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【求助】DNA提取过程中的疑问！
我这几天每次提取DNA时，沉淀那一步，加入预冷的异丙醇之后，慢速颠倒混匀之后，看到很多的白色悬浮状物质，但是经离心沉淀至最后溶解后什么也看不到了，电泳检测什么也没有，不知道混匀之后的白色物质是蛋白质还是DNA???敬请各位高手指导！！！！！！！！！！！！！不清楚是什么，不过可以肯定的是不是DNA，染色体DNA在这一步应该是絮状的我的就是悬浮物,但是最后还是没有DNA.提的什么材料？是不是多糖？我觉得你可能是加的东西不是很合适，我加的是无水乙醇。开始也做得不是很好，现在浓度、纯度都能达到非常高。基本操作，多练习下，会做好的。cctj06的连接是病毒!我一连上,卡巴斯基的杀猪声叫个不停.已经验证cctj06的附件安全！实在对不起，我不知道，现在我将它删了simonsky wrote:我这几天每次提取DNA时，沉淀那一步，加入预冷的异丙醇之后，慢速颠倒混匀之后，看到很多的白色悬浮状物质，但是经离心沉淀至最后溶解后什么也看不到了，电泳检测什么也没有，不知道混匀之后的白色物质是蛋白质还是DNA???敬请各位高手指导！！！！！！！！！！！！！加入预冷的异丙醇这一步后，正常应该出现白色絮状DNA。向楼上说的很多白色悬浮状物质，可能是基因组DNA和蛋白都有。这一步后可以参照下面的步骤：（6）将DNA沉淀挑入一新的1.5mL离心管中，加入1mL 70%的乙醇，洗涤沉淀；（7）沉淀干燥后加入0.5mL TE（含终浓度50mg/mL 的RNaseA）溶解，37°C 消化RNA 0.5-1hr；（8）等体积苯酚/氯仿、氯仿各抽提一次；&&（9）上清加入1/10倍体积3M NaAc（pH5.2）和2-2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后，于-20°C放置30min，12,500rpm，4°C离心15min，弃上清；（10）70%乙醇洗涤DNA沉淀，干燥后溶于适量TE或三蒸水中；不知道楼主，有没有把你说的白色悬浮状物质都挑到新的管子中呢？建议你以后加大组织消化时间或可以加大蛋白酶K的用量。第9步，我们实验室一般在-20°C放置2个小时，以沉淀DNA。谢谢各位的热情帮助!离心沉淀后，你是不是把需要的DNA倒掉了？
您的位置： &&异丙醇能够从TE缓冲液中沉淀出DNA吗?
瑞瑞酃槫姴
可以的.如果想合管或浓缩DNA就可以这样做我们实验当中都有做过的
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[求助]全血中DNA的快速提取方法
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[求助]全血中DNA的快速提取方法
我想从全血中提取DNA的简便快速的方法，用于PCR？请教各位老师有什么有效的方法？谢谢！&&查看完整版本请点击这里：
DDD ( 10:49:38)
一滴血直接用于PCR，不知道你听说过吗？速度更快!!
海鸥crazy ( 10:50:02)
很多方法，用试挤盒提取，好多公司都有卖的。有好多种，你可以看看他们的网站。告诉你一个
就象chengtc所说，一滴血就可以测，不过贵一点！
冷眼相对 ( 10:50:34)
我做的是这个方面
我购买了TAKARA试剂盒，590元，50次的，效果还可以。但提取过程得摸索几次才行，特别是步骤中有一步有机相和无机相的分离，我可使搞了几次才成功，现在提取的DNA不用测吸光度我也相信一定适合PCR了。我做的PCR结果到目前为止已经出来了清晰的阳性条带，只是还有几条杂带待消。
冷眼相对 ( 10:50:34)
我做的是这个方面
我购买了TAKARA试剂盒，590元，50次的，效果还可以。但提取过程得摸索几次才行，特别是步骤中有一步有机相和无机相的分离，我可使搞了几次才成功，现在提取的DNA不用测吸光度我也相信一定适合PCR了。我做的PCR结果到目前为止已经出来了清晰的阳性条带，只是还有几条杂带待消。
荒漠孤驴 ( 10:52:41)
谢谢大家了，请教高手，你提供的方法中红细胞裂解液、DNA溶解液、蛋白沉淀液的详细成分是什么呀？
天蓝蓝 ( 10:56:35)
我现在想从牛血中提取DNA用于PCR，不知用什么血液抗凝剂较好、对PCR影响最小？抗凝剂具体是什么组成？
wu ( 10:57:23)
这个方法是我转来的，自己没有用过。我用的方法中的红细胞裂解液是TNE。DNA溶解液是TE。但我的方法需要用蛋白酶K消化过夜，所以速度较慢。至于抗凝剂，我用的是柠檬酸0.48g＋柠檬酸三钠1.52g＋葡萄糖1.47g，再加三蒸水至100ml配成的。
鸽子不哭 ( 10:59:42)
对呀，现在就是Protease K处理时间太长了，但为何Qiagen等血提取试剂盒中处理时间却很短而且效果不错呢？
至于抗凝剂，这是分子克隆手册上推荐的，想必也适用于牛血吧？
喵咪 ( 11:00:26)
1、抗凝剂可用ACD
2、快速的粗提取：
1）200ul的全血加入1000ml的蒸馏水中
2）5000转离心2min，重复用蒸馏水洗涤至基本无红色即无红细胞
3）用TE200ul溶解沉淀
4）加1 .5mol/L 150ul
5）加2倍的无水乙醇沉淀
6）凉干，加蒸馏水100ul即可
头发很短 ( 11:01:14)
你可以用上海生工的全血基因组DNA抽提试剂盒，，抽提一次最多四十分钟，价格也不高，用200-500ul全血即可。但需要用ACD抗凝，配方应该是柠檬酸0.48g＋柠檬酸三钠1.32g＋葡萄糖1.47g，再加三蒸水至100ml配成的。每6ml 全血加1ml ACD抗凝。但是一定要注意在抽提过程中，用TE悬浮的要充分，保温时间适当延长至十分钟，效果还是比较好的，而且也不会影响PCR反应。
tieshazhang ( 11:01:52)
请问配制ACD一定要用三蒸水吗？
何去何从 ( 11:02:19)
从没有添加抗凝剂的牛血能否提出DNA？
我觉得很难，因为血液凝固后白细胞都集中在凝血块中了，而凝血块本身又很难破碎。
Biotekepeter ( 10:34:59)
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全血基因组DNA提取试剂盒(溶液型)
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试剂盒组成、储存、稳定性：
& && & 试剂盒组成& && && &保存& && && & 50次& && && && &100次
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& && & 红细胞裂解液& && &室温& && && &50 ml& && && && &100 ml
& && & 细胞核裂解液& && &室温& && && &17 ml& && && && &&&33 ml
& && & 蛋白沉淀液& && && &室温& && && &&&6 ml& && && && &&&11 ml
& && & DNA溶解液& && &&&室温& && && & 10 ml& && && && &&&20 ml
本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。
产品说明：
本试剂盒根据全血特点采用几个简单步骤快速提取基因组DNA。首先红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解白细胞释放出基因组DNA, 然后蛋白沉淀液沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。
试剂盒特点：
◆& &从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方，裂解快速完全。
◆& &不需要蛋白酶K，不需要酚/氯仿抽提。
◆& &快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。
◆& &结果稳定，产量高（典型的产量300μl 全血可提取出5-15μg），DNA纯度达1.7～2.0(OD260/OD280)，长度可达50Kb-200kb，可直接用于PCR，Southern-blot和各种酶切反应。
◆& &百泰克说明书中针对实验过程出现的疑难做出了详细的解答，帮助你解决实验过程中遇到的问题（如标本中含有血凝块、红细胞裂解不完全、DNA产量低、DNA长度小于30kb、未见到蛋白沉淀、A260/A280 &1.6、DNA沉淀难以重新溶解水化、下游酶切切不开等）。
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[异丙醇的作用]酚氯仿法提取DNA的一些试剂的作用
来源：未知 责任编辑：aidai 发表时间: 15:08　点击:次
[异丙醇的作用]酚氯仿法提取DNA的一些试剂的作用所属专栏：异丙醇的作用1.异丙醇和乙醇沉淀质粒的区别：异丙醇和酒精都是有机溶剂，一般来讲，提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀，因为异丙醇沉淀的效果要好一些，但最后大多用酒精沉淀，因为酒精容易挥发，对下游的实验影响小。异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。 有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2倍体积乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。异丙醇：优点为所需容积小且速度快，适用于浓度低，而体积大DNA样品的沉淀。0.54~1.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70％的乙醇漂洗DNA沉淀数次。乙醇：沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品容积的95％乙醇可有效沉淀DNA，对于RNA则需要将乙醇量增加至2.5倍缺点是总体积较大。需在-20放置很长时间，30分钟-1小时。同样需要70%乙醇洗涤。2.一般用的是酚：氯仿：异丙醇为25：24：1（v/v），其中酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去，氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，本身酚：氯仿：异戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白质步骤：质粒用等体积的酚/氯仿/异丙醇抽提一次，重复此步骤，加入两倍体积的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L乙酸钠溶液后混匀，零下20摄氏度沉淀30 min后12000 r/min离心10 min，沉淀用75%乙醇洗涤一次，12000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀自然干燥后溶于20～40微升去离子水中或者0.5 mol/L pH8.0的TE中。3 用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2. 不能完全抑制RNase的活性。氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。为什么用无水乙醇沉淀DNA？ 用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。
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