＋)CAACTTAGGAGAAAGCTAGACoxB3特异性引物P4(－)CACCTGGTGGTACATACATA探针CGGTTCGACCTGGAGCTGAC　　P5(＋)GCAACTCCCATCACCTGTACCoxB2-4，PV1P6(－)ATCACATCATCAACCATATGC探针TACTTTGTGAGGGGTGGCAT　　P7(＋)TATGGTGATGATGTGATCGC探针TACTTTGTGAGGGGTGGCAT　　P8(－)TCCCCGTTATGCCAAGCTAA探针TTGGATCCTTGGTCCATCTAP9(＋)TGCGGCTAATCCTAACTGCG461-480179探针TTGGATCCTTGGTCCATCTAP10(－)CCGGATGGCCAATCCAATA621-640探针CGGTTCCGCTGCAGAGTTGC522-541　　
pcr技术检测二、标本的采集和处理按常规方法收集鼻咽分泌物、粪便、心肌活检材料及脑脊髓液等标本后，应在0-4℃条件下立即送实验室，分装保存于-20℃或提取模板.由于体液和组织中RNase含量较高，影响制备病毒RNA，故在制备RNA前应按100Ul标本中加40U的抑制RNasin.
三、模板RNA制备1.酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿法:适用于从心肌等活检标本或细胞培养标本.①先将标本(1.5mm3)或1×107细胞研磨匀浆，加入1ml裂解液(4mol/L异硫氰酸胍-25mmol/LPH7.0，50mmol/L2-硫基乙醇，0.5%Sarkosyl)，混合后冰浴中作用15min.②分别加入1/10体积的2mol/LNaAc(PH4.0)，等体积，2/10体积的氯仿，混合作用15S.③15000r/min离心15min，收集水相，加入等体积的异丙醇，1-20℃2h，再次离心，用75%乙醇洗一次，收集RNA沉淀。2.酚-氯仿抽提法:适用于从体液标本中制备RNA.①取体液标本100Ul于反应管中加入2%，使终浓度为0.5%，再与等体积的酚:氯仿(1∶1)混交，15000g离心15min，收集上层水相.②再向原反应管的有机中加入含0.5%SDS的TNE溶液(10mmol/LTris-HCLPH7.5，100mmol/LNaCl，1mmol/LEDTA)，提取一次，同上离心，收集水相.③将两次收集的水相合并，加入NH4AC溶液，使以浓度为2mol/L，加2.5倍体积的冷无水乙醇，-20℃置2h以上，15000g离心(4℃)30min，弃上清，收集沉淀，用20UlTE(PH7.5)稀释(含40U的RNasin)。
四、逆转录取5UlRNA提取模板加入20Ul反应混合液(含50mmol/LTris-HClPH8.4，6mmol/LMgcl2，10mmol/LDTT，50mmol/LNaCl，250mmol/L的dATP，dCTP、dGTP、dTTP，1umol/L下游引物P2)及40UAMV;再加25-50Ul矿物油封顶后于42℃反应1h，使RNA逆转录为cDNA。
五、PCR扩增①取上述逆转录后的反应混合物20Ul，加PCR反应液至100Ul反应体积.PCR反应液含有终浓度为50mmol/LKCl，10mmol/LTris-HClPH8.4，1mmol/LMgCl2，100Ug明胶，引物1和引物各1Umol/L及四种dNTP各200Umol/L.②混匀后，94℃水溶5min，冷至55℃。③加入2.5UTaq聚合酶，振荡摇匀，用100ul矿物油封顶。④94℃变性2min，55℃退火2min，72℃延伸2min，重复35个循环.最后于72℃延伸10min。⑤为提高某些标本检测的敏感性，可取第一次扩增产物1Ul，作模板，加入PCR试剂进行第二次扩增(20-25个循环)。
六、扩增产物的检测(一)电泳法：取10Ul的PCR产物于1%或2%上电泳，以EB染色显示PCR产物，如出现与目的片段大小相同的扩增产物，则判为阳性。(二)杂交法：1.将PCR产物与等体积的0.6mol/LNaOH混合，室温作用15min后，转移到尼龙膜上。2.用100Ul2mol/L，NH4AC溶液中和后，将滤膜置真空炉中烘烤2h。3.将膜置于5XSSC-1%SDS-0.5%BSA的缓冲液作预杂交。4.再于含50Ul0.4Umol/L标记探针的预杂交液中，45℃，15min。5.用1%SDS-1×SSC液及1%TritonX-100液100ml，先后各洗2次，再用1×SSC洗1次。6.将滤膜浸入7.5ml碱性磷酸酶混合物中室温显色3-4h，然后双蒸水洗涤，终止反应。
七、应用和发展目前，应用上述引物，可进行Cox病毒感染的诊断，特别是用CoxB3病毒的特异引物，扩增病人心肌活检标本中该病毒的核酸，具有很高的敏感性和特异性，同其他Cox病毒及小RNA病毒无交叉反应，并证明CoxB3是心肌炎的重要病原，同密切相关，故随着此技术的深入应用，将有助于揭示上述心脏病的真正病因.当然，目前PCR引物的设计还需进一步解决Cox病毒A组、B组特异性引物及型特异性引物问题，这样才能进一步用于临床诊断及分子流行病学的研究，同时也有助于了解Cox病毒变异的规律，为研制预防用的疫苗奠定基础。
PCR技术应用/《PCR技术检测病毒》
pcr技术检测PCR技术应用一：诊断单基因疾病PCR技术应用二：骨肿瘤诊断PCR技术应用三：突变基因检测PCR技术应用四：遗传病诊断PCR技术应用五：苯酶同尿症诊断PCR技术应用六：A基因诊断PCR技术应用七：PCR技术应用八：DMS/BMD基因诊断PCR技术应用九：检测人COX病毒
相关词条/《PCR技术检测病毒》
参考资料/《PCR技术检测病毒》
http://www./&PCR资料
/yiwei/book255956/&书籍购买
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内蒙古师范大学学报（自然科学汉文版）
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贡献光荣榜对虾传染性肌肉坏死病毒PCR检测方法建立及样品检测--《鲁东大学》2012年硕士论文
对虾传染性肌肉坏死病毒PCR检测方法建立及样品检测
【摘要】：对虾传染性肌肉坏死病（Infectious myonecrosis，IMN）是近几年出现的感染凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的疾病，该病的病原是一种双链RNA病毒——对虾传染性肌肉坏死病毒(Infectious myonecrosis virus，IMNV)。该病2002年首次暴发于巴西的凡纳滨对虾养殖场，并迅速在巴西东北部沿岸地区迅速传播蔓延，2006年，经由非法的从巴西进口虾苗的途径，传至印度尼西亚东爪哇省。
感染IMNV的病虾在腹部末端体节及尾扇肌肉部位出现白色斑点，在整个养殖季节出现慢性死亡，累积死亡率可达70%。因此，IMN给对虾养殖业造成了巨大的经济损失，自年给巴西水产养殖业造成超过1亿美元的损失，至2010年给印度尼西亚造成超过100万美元的损失。由于IMN带来的巨大经济损失，国际兽医局(OIE)在2005年将其列为需要报告的水生动物病毒性疫病。
目前针对IMN还未发现有效的治疗方法，因此，对该病害主要以防为主，建立快速又灵敏的检测方法十分必要。本研究建立了IMNV的一步RT-PCR检测方法、TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，并对部分地区的凡纳滨对虾样品做了IMNV检测，进行了IMN的流行病调查。主要内容及结果如下：
1.建立了IMNV一步RT-PCR检测方法。根据IMNV的全基因序列(GenBankaccession no.AY570892)，设计四对引物，从中筛选出灵敏度最高的特异性引物IMNV-F(5′-G G A C C T A T C A T A C A T A G C G T T G C A-3′)和IMNV-R (5′-A A C C C A T AT C T A T T G T C G C T G G A T-3′)，可扩增产生134bp的DNA片段，最终检测灵敏度达104拷贝。
2.建立了一种IMNV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。设计一对特异性引物IMNV-F (5′-G A T G G C A G C A C G T C A A A A T G-3′)和IMNV-R (5′-C A G C T GT T C C T G G G A C T T C C T-3′)和TaqMan荧光探针(5′-C T A T T T C C T C C A C TA A T T C A G A G C-3′，89–122bp in GenBank AY570892)，可扩增产生101bp的DNA片段，引物和探针对IMNV有高度特异性，不与对虾白斑综合征病毒(White spotsyndrome virus, WSSV)、肝胰腺细小病毒(Hepatopancreatic parvo-like virus, HPV)、斑节对虾杆状病毒(Penaeus monodon baculovirus, MBV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hppodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)、健康虾DNA出现交叉反应。本研究建立了一种含有IMNV靶序列的质粒用于实时荧光定量PCR灵敏度的确定，其检测灵敏度达1拷贝的IMNV cDNA克隆质粒。
3.采集了来自山东、福建、广东、江苏、浙江等省份的凡纳滨对虾样品631个，利用已建立的一步RT-PCR方法进行IMNV检测，检测结果都为阴性。说明这些地区并未有IMN的大肆流行。
【关键词】：
【学位授予单位】：鲁东大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：S945【目录】：
摘要5-7Abstract7-13第一章 综述13-23 1 PCR 技术在对虾病毒检测中的应用13-20
1.1 常规 PCR13-14
1.2 套式 PCR14-15
1.3 多重 PCR15-16
1.4 PCR 法制备探针16
1.5 实时定量 PCR16-19
1.5.1 TaqMan 实时荧光定量 PCR17-18
1.5.2 荧光染料实时定量 PCR18-19
1.6 PCR-ELISA19-20 2 对虾传染性肌肉坏死病毒的研究进展20-23
2.1 病原20
2.2 流行地区20
2.3 外观症状和病理变化20-21
2.4 检测方法21-23第二章 IMNV RT-PCR 检测方法的建立与优化23-43 1 材料与方法23-34
1.1 材料23
1.2 试剂23-24
1.3 实验仪器24
1.4 IMNV 阳性组织 RNA 的提取24-25
1.5 IMNV 阳性组织的套式 PCR 法确认检测25-26
1.5.1 外引物扩增25-26
1.5.2 内引物扩增26
1.6 传染性肌肉坏死病毒 RT-PCR 检测引物的筛选26-28
1.6.1 引物的设计与合成26-27
1.6.2 四对引物对 IMNV 的 RT-PCR 扩增27-28
1.7 传染性肌肉坏死病毒阳性克隆的制备28-32
1.7.1 总 RNA 的 RT-PCR 反应及 RT-PCR 产物纯化28-29
1.7.2 LB 培养基的配置29
1.7.3 活化菌种29
1.7.4 CaCl_2法制备感受态细胞29-30
1.7.5 连接反应及转化30
1.7.6 蓝白斑筛选及白斑的扩大培养30
1.7.7 转化子的 PCR 鉴定30-31
1.7.8 阳性重组质粒测序31
1.7.9 阳性重组质粒的纯化及拷贝数的测定31-32
1.8 一步 RT-PCR 检测方法灵敏度的优化32-34
1.8.1 一步 RT-PCR 检测方法退火温度优化32-33
1.8.2 一步 RT-PCR 检测方法灵敏度的确定33-34 2 结果34-41
2.1 提取的 RNA 的质量检测结果34
2.2 IMNV 阳性组织的套式 PCR 检测结果34-35
2.2.1 外引物扩增结果34-35
2.2.2 内引物再次扩增结果35
2.3 传染性肌肉坏死病毒 RT-PCR 检测引物的筛选结果35-36
2.4 阳性克隆的制备36-40
2.4.1 RT-PCR 产物纯化结果36-37
2.4.2 蓝白斑筛选结果37
2.4.3 转化子的 PCR 扩增电泳鉴定结果37-38
2.4.4 阳性重组质粒测序结果38-39
2.4.5 克隆拷贝数的测定结果39-40
2.5 一步 RT-PCR 反应灵敏度的优化40-41
2.5.1 一步 RT-PCR 检测方法退火温度优化40
2.5.2 优化温度下一步 RT-PCR 检测方法灵敏度的确定40-41 3 讨论41-43第三章 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法的建立43-54 1 材料与方法43-46
1.1 材料43
1.2 试剂43
1.3 实验仪器43-44
1.4 TaqMan 探针及引物的设计44
1.5 含有目的基因的质粒的制备44
1.6 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 引物及探针的筛选44
1.7 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 退火温度的优化44-45
1.8 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法特异性45-46
1.9 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法可重复性及灵敏度46
1.10 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法的应用46 2 结果46-52
2.1 筛选出的引物、探针及克隆46-48
2.1.1 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 质粒的扩增结果46-47
2.1.2 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 质粒的测序结果47-48
2.2 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 退火温度的优化48-49
2.3 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法特异性49-50
2.4 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法可重复性和灵敏度50-51
2.5 IMNV TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测方法的应用51-52 3 讨论52-54第四章 凡纳滨对虾样品检测54-59 1 材料与方法54-55
1.1 材料54
1.2 试剂54
1.3 总 RNA 的提取54-55
1.4 RT-PCR 检测55 2 结果55-57 3 讨论57-59第五章 结论59-60参考文献60-72致谢72-73硕士期间取得的成果73已整理待投的文章73
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